Abstract
Formål
Rapid fremskritt i forståelsen av kreft biologi har forvandlet narkotika utvikling og dermed fører til godkjenning av målrettet terapi og til utvikling av molekylære tester for å velge pasienter som responderer på behandling.
KRAS
status har dukket opp som en negativ prediktor for klinisk nytte av anti-EGFR antistoffer i tykktarmskreft, og anti-EGFR-antistoffer bruk var begrenset til
KRAS
villtype svulster. For å sikre bred tilgang til tumor molekylær profilering, har den franske National Cancer Institute (Inca) satt opp et nasjonalt nettverk av 28 regionale molekylærgenetikk sentre. Samtidig, et landsdekkende ekstern kvalitetsvurdering for
KRAS
testing (MOKAECM) ble gitt for å analysere reproduserbarhet og kostnader.
Metoder
96 celle linjer DNA og 24 DNA-prøver fra parafin innebygde tumorvev ble sendt til 40 franske laboratorier. Totalt 5448
KRAS
resultatene ble samlet og analysert og en mikro koster studie ble utført på nettsteder for 5 vanlige metoder av et uavhengig team av helseøkonomer.
Resultater
Dette arbeidet ga en baseline bilde av nøyaktighet og pålitelighet av
KRAS
analyse i rutinetestforhold på et landsomfattende nivå. Inter-laboratorium Kappa verdier var 0,8 for
KRAS
resultater til tross for forskjeller deteksjonsmetoder og bruk av in-house teknologier. Spesifisitet var utmerket med bare en falsk positiv i 1128 FFPE- data, og følsomheten var høyere for målrettede teknikker i forhold til Sanger-sekvense baserte metoder som var avhengig av lokal kompetanse. Estimerte reagenvolumer kostnader per pasient varierte fra € 5,5 til € 19,0.
Konklusjon
Inca har satt opp et nettverk av offentlige laboratorier dedikert til molekylære kreftprøver. Våre resultater viste nesten perfekt avtaler i
KRAS
testing ved et landsdekkende nivå til tross for ulike testmetoder som sikrer en kostnadseffektiv lik tilgang til personlig kolorektal kreft behandling
Citation. Blons H, Rouleau E, Charrier N, Chatellier G, Côté JF, Pages JC, et al. (2013) Ytelse og kostnadseffektivitet av
KRAS
Mutation Testing for metastatisk kolorektalcancer i rutinediagnostikk: The MOKAECM Study, en Nationwide Experience. PLoS ONE 8 (7): e68945. doi: 10,1371 /journal.pone.0068945
Redaktør: Anthony W.I. Lo, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 04.03.2013; Godkjent: 04.06.2013; Publisert: 25.07.2013
Copyright: © 2013 Blons et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Den MOKAECM studere: Evaluering de la deteksjon des Mutasjoner de l’onkogen KRAS pour le traitement par les Anticorps anti-EGFR des pasienter porteurs d’un kreft i tykktarm og endetarm Métastatique ble støttet av den franske National Cancer Institute (Inca) prosjektnummer STIC2008 /IC0803 /NI08001. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Hélène Blons, Etienne Rouleau, Natanael Charrier, Gilles Chatellier, Jean-François Côté, Jean-Christophe Pages, Florence de FRAIPONT, Jean-Christophe Boyer, Jean Philippe Merlio, Alain Morel, Marie-Claude Gorisse, Patricia de Cremoux, Karen Leroy, L’Houcine Ouafik, Jean-Louis Merlin, Delphine Le Corre, Pascaline Aucouturier, Frédérique Nowak, Thierry Frebourg, Jean-François Emile og Isabelle Durand-Zaleski erklært at de ikke har noen konkurrerende interesser. Gérard Milano: Erklært være en: konsulent eller rådgivende rolle for «Roche, Merck Serono, GSK» (Direkte støtte til Hélène Blons) Jean-Christophe Sabourin: Erklært å være konsulent eller rådgivende rolle for «Merck Serono» (Direkte støtte til Hélène Blons ) Pierre Laurent-Puig: Erklært å være konsulent eller rådgivende rolle for «Merck Serono; Amgen; Genomisk Health; Sanofi; Myriad Genetics «(Direkte støtte til Hélène Blons). Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Nye terapeutiske tilnærminger som anti-EGFR målrettet terapi og samtidig identifisere molekylære biomarkører til identifisere undergrupper av potensielt responsive svulster hadde skapt et behov for rutinemessig molekylær karakterisering av kreft. I tykktarmskreft, ble demonstrasjonen at pasienter med
KRAS
muterte tumorer ikke dra nytte av anti-EGFR monoklonale antistoffer etablert uavhengig av teknologien som brukes til å identifisere
KRAS
muterte tumorer [1]. Dette resultatet ble raskt etterfulgt av et direktiv til Det europeiske legemiddelkontoret (EMEA) som begrenset bruken av cetuximab (Erbitux®) og panitumumab (Vectibix®) til pasienter med
KRAS
villtype metastatisk kolorektalcancer [2 ]
med mer enn 940.000 nye kolorektal krefttilfeller på verdensbasis hvert år, bruk av anti-EGFR målrettet terapi står overfor viktigste sakene, en økonomisk ett. som betaler for testen eller narkotika og en medisinsk en : som utfører testen? Den franske offentlig helseforsikringsordning besluttet å gi målrettet behandling for kolorektal kreft i tråd med EMEA anbefaling. Parallelt har den franske regjeringen og National Cancer Institute (Inca) satt opp et nasjonalt nettverk av 28 regionale molekylærgenetikk sentre for å gjennomføre rutine molekylær testing for tykk- og endetarmskreft. Mer enn ett laboratorium kan være relatert til en regionalt senter.
Hvert laboratorium utviklet
KRAS
testing i henhold til egen kompetanse og til de lokalt tilgjengelige instrumenter. Antallet tester økt fra 1100 i 2007 til 10 012 i 2008 og 17 246 i 2009. Fra da av antall tester var stabil og dekket den forventede insidensen av metastatisk kolorektalcancer i Frankrike. En grunnleggelsen av € 2.5M ble viet til
KRAS
testing. Denne organisasjonen virket kostnadseffektiv vurderer global gevinst på narkotika kostnader. Det var nødvendig å bevise at
KRAS
testresultatene var reproduserbare mellom molekylære laboratorier. Hvert laboratorium ved hjelp av én eller flere genotyping metode ble evaluert av en ekstern kvalitetskontroll program, multi programmet:
KRAS
Oncogene Mutasjon deteksjon i behandlingen av Metastastic kolorektal kreft ved EGFR antistoffer (MOKAECM). Den MOKAECM Prosjektet ble satt opp som en ekstern kvalitetskontroll og laboratorier var fritt til å velge og utvikle sin egen metode for
KRAS
testing.
Forrige komparative studier evaluert en teknologi [3]
, [4], [5]. Andre forhold forskjellige teknikker med en utprøvd teknologi per side. I begge tilfeller ikke kan evalueres robustheten en teknologi som brukes med ulike nivåer av kompetanse [6] [7]. En nasjonal vurdering av
KRAS
mutasjonstesting knytte faktiske praksis knyttet til kostnadsvurdering har aldri blitt gjort til nå.
Det første målet for MOKAECM prosjektet var å evaluere på en landsomfattende nivå ytelsen av
KRAS
testing for klinisk formål (sensitivitet og reproduserbarhet). Den andre var å estimere og sammenligne kostnader knyttet til hver teknologi. Som denne studien dekker et nasjonalt territorium, inkludert alle de Inca merket molekylære laboratorier kan vi utlede den nasjonale resultatene for
KRAS
testing fra MOKAECM studien.
Materialer og metoder
Study design
Denne studien ble utformet for å evaluere
KRAS
genotyping i 40 franske laboratorier knyttet til en av de 28 molekylær genetikk sentre, ved hjelp av cellelinje og formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) svulst prøver. ADNS var sentralt forberedt på å kontrollere homogenitet og blindt sendt til alle deltakere for
KRAS
testing ved bruk av rutinemessige praksis teknologier. Resultatene ble lastet og lagret i en bestemt database og analysert av en statistiker (GC) fra HEGP sykehus Clinical Research Unit
Cellelinjer
ATCC cellelinjer (H1573: p.G12A; H358. : p.G12C, A427: p.G12D; LS123: p.G12S; SW620: p.G12V; Løvø: p.G13D, SW46: Wild Type) ble spesielt innkjøpt for studien og
KRAS
G12R, ble oppnådd ved retroviral infeksjon av 292FT celler med en vektor som inneholder
KRAS
c.34G . C substitusjon (JCP)
Colorectal Cancer vevsprøver
Tjuefire svulster ble karakterisert og valgt fra pasienter som gjennomgår kirurgisk reseksjon for kolorektal kreft ved Ambroise Paré Hospital, (Boulogne-Billancourt, Frankrike). Den etiske komiteen i Ile de France II godkjent studien og pasienter ble informert og skriftlig samtykke er innhentet i henhold til fransk lov. Studien ble gjennomført i Frankrike. Diagnostisering av tykk- og adenokarsinom ble vurdert av en patolog (JFE) som valgt FFPE- blokker for påfølgende molekylære analyser. DNA-ekstraksjon ble gjort ved Ambroise Paré Hospital bruker Qiamp DNA Mini Kit (Qiagen). Svulstene ble preget for
KRAS
av tre forskjellige laboratorier ved hjelp av tre forskjellige teknologier. Disse laboratoriene ble valgt på grunnlag av deres erfaring med KRAS testing og i huset validering av metoden som brukes. Utvalgte prøver viste ingen avvik.
Vurdering av cellularity
Evalueringen av cellularity ble utført ved Hematoxylin, eosin og safran (HMS) glir i begge ender av FFPE blokk for DNA-ekstraksjon. Slides ble skannet på en Mirax Scan, (Zeiss, Göttingen, Tyskland). For å validere tumor celleinnhold, ble de skannede bildene vurdert av syv uavhengige patologer fra ulike sentre. Når avvik ble lagt merke til, ble lysbilder anmeldt og konsensus ble funnet
metoden som er benyttet
Ulike in-house metoder ble utviklet. Sanger direkte sekvensering (n = 15 laboratorier), allele diskriminering probe systemer [ ,,,0],8], [9] (n = 13), Snap Shot [10] (n = 7), pyrosekvensering [11] (n-5), HRM etterfulgt av sekvensering [12] (n = 5). En laboratorie brukte TheraScreen®: K-RAS Mutation Kit kommersielt sett. Fem laboratorier testet mer enn én metode.
Tretti laboratorier førte hele protokollen for
KRAS
mutasjonsdeteksjon, var det ingen praksis homogenitet bortsett laboratorier bruker
KRAS
TaqMan® sonder (se Informasjon S1). Detaljerte prosedyrer med grunning posisjoner er tilgjengelig på forespørsel.
Statistiske tilnærming og dataanalyse
Feil hastighet ble definert som summen av falske positiver, falske negative, ikke-er ulikt tester og feil mutasjon kall. For å passe til de kriteriene som brukes av den europeiske EQA, ble alle feil ved første anses like viktige selv om implikasjonen for pasienter kan avvike. Alle prøver ble valgt ut til å ha noen forsterkning standard, og hver deltaker levert et resultat som vi betraktet som den endelige rapporten sendes til onkolog. I et annet trinn vurderte vi klinisk relevante feil som å være falske positive og negative resultater med tanke på at i tilfelle av svikt en ny prøve vil bli forespurt selv om dette vil føre til en ytterligere forsinkelse for pasienten.
Suksessrate ble definert som summen av sanne positive og sanne negative.
Vi vurderte både reproduserbarhet (inter- og intra-laboratorium) og diagnose nøyaktighet (sensitivitet og spesifisitet) av de ulike teknikker for
KRAS
genotyping. For hver mutant cellelinje, var det fire forskjellige fortynninger (5%, 20%, 50%, 100%) med tre replikater pr fortynning. Alle data ble tatt hensyn til.
For de seks teknikker, som brukes av minst to laboratorier, inter-laboratoriet reproduserbarhet ble undersøkt ved hjelp av en generalisering av Cohen Kappa statistikken for måling av enighet blant flere priser [13] . Faktisk ble hver av de 96 prøver vurdert ved
m
laboratorier – med
m
som strekker seg fra 2 til 15 i henhold til den teknikk-inn i en av de åtte gjensidig utelukkende kategorier. Da det var feil (manglende evne for teknikken for å gi en mutasjonstatus), beregningen tar hensyn til manglende data. Konfidensintervall for den sanne generalisert Kappa koeffisient ble beregnet ved hjelp av bootstrap resampling metoden, for å ta den intra-klyngen korrelasjon hensyn [14].
For å vurdere intra-laboratorium reproduserbarhet for en gitt
KRAS
genotyping teknikk, beregnet vi et Kappa statistikk for hver enkelt laboratorium, som beskrevet ovenfor, basert på triplikate alikvoter. Deretter samlet vi resultater ved å tilveiebringe en gjennomsnittlig Kappa-koeffisienter, med det utvalg av Kappa-koeffisienter i hele laboratorier.
Diagnostikk nøyaktighet for påvisning av hver spesifikk mutasjon (kategoriske gullstandard) ble undersøkt for hver enkelt teknikk og hvert laboratorium. Materialer som brukes i de to rundene kan betraktes som gull standard materialer (cellelinjer, godkjente kreft DNA). Det var mulig å vurdere en sensitivitet og spesifisitet for hver laboratorie med cellelinje materiale og FFPE-DNA-prøver. For hver teknikk, sensitivitet og spesifisitet for påvisning av mutasjoner (binær gullstandard) ble beregnet ved å kombinere data fra alle laboratorier. Et forhold estimator for variansen til klynge binære data som tar intra-cluster korrelasjoner hensyn ble brukt til å beregne 95% CI [15]. Alle analysene ble utført ved hjelp av SAS programvareversjon 9.1
Økonomisk Assessment
Fem teknologier ble sammenlignet. «Direct-sekvensering», «snapshot», «pyrosekvensering», «High Resolution Smelte» (HRM ) «, TaqMan®». Kostnadene ble anslått fra synspunkt av laboratoriet ved microcosting og tidsstudier. Vi estimerte faste og variable kostnader knyttet til hver av de fem teknologier: arbeidskraft, forbruksvarer (dvs. reagenvolumer og andre forbruksvarer) og utstyr og ekskludert kostnader. Kjøpesummen ble brukt for forsyninger og utstyr med en 5-års lineære avskrivninger og arbeidskraft ble vurdert etter total lønn [16].
Kostnader Sensitivity Analysis
En sensitivitetsanalyse ble ledet til å få en rekke av kostnadene ved å flytte ulike parametere. Parametrene var på priser (5% og ± 10%) og laboratorie rekke lover (Information S1).
Resultater
Analyse av cellelinje Resultater
Ninety-six celle linjer DNA-prøver ble sendt til 40 franske laboratorier, fem laboratorier brukes to ulike screeningmetoder som fører til 4320 rapporterte resultater. Siden 6 laboratorier ikke kan teknisk oppdage p.G12R mutasjon (Informasjon S1), ble p.G12R prøvene ikke tatt hensyn til og 3780 resultatene til slutt ble analysert. Resultatene ble sammenlignet med de forventede genotyper. Den globale feilrate var 10,6% (399/3780), hovedsakelig på grunn av falske negative resultater (89%, 357/399). Blant disse 307 tester tilsvarte en prosentdel av tumorceller av 5%, samtidig som 50 involverte prøver med høyere tumorcelleforhold. De 42 resterende feil var analysefeil (n = 25; 6%), falske positive (n = 2; 0,5%) og feil mutasjon (n = 15; 4%). Sekvense generert alle falske positive resultater og vist en falsk positiv rate på 0,4% (2/540). Feil mutasjon kall ble kjent for sekvensering (0,8%, 11/1260) og snapshot (0,7%, 4/588).
For teknikker som utføres av mer enn 2 laboratorier, følsomhet varierte fra 76% til 96%, og spesifisitet fra 95% til 100% (tabell 1). Når det gjelder 5% tumorprøver, ble den laveste følsomhet funnet for sekvensering og HRM med en samlet oppklaringsprosenten på ca 40% sammenlignet med 89,7% funnet for pyrosekvensering. En teknisk feilrate på 1,6% ble observert for TaqMan prober på grunn av en ikke-tolkning ved 3 laboratorier i tre paralleller som svarer til p.G12V (SW480 100%) homozygote prøver. Intra-laboratorium og inter-laboratorium reproduserbarhet var i nesten perfekt avtaler ( 0,8 for alle metoder)., Og ikke være avhengig av mutasjonstype (tabell 2)
Analyse av tumorprøve resultater
Når det gjelder FFPE- vev, ble 1128 data generert og analysert fra 24 individuelle tumorprøver (n = 47 metoder, 40 forskjellige laboratorier). Den globale feilrate var 1,8% (20/1128) med 1 falske positive, 7 falske negative, 9 analytiske feil og 3 feil mutasjon kall. Individuelle tumorprøver riktige samtaler varierte fra 100% til 76,6%, faktisk alle laboratorier genotypede 16/24 prøver og en prøve (en
KRAS
p.G12A prøve) riktig generert feil med 11 laboratorier. De 6 villtype prøver ble fullstendig genotype bortsett fra i ett tilfelle var en falsk positiv ble rapportert av allelisk diskriminering qPCR basert metode med en PNA-blokkering. Trettito av 47 resultatsett (laboratoriet /metoden) generert 0 feil (68%), 13 gjorde en (28%), 2 laget to og en laget 3 (tabell 3). De tre feilene var 3 analytiske feil ved hjelp av en pyrosekvensering analyse. Dette laboratoriet også brukes direkte sekvensering med en falskt negativt resultat. Hvis klinisk relevante endringer (falskt positive og negative), og hvis beste resultatene vurderes når mer enn én metode ble testet, 82,5% av laboratoriene gjorde ingen feil, og suksessraten varierte fra 100 til 91,6. De gjenværende feil var 6 falsk negativ og en falsk positiv i 7 laboratorier. (Tabell S1).
Kostnader per stk
Microcosting ble undersøkt i området (n = 10 laboratorier) av et uavhengig team av helseøkonomer. Kostnadene er gitt per stk per test og totalt per test (tabell 4). Første lønnskostnader varierte fra € 3,7 (TaqMan) til € 11,4 (Stillbilde) per test på grunn av ulike behandlingsvarigheter per prøve fra 7,2 (TaqMan) til 22,1 minutter (Stillbilde). Små forskjeller mellom laboratorier bruker samme teknologi ble observert på grunn av liten variasjon i protokoller og til forskjellig utstyr som påvirker effektivitet og arbeidskostnader. Videre antall prøver kjøres per batch induserer også arbeidskraftkostnader variasjon. For det andre, utstyrskostnader per test varierte fra € 1,0 til € 9,7 avhengig av laboratorier og teknologier. Direkte sekvensering var den dyreste teknologi med mer enn € 7 per test. Pyrosekvensering, HRM og TaqMan var den minst kostbare teknologier med mindre enn € 2 per test. Sequencer, Pyrosequencer og qPCR termo genererte 84% av utstyrskostnader. Maskin kostnader per test variert i henhold til varigheten av løyper, innkjøpspriser og maksimalt antall prøver per batch.
Tredje, forbruksvarer premier per test varierte fra € 5,6 til € 19,0. Antall gjentak, type reagenser som brukes, tekniske prosesser og prisforhandlinger forklarte mesteparten av forskjellene observert fra laboratorier som bruker den samme teknologien. Disse forskjellene var spesielt viktig for snapshot teknikk. En Snapshot laboratorie replikeres eksperimenter og brukte dyrere reagenser, noe som fører til tre ganger høyere forbrukskostnader sammenlignet med andre laboratoriet studeres.
Totale kostnader
Totale kostnader per test varierte fra € 10,6 til € 34,8 ( tabell 4). Videre totale kostnaden for HRM trenger å ta hensyn sekvense kostnader. Om to tredeler av prøver ble oppdaget som villtype KRAS gener ved HRM og ikke krever sekvensering. Vi observerte en økning av post «HRM» sekvense koster fra € 7 til € 13 i forhold til direkte sekvense kostnader til tross for lignende teknologier. Derfor den globale totale kostnaden per HRM testen varierte fra € 27,0 til € 28,0.
Kostnader Sensitivity Analysis
Følsomhetsanalyse bekreftet at TaqMan var billigere enn andre teknologier (figur 1). De estimerte kostnadene for TaqMan var optimal i base case. Innenfor verre forhold (fem prøver per batch og 10% priser markup) TAQMAN priser per test varierte fra € 15,7 til € 20,1. Pyrosekvensering kostnader per test var lavere enn 20,1 € dersom minst 15 prøver per batch ble kjørt.
Bleu diamanter sjeldne basen saksomkostninger.
Diskusjoner
Bruk av anti-EGFR monoklonale antistoffer er begrenset til 60 til 70% KRAS villtype metastatisk kolorektal tumorer, slik at riktig identifikasjon av KRAS-mutasjoner et sentralt punkt for klinisk praksis [17], [18]. Videre begrenser bruken av EGFR-inhibitorer for å pasienter med villtype KRAS kan være en mulig løsning for kostnadsbesparelser [19]. For å sikre testing tilgjengelighet, har Inca innvilget 28 regionale molekylærgenetikk sentre opptil 2,5 M € [20]. Målet med lands kvalitetskontroll nettverk kalt MOKAECM, støttet av Inca, var å vurdere de ulike egenutviklede metoder ved molekylære laboratorier for KRAS testing i rutineforhold. Her ble lignende cellelinjer (4296) og FFPE- tumorprøver ADNS (1152) sendt til de forskjellige deltakerne og 5448 KRAS genotyping resultatene ble presentert og analysert. Når det gjelder cellelinjer testen, feilraten var 10,6%, deteksjon cutoff varierte fra 5 til 20% og 86% av falsk negativ var relatert til 5% fortynning. 1152 FFPE- prøveresultatene ble analysert i denne studien, 68% av testsett (metode /laboratorier) korrekt identifisert KRAS mutasjonsstatus i alle FFPE-prøver. Dette resultatet er sammenlignbart med resultatet rapportert i European KRAS EAQ ordningen (70%) [21]. Nylig, for KRAS mutasjon analyse i tykktarmskreft, vilkårlige terskler for riktig
KRAS
mutasjon identifikasjon ble satt til 97% [22]. Vurderer beste resultatene for laboratorium testing mer enn én metode, gjennomsnittlig suksessrate for FFPE- prøvene var 98,5 og varierte 100 til 91,6% (Informasjon S1). Disse poengsummene er i samsvar med resultatene av en studie kjørte i 10 laboratorier i Nederland [23]. Videre, unnlatelse av å oppnå en samlet testing hendelse score på minst 80% ble definert utilfredsstillende når du tester et større antall tilfeller i «Clinical Laboratory Improvement Act» av 1988. Hensyntatt resultatene fra de to testsett 96% av franske laboratorier hadde et tilfredsstillende resultat over 80% som tydelig viser kvaliteten av den KRAS testing i Frankrike tross for det store panel metoder. Videre blant de 1152 svulster testet, ble bare 20 feil rapportert. Dette nivået av feilen er tilfredsstillende.
Fra et nasjonalt perspektiv på 1152 kreftprøver i denne studien, 20 feil (0,017 CI95% [0,01 til 0,027]) ble rapportert med 11 av dem knyttet til en enkelt prøve . Derfor den korrigerte feilrate var 0,7% CI95% [0,03% -0,13%] per test og per svulst. En ekstrapolering tyder på at i Frankrike, av de 18.000 svulster analysert hvert år, 54 til 234 svulster kan misgenotyped.
genotyping feil kan skyldes ulike forhold som type fiksativ, bevaring prosedyre, evaluering av tumor-celleinnhold og til slutt forestillinger av hvilken metode som brukes for testing. Her DNA-ekstraksjon var sentralisert og tumor celleinnhold ble validert av 7 uavhengige patologer derfor bare
KRAS
genotyping metoder ble sammenlignet. Alle utvalgte prøver hadde en første validering av deres KRAS status utført av tre referanselaboratorier ved hjelp av tre forskjellige metoder. Mange forskjellige teknikker, inkludert kommersielt tilgjengelige kits, har blitt utviklet og testet, men fraværet av en anerkjent referansemetode gjør vurderingen av nye teknologier en vanskelig oppgave.
Cell line testing viser ikke nødvendigvis den rutinemessige praksis, men ble brukt som en validering test i optimale forhold å sammenligne sensitivitet og spesifisitet mellom de ulike teknologiene. For prøver med tumorcellelinje innhold over 20%, som kan betraktes som klinisk relevant, Analyseresultatene viste nesten perfekte avtaler. For prøvene under 20%, var resultatene mer heterogene, spesielt for direkte sekvensering. I vår erfaring, gjorde HRM prescreening ikke redde lave svulst innhold prøver. Den lavere følsomhet for sekvenseringsmetoder i forhold til andre var ikke en overraskelse [24], [25], [26], men våre resultater også påpeke at ytelsen kan avhenge av metoden optimalisering og kompetanse. Faktisk 7 laboratorier bruker sekvensering eller HRM-sekvense hadde en lav feil score ( 10%) i cellelinje-serien, inkludert 5% cellelinje prøver og ingen feil i svulsten serien. Følsomhet synes relatert til et par – metodikk /laboratorie-erfaring – snarere enn strengt til en metode, derfor validering og deteksjon cutoff må vurderes i hvert laboratorium. Når lav følsomhet metoder brukes for genotyping, må macrodissection cutoff være tilstrekkelig valgt og klare preanalytic anbefalinger må gis til patologer før DNA-ekstraksjon. Uavhengig av påvisningsmetoden, kunne mutasjon typen påvirke følsomhet. Frekvensen av feilene var rundt 3% med p.G12V til mer enn 20% med p.G12S og p.G12A. Allelisk kvantifisering av 7 cellelinje DNA-er ved hjelp av pyrosekvensering ga ikke noen relevant forklaring av den reduserte følsomhet observert for noen mutasjoner, og termodynamiske konsekvenser i DNA smelte oppførsel kan delvis forklare denne observasjon. I FFPE serie feilraten var 20/1128 (1,7%) versus 399/3780 (10,6%) i cellelinjer, for hvilke feil var hovedsakelig knyttet til 5% tumorcelle falske negative. Den feilrate var 2,6% for cellelinjer i lignende svulst innholds forhold (falsk negativ på grunn av 5% prøvene unntatt) som tyder på at vev fiksering ikke var til hinder for
KRAS
testing. Men fiksering kan til en viss innvirkning på feilnivåer: 0,8% (9/1128) på FFPE- prøver versus 0,6% på cellelinje DNA (25/3780). Bruk av metoder basert på amplifikasjon av små amplikonene kan være en mulighet for å redusere nivået av ikke-er ulikt resultater [27]. I denne studien metoder basert på allel diskriminering basert på små fragmenter forsterkning og sanntids PCR viste ingen feil mot opptil 4% for direkte sekvenseringsmetoder. Til slutt, i FFPE-serien, ble 14% av feilene finnes i en enkelt prøve for hvilken tumorcelle-innholdet var 50% etter HES undersøkelse men kvantifisering av muterte alleler ved pyrosekvensering antydet at mutante celler kan bare utgjør 20% av det hele tatt. Denne kanskje delvis forklare avvik observert for denne prøven, men antyder også at genetiske variasjoner ikke er like oppdages. En FFPE falsk positiv prøve ble identifisert av allel spesifikk forsterkning med en PNA blocker. Det ble ikke godkjent av et annet laboratorium ved hjelp av lignende teknologi, og ble derfor ansett som en falsk positiv. Videre den kliniske verdien av mutert sub-klone gjenstår å bli demonstrert [28], [29], [30], [31], [32].
kostnadsberegninger Begrensninger
Denne metodikken for vurdering av kostnadene var enkelt hånd siden den samme uavhengig team vurderes all teknologien direkte i laboratoriene. Fem teknologier ble studert av microcosting i ti laboratorier som representerer en tredjedel av alle franske «plattformer», som gjennomførte 25% av alle
KRAS
mutasjoner tester for metastatisk kolorektal pasienter i Frankrike i 2009. Selv om nivået av bevis kan være suboptimal, som det var basert på 2 observasjoner per teknologi, allel diskriminering ved hjelp av TaqMan prober var om to eller tre ganger billigere enn noen annen teknologi studert. Kostnad variasjon innenfor en teknologi eller mellom teknologier kan skyldes ulike prosedyrer. Faktisk metoder var ikke strengt identiske, selv i laboratorier ved å bruke lignende teknologi, og forskjellige grader av optimaliseringen ble rapportert. Et eksempel var håndteringen av testprosedyre – antallet av positive og negative kontroller, antallet replikater og antallet av tilsatte trinnene til fremgangsmåten som gel migrering av PCR-produktene. Disse ekstra kostnadene ble verdsatt. Når det gjelder kostnadene utstyr en metning hypotesen ble satt til en kurs på åtte timer per arbeidsdag i løpet av fem år. Dette kan ikke være den virkelige situasjonen for enkelte laboratorier og estimerte kostnader undervurdert sanne kostnadene til laboratorier. Videre, ifølge metning hypotesen om utstyr, antas det at forventet levealder for maskiner var lik for alle slags maskin, ingen informasjon var tilgjengelig på den virkelige levealder for maskiner. Til sammen microcosting data antydet at «in-house» teknologi kostnadene var mye lavere enn kommersielle kits, unntatt utstyr og arbeidskostnader.
Konklusjon
Den franske befolkningen var 65.027.000 innbyggere i 2011. Twenty- åtte regionale molekylærgenetikk sentre som dekker alle de territorier og koordinerende 46 laboratorier er nå involvert i analysen i 16000
KRAS
testing for metastatisk kolorektal kreft hvert år. Hele nettverket er nasjonalt styrt av Inca. Dette kvalitetskontroll programmet var den første lands erfaring med 120 tilsvarende prøver blir analysert av 40 ulike laboratorier. Våre resultater viser at dersom det er klinisk relevante resultatene regnes 82,5% av laboratorier korrekt identifisert
KRAS
mutasjonsstatus i alle FFPE-prøver. Dette arbeidet antyder også at mens alle metoder er egnet for
KRAS
testing med en gjennomsnittlig pris på € 35 per test utelukke preanalytiske trinnene, forskjeller når det gjelder følsomhet og robusthet. Valg av metode vil trolig avhenge av utstyr og teknisk ekspertise tilgjengelig lokalt. Denne kvalitetsprogram gitt en baseline bilde av
KRAS
testing i Frankrike. Den viste at det er mulig til en redusert pris for å stille et landsomfattende program, det identifisert feil i testprosedyrer for enkelte laboratorier understreke viktigheten av optimalisering, in-house validering og kvalitetskontroll prosesser ved hjelp av et stort panel av mutasjoner.
Hjelpemiddel Informasjon
Informasjon S1.
Detaljer om materialet og metodene
doi:. 10,1371 /journal.pone.0068945.s001 plakater (DOC)
Tabell S1.
Viser detaljerte genotyper informasjon for FFPE-prøver ved laboratoriet (N = 40). Den beste
KRAS
resultater ble holdt for laboratoriet ved hjelp av mer enn én teknologi
Doi:. 10.1371 /journal.pone.0068945.s002 plakater (XLSX)
Takk
Vi takker French National Cancer Institute og STIC 2008, Audrey DIDELOT, Claire Mulot, Karine Pallier for deres økonomiske og teknisk støtte. Vi takker patologene som evaluerte 24 HMS lysbilder for tumorcelle prosent evaluering Frédéric Bibeau (Centre Val d’Aurelle, Montpellier), Pascale Cervera (Hôpital St-Antoine, Paris), Françoise Piard (CHU de Dijon), Jean-Christophe Sabourin (CHU de Rouen), Jannick Selves (Hôpital Purpan, Toulouse) og Frédérique Penault-Llorca (Centre Jean Perrin, Clermont-Ferrand)
medlemmene av MOKAECM samarbeidsgruppen er:. Marie-Pierre Gaub; Isabelle Soubeyran; Hugues Begueret; Frédérique Penault-Llorca; Agnès Hardouin; Françoise Piard; Jean Mosser; Cédric Le Marechal; Chantal Delvincourt; Christine Clavel; Christophe Ferrand; Olivier Schischmanoff; Nathalie Theou-Anton; Antoinette Lemoine-Corbel; Lascols Olivier; Hugues De The;
