Abstract
Bukspyttkjertel ductal adenokarsinom er den fjerde største årsaken til kreftdød på verdensbasis, med ingen tilfredsstillende behandling til dato. I denne studien ble det undersøkt hvorvidt den kombinerte inhibering av cyklooksygenase-2 (COX-2) og klasse I histon-deacetylase (HDAC) kan resulterer i en bedre kontroll med pankreatisk duktus adenokarsinom. Virkningen av samtidig HDAC og COX-2-hemming på cellevekst, apoptose og cellesyklus ble undersøkt første
in vitro
på menneskelige bukspyttkjertelen BxPC-3, PANC-en eller CFPAC-1 celler behandlet med kjemiske hemmere ( Saha, MS-275 og celecoxib) eller HDAC1 /2/3/7 siRNA. For å teste potensialet antitumor aktivitet av denne kombinasjonen
in vivo
, vi har utviklet og preget, en raffinert chick chorioallantoic membran tumormodell som histologisk og proteomically etterligner menneskelige bukspyttkjertel ductal adenokarsinom. Kombinasjonen av HDAC1 /3 og COX-2 hemming betydelig svekket spredning av BxPC-3 celler
in vitro Hotell og stoppet helt den BxPC-3 celler tumorvekst på chorioallantoic membranen
in vivo
. Kombinasjonen var mer effektiv enn både medikament benyttet alene. Konsekvent, viste vi at både HDAC1 og HDAC3 hemming indusert ekspresjon av COX-2 via NF-kB veien. Våre data viser, for første gang i en bukspyttkjertelen Ductal adenokarsinom (PDAC) modell, en betydelig virkning av HDAC og COX-2-hemmere på kreftcellevekst, som setter grunnlaget for utvikling av potensielt effektive nye kombinatoriske behandlinger for bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom pasienter
Citation:. Peulen O, Gonzalez A, Peixoto P, Turtoi A, Mottet D, Delvenne P, et al. (2013) The Anti-tumor effekt av HDAC Hemming i en menneskelig Pancreas Cancer modellen er betydelig forbedret ved samtidig hemmer utskillelsen av Syklooksygenase 2. PLoS ONE 8 (9): e75102. doi: 10,1371 /journal.pone.0075102
Redaktør: Guenter Schneider, Technische Universität München, Tyskland
mottatt: 7 mai 2013; Akseptert: 12. august 2013, Publisert: 11.09.2013
Copyright: © 2013 Peulen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Belgia Fond for Scientific Research (https://www.frs-fnrs.be) og Télévie; Senter Anti-Cancéreux près de l’Université de Liège (https://www.cac.ulg.ac.be). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. A. Gonzalez er en Télévie fyr. A. Turtoi og D. Mottet er henholdsvis postdoktor og stipendiat ved Belgia Fond for Scientific Research
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) lister blant de mest dødelige formen for kreft [1]. Tidlig stadium av sykdommen er klinisk taus og diagnostisering av sykdommen er for det meste foretatt på et avansert stadium. Dette sen diagnose bidrar til en av de laveste 5 års overlevelse (bare 3%) [2]. Dag PDAC blir behandlet ved kirurgi og /eller adjuvant behandling med gemcitabin, øker bare litt median overlevelse av pasientene. Det er derfor et stort behov for å utvikle nye effektive behandlinger for PDAC pasienter.
Det er rikelig dokumentasjon som viser at deregulering av histone acetylering bidrar til bukspyttkjertelen kreft utvikling og progresjon [3]. Histone deacetylases (HDAC) representerer en familie av enzymer som regulerer ordnede cellulære aktiviteter som epigenetisk stanse av tumorsuppressorgener og modulering av protein funksjoner. Vi og andre har vist at HDAC inhibering utviser både anti-kreft og anti-angiogenese-aktivitet [4] – [6]. HDAC ekspresjon endres i PDAC, inkludert HDAC1, HDAC2, HDAC3 og HDAC7 [7] – [10]. Prekliniske studier har antydet at HDAC inhibering holde betydelig potensial for utvikling av nye anticancer terapi [11]. Følgelig har flere HDAC hemmere nylig blitt godkjent av Food and Drug Administration for behandling av kutant T-cellelymfom mens nye molekyler er for tiden i kliniske fase III-studier. Imidlertid, når de anvendes i monoterapi, HDAC-inhibitorer viste begrenset effektivitet i forskjellige faste maligniteter, inkludert PDAC [3], [12], [13]. Faktisk LAQ824 eller MS-275 har blitt evaluert i fase I kliniske studier med solide kreftformer, inkludert PDAC, uten objektiv klinisk respons [14], [15]. Alternativt har HDAC hemmere blitt brukt i kombinasjon terapi strategier [16], [17], med noen kombinasjoner generere lovende effekter for mennesker PDAC
in vitro product: [18] – [21] eller i eksperimentelle tumorer [22] . Dessverre har disse resultatene ikke oversette i kliniske studier [23], [24].
Den manglende effekt av HDAC hemmere i kreft i bukspyttkjertelen kan være knyttet til de pleiotrope aktiviteter HDACs i cellebiologi [25], [26] som fører til uønskede pro-kreft effekt. For eksempel, en nyere studie viste at pan-HDAC-inhibitorer indusere cyklooksygenase-2 (COX-2) ekspresjon i lungekreftceller, noe som fører til en stimulering av endotel-celle proliferasjon [27]. Siden COX-2 er også forbundet til kreft i bukspyttkjertelen celleproliferasjon [28] eller tumorvekst [29] – [31], hypotese vi at COX-2 overekspresjon kan også induseres i PDAC ved behandling med HDAC-inhibitorer, noe som fører til redusert effektivitet og dermed terapisvikt.
for å teste den biologiske betydningen av å kombinere klasse i HDAC og COX-2-hemmere
in vivo
, vi utviklet et raffinert PDAC chick chorioallantoic membran (CAM) modell basert på vår tidligere arbeid [32]. CAM-modellen har blitt brukt med flere cellelinjer for å produsere tumorer [33], [34]. I likhet med den murine modellen, er de fleste trinn av tumorprogresjon rekapitulert i en meget kort tidsperiode [35]. Tidligere BxPC-3 kreft i bukspyttkjertelen celler ble allerede vist å produsere vaskulariserte 100 mikrometer lange kreft noder på CAM [32]. Men den lille størrelsen av de noduler representerte en betydelig begrensning for strukturell observasjon, nøyaktig volum evaluering og studier av legemidlets effekt. Her har vi etablert og implementert et raffinert BxPC-3 PDAC modell med en dramatisk økning (64 ganger) i tumorstørrelse og vise strukturelle arkitektur og protein uttrykk etterligne menneskelig PDAC. Denne modellen ble klarer å utnytte for å demonstrere at kombinasjonen av klasse I HDAC og COX-2-hemmere resultere i en komplett tumorvekstinhibitering.
Materialer og metoder
Cells og kjemikalier
BxPC-3 (ATCC CRL-1687), PANC-1 (ATCC CRL-1469) og CFPAC-1 (ATCC CRL-1918) er menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer som stammer fra henholdsvis PDAC [36], bukspyttkjertelen duct epithelioid kreft [37 ] og PDAC levermetastaser [38]. BxPC-3 var en generøs gave fra professor Bikfalvi (Inserm u1029, Bordeaux, Frankrike), Panc-1 ble en generøs gave fra Prof. Muller og Burtea (NMR Laboratory, University of Mons, Belgia). CFPAC-en ble kjøpt fra ATCC. Celecoxib ble innhentet fra University Pharmacy (Kemprotec Ltd, Middlesbrough, UK). MS-275 og Saha ble kjøpt fra Enzo biovitenskap (Antwerpen, Belgia). Andre kjemikalier ble innkjøpt fra Sigma (Bornem, Belgia).
Cellekultur
BxPC-3 human bukspyttkjertelkreft cellelinjen ble opprettholdt i RPMI 1640-medium supplert med glukose (2,5 g /l), natrium pyruvat (1 mM) og FBS (10%). PANC-1 ble opprettholdt i DMEM supplert med FBS (10%). CFPAC-1 ble opprettholdt i Iscoves modifiserte Dulbeccos medium med FBS (10%). Celler ble behandlet med MS-275, celecoxib eller en kombinasjon av begge deler, så vel som med suberoylanilide hydroksamsyre (Saha) oppløst i medium med 0,1% DMSO.
Lie interfererende RNA-transfeksjon
HDAC-spesifikk small interfering RNA (siRNA) ble syntetisert ved Eurogentec (Seraing, Belgia). NF-kB p65 SMARTpool siRNA ble kjøpt fra Thermo Fisher-Dharmacon (Whaltham, MA). Lipofectamine-mediert transfections ble utført ved en siRNA konsentrasjon på 40 nM følge produsentens anbefalinger (Life Technologies, Carlsbad, NM). GL3 var en irrelevant siRNA rettet mot luciferase. siRNA sekvenser ble publisert tidligere [5].
Cell vekst
Like tettheter av cellene ble sådd i fullstendig medium og ble høstet ved de angitte tidspunkter. Celle tallene ble indirekte bestemmes ved hjelp av Hoechst innlemmelse. Resultatene ble uttrykt som DNA-innhold.
Western-blotting
BxPC-3-celler eller frosne tumorer ble avbrutt i lyseringsbuffer (1% SDS, 40 mM Tris-HCl pH 7,5) i nærvær av protease og fosfatase-hemmere. Proteiner ble separert ved hjelp av SDS-PAGE (6-12,5%) og deretter electrotransfered på nitrocellulosemembraner. Etter primære antistoffer ble brukt: anti-COX-2 (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI), anti-HDAC1 (Cell Signal, Danvers, MA), anti-HDAC2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-HDAC3 (Cell Signal, Danvers, MA), anti-acetylert-Histone-3 (Millipore, Billerica, MA), anti-HDAC7 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-fosfor-IkBα (Cell Signal, Danvers, MA ), anti-p65 (Cell signalering, Danvers, MA), anti-p21 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-p27 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ), anti-pRB (BD Biosciences, Franklin Lakes , NJ), anti-E2F1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-MEK2 (Cell signalering, Danvers, MA), anti-ORC2 (Cell signalering, Danvers, MA), anti-caspase-3 (Cell signale~~POS=TRUNC , Danvers, MA) og anti-HSC70 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California). Immundeteksjon ble utført ved anvendelse av passende sekundært antistoff konjugert med pepperrot-peroksydase.
Kvantitativ sanntids RT-PCR
Total RNA ekstraksjon og kvantitativ sanntids RT-PCR ble utført som tidligere beskrevet [39] . Menneskelig COX-2 uttrykk ble oppdaget ved hjelp av en kommersiell RT-qPCR TaqMan analysen (Hs00153133-m1, Applied Biosystems, Carlsbad, NM). Human-IL-8-ekspresjon ble påvist ved anvendelse av spesifikke forover (5′-GAAGGAACCATCTCACTGTGTGTAA-3 «) og bakover (5′-ATCAGGAAGGCTGCCAAGAG-3») primere syntetisert av Eurogentec (Seraing, Belgia).
Annexin V /propidium jodid farging
apoptotiske celler ble bestemt ved annexin V-FITC og ikke-vitale fargestoff propidiumjodid (PI) farging med et FITC-Annexin V apoptose deteksjon kit i (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) ifølge produsentens instruksjoner. Flowcytometri ble utført på en FACSCalibur II ™ og prøvene ble analysert ved hjelp av Cellquest ™ programvare (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ).
Cell syklus analyse
Den relative andel av celler i hvert trinn av cellesyklusen ble analysert som tidligere beskrevet [33] ved flowcytometrisk analyse med FACSCalibur II ™ og ModFit LT ™.
Tumorvekst vekst~~POS=HEADCOMP på CAM
Befruktede egg kylling ble åpnet som beskrevet tidligere [32]. Ved post-befruktning dag 11, ble CAM overflaten forsiktig skrapet med en nål og 3,5 x 10
6 BxPC-3, PANC-1 eller CFPAC-1 celler i suspensjon med 50% matrigel i et endelig volum på 100 ul ble podet på CAM omsluttet av en 6 mm plastring. Implantasjonen dag ble ansett som dag 0 for tumorutvikling. Narkotika (celekoksib 8 mikrometer og /eller MS-275 0,2 mikrometer i en 30 mL endelig volum) ble brukt daglig direkte på svulsten starter på dag 2. På dag 7 ble svulstene skåret ut fra CAM og digitale bilder ble tatt med et stereomikroskop . Tumor volum ble beregnet ved hjelp av en ellipsoide formel: Volum = (4 × πxZ
1 × Z
2 × Z
3) /3 hvor Z
1-3 er hoved radius av svulsten.
Etikk uttalelse
Alle dyreforsøk ble godkjent av Animal Welfare Committee ved Universitetet i Liège (godkjenning # 1278).
Histologi prosedyre
BxPC -3 tumorer ble vasket i PBS og deretter fiksert i 4% paraformaldehyd i 30 minutter ved 4 ° C. Svulstene ble dyppet i parafin og 5 mikrometer seksjoner ble beiset med Hematoxylin-eosin eller Masson er Trichrome.
Immunoperoxydase og amylase-periodisk syre Schiff (PAS) farging ble utført på henholdsvis 5 mikrometer seksjoner, med referanse XT IHC /ISH automatisert Stainer og NexES Special Stains (Ventana Medical Systems Inc, Tucson, AZ) i henhold til produsentens instruksjoner. Følgende antistoffer ble brukt: anti-cytokeratin 7 (CK7 – Dako, Glostrup, Danmark), anti-cytokeratin 19 (CK19 – Roche Diagnostics, Vilvoorde, Belgia), anti-cytokeratin 20 (CK20 – Dako, Glostrup, Danmark), anti- CD56 (Novocastra, Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove, IL), anti-carcinoembryonic antigen (CEA – Roche Diagnostics, Vilvoorde, Belgia), anti-Ki67 (Dako, Glostrup, Danmark), anti-latent transformerende vekstfaktor-beta bindende protein 2 (LTBP2 – Santa Cruz Biotchnology, Santa Cruz, CA), anti-transformerende vekstfaktor beta-indusert (TGFBI – Cell Signal, Danvers, MA), anti-myoferlin (Sigma, Bornem, Belgia) og anti-desmin (Dako, Glostrup, Danmark) ble benyttet for den primære reaksjonen.
Ki67-kvantifisering ble utført på tilfeldig tatt bilder (3-bilder fra hver tumor, 3 tumorer i hver forsøksgruppe). Etter kanal splitting, ble blå kanal bildene binærisert henhold til lysstyrken. Størrelsen av det areal som opptas av alle celler eller ved Ki67-positive celler ble målt under anvendelse ImageJ 1.46r programvare.
For å visualisere tumorvaskulatur, tykk rehydratiserte vevssnitt (35 um) ble inkubert i 30 minutter i mørket med 0,05% Triton X-100 i PBS inneholdende 5 pg /mL
Sambucus nigra agglutinin
(SNA, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Snittene ble vasket med 0,05% Triton X-100 i PBS og visualisert med konfokalt mikroskop (Leica SP2). Tredimensjonale bilder ble rekonstruert med Imaris programvare (bitplan Scientific Software, Zürich, Sveits).
Statistisk analyse
Alle resultater ble rapportert som betyr med standardavvik. Statistisk analyse ble utført ved anvendelse av en-veis eller to-veis ANOVA, avhengig av antall faktorer gruppering. Gruppe midler ble sammenlignet med en Bonferroni post-test. P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle forsøkene ble utført som 3 uavhengige biologiske replikater.
Resultater
Klasse I HDAC hemming redusert bukspyttkjertelen kreft celle vekst in vitro
BxPC-3 celler har blitt beskrevet til å uttrykke endret nivåer av klasse i HDAC1, HDAC3 og klasse II HDAC7 [40], [41]. For å vurdere rollen til disse HDAC i BxPC-3-celler, ser vi først undersøkt deres tidsavhengig og konsentrasjonsavhengig vekst i nærvær av Saha, et klasse I /II-inhibitor (figur 1A). Våre resultater bekrefter at BxPC-3 celler var følsomme for Saha, med en vekstreduksjon 50% (P 0,001) observert på 5 mikrometer. Neste, vi selektivt forstummet HDAC1, -3 eller -7 bruker siRNA å undersøke enkelte involvering av disse HDAC i Saha-indusert vekstreduksjon. HDAC7 stanse ikke påvirke cellevekst (figur 1B). Imidlertid HDAC1 og HDAC3 lyddemping betydelig BxPC-3 cellevekst redusert med henholdsvis 50% (P 0,001) og 20% (P 0,001) (figur 1C). For å evaluere denne nedgang i cellevekst med klinisk kompatibel medikament, vurderte vi tidsavhengige og konsentrasjonsavhengig vekst av BxPC-3-celler i nærvær av MS-275 (HDAC1 og HDAC3 inhibitor). MS-275 (1 uM) redusert BxPC-3 cellevekst med 50% (P 0,001), mens 5 uM opphevet fullstendig veksten (P 0,001). (Fig 1 D)
(A) Tid -avhengige og doseavhengige effekter av Saha på celleproliferasjon. (B) Tidsavhengig effekt av klasse IIa HDAC7 stanse på celleproliferasjon. HDAC7 uttrykket ble oppdaget av western-blot 48t etter siRNA transfeksjon. HSC70 ble anvendt som en kontroll lasting. (C) Tidsavhengig effekt av klasse I HDAC1 eller -3 stanse på celleproliferasjon .. HDAC1 og HDAC3 uttrykk ble oppdaget av western-blot 48t etter siRNA transfeksjon. HSC70 ble anvendt som en kontroll lasting. (D) Tidsavhengig og doseavhengige effekter av MS-275 på celleproliferasjon *** P .001 versus DMSO eller GL3 forhold. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD, n≥3 i hver tilstand.
Klasse I HDAC hemming indusert COX-2 uttrykk in vitro
Den begrensede effektivitet av HDAC hemmere i kliniske studier herunder PDAC pasienter kan bli forklart, i det minste delvis, av den potensielle oppregulering av ekspresjon av COX-2 i bukspyttkjertelen ondartede celler. For å vurdere denne hypotesen, må vi først analysert COX-2 uttrykk i BxPC-3 celler forstummet for HDAC1, HDAC2, HDAC3 eller behandlet med MS-275. HDAC1 eller HDAC3 undertrykkelse indusert henholdsvis en 6,3-fold og en 4,8 ganger økning av COX-2 uttrykk ved proteinnivå (figur 2A) mens HDAC2 lyddemping redusert COX-2 uttrykk (figur 2B). HDAC1 stanse indusert en HDAC2 overekspresjon.
(A) Western-blot påvisning av COX-2 og HDAC på 20 mikrogram BxPC-3 proteiner 48t etter HDAC1 eller HDAC3 siRNA transfeksjon. (B) Western-blot påvisning av COX-2 og HDAC på 20 mikrogram BxPC-3 proteiner 48t etter HDAC2 siRNA transfeksjon. (C) doseavhengig effekt av 48t MS-275 behandling på COX-2 uttrykk. Acetylert histon-H3 ble anvendt som en kontroll av behandlingseffekten. HSC70 ble anvendt som en kontroll lasting. (D) Tidsavhengig relative ekspresjon av COX-2-mRNA i BxPC-3-celler behandlet med 1 mM MS-275. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik, n = 3.
Behandling av BxPC-3-celler med MS-275 viste lignende virkning på COX-2-akkumulering på en konsentrasjons avhenge måte (figur 2C). For å bestemme hvorvidt COX-2-induksjon skjer på transkripsjonsnivået, analyserte vi COX-2-mRNA-nivå ved RT-qPCR etter 6, 12 og 24 av MS-275 behandling. Vi fant ut at COX-2 genuttrykk ble oppregulert etter MS-275 behandling i en tidsavhengig måte (figur 2D).
For å studere mekanismer som klasse I HDAC hemming induserer COX-2, vi utforsket den kjente koblingen mellom NF-kB og HDAC1 /3 [42], [43] og undersøkt muligheten for at MS-275-indusert COX-2-ekspresjon kan være NF-kB avhengig. Følgelig vi co-behandlede celler med MS-275 og BAY-11-7082, en IkBα kinase (IKK) hemmer. BAY-11-7082 redusert med 30% til 90% COX-2 ekspresjon etter henholdsvis 6 timer til 48 timer av MS-275 behandling (figur 3A), noe som tyder MS-275-indusert ekspresjon av COX-2 er, i det minste delvis , NF-kB avhengig. Denne hypotesen er understøttet av p65-taushet p65 translokasjon til kjernen. COX-2 ekspresjon ble indusert ved en 24 timers behandling med MS-275 og er forhindret av p65 siRNA (figur 3B). Videre, 24 MS-275 behandling induserte en økning på 50% av det p65-proteinet nivå i cytoplasma og i kromatin fraksjon av BxPC-3-celler (Figur 3C). Den samme MS-275 behandling induserte genet ekspresjon av IL-8 (figur 3D), et direkte mål av NF-kB.
(A) Virkning av en IKK inhibitor (10 pM BAY-11-7082) på 1 uM MS-275-indusert COX-2 ekspresjon. Fosfor-IkBα ble brukt som en kontroll av BAY-11-7082 behandlingseffekten. HSC70 ble anvendt som en kontroll lasting. Tetthetsmåling ble uttrykt som en COX-2 /HSC70 eller IkBα /HSC70-forhold. (B) Western-blot-påvisning av COX-2 i 20 ug BxPC-3-proteiner etter 1 mM MS-275 behandling og p65 siRNA transfeksjon. HSC70 ble anvendt som en kontroll lasting. (C) Western-blot-påvisning av p65 i 15 ug BxPC-3 cytoplasma, nukleoplasma eller kromatin-assosierte proteiner etter 1 mM MS-275 behandling. MEK2 og ORC2 ble anvendt som en kontroll lasting henholdsvis i cytoplasma og kromatin fraksjoner. Tetthetsmåling ble uttrykt som en p65 /MEK2 eller p65 /ORC2-forhold. (D) Tidsavhengig relative ekspresjon av IL-8-mRNA i BxPC-3-celler behandlet med 1 mM MS-275, 10 uM Celecoxib eller en kombinasjon av legemidler. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. *** P 0,001, * P 0,05 versus DMSO. n≥3 i hver tilstand.
Kombinert hemming av klasse I HDAC og COX-2 hemmer cellevekst in vitro
For å validere vår hypotese om at klassen jeg HDAC hemming mediert induksjon av COX-2 kan bidra til den lave effektivitet av HDAC basert terapi i PDAC pasienter, har vi kombinert sistnevnte med celecoxib, en selektiv COX-2 inhibitor ved IC50 (henholdsvis 1 uM av MS-275 og 10 uM av celecoxib). MS-275-indusert COX-2 overekspresjon førte til en 50% økning av PGE2-konsentrasjonen i kulturmediet (figur 4A). BxPC-3-cellen behandling med celecoxib alene eller i kombinasjon med MS-275 signifikant reduksjon av PGE
2-konsentrasjonen i cellen media. Vi analyserte deretter virkningen av disse behandlingene på celleveksten. Kombinasjonen av de to legemidlene reduserte signifikant ( 85%, P 0,001) den BxPC-tre cellevekst i forhold til bruker enten stoffet alene (figur 4B). Vi neste stilte spørsmålet om denne reduksjonen skyldes induksjon av apoptose og utført en annexin V /propidiumjodidfarging på 24, 48 og 72 timer (figur 4C) etter behandlingen. Ingen av de individuelle medikamenter eller deres kombinasjon i stand til å indusere apoptose. Disse resultatene ble bekreftet ved western-blot som viser intakt caspase-3 i alle prøvene (Figur 4C). For ytterligere å undersøke mekanismene for den observerte cellevekst arrest, vi neste undersøkt effekten av MS-275 /celekoksib kombinasjonen på cellesyklusen (Figur 4D). MS-275 alene, men ikke celecoxib, økte andelen av cellen i G1 ved 50% ved 48h. Imidlertid, MS-275 /celecoxib kombinasjonen reduserte signifikant (P 0,001) andelen av celler i S-fasen ved 24 (-74%) 48 (-92%) og 72 timer (-82%) og økte signifikant (P 0,001) andelen i G1 fase ved 24 (+ 48%), 48 (+ 119%) og 72h (+ 80%). For å validere disse resultatene vi analysert ved western blot uttrykket av cellesyklus markører og fant en klar opphopning av p21
WAF1 og p27
Kip1, to cellesyklus-hemmere, på 24 og 48 timer etter samtidig bruk av MS- 275 og celecoxib (figur 4E). Konsekvent, den hyperfosforylisert form av pRb var mindre rikelig når BxPC-3-celler ble samtidig behandlet med MS-275 /celekoksib. Den hypofosforylerte form av pRb dukket opp med co-hemming av klasse I HDAC og COX-2. Hele pRb protein forsvant på 48t etter cotreatment. Denne forsvinningen ble allerede observert av andre etter en p21
WAF1 eller p27
Kip1 opphopning [44]. Den E2F1 transkripsjonsfaktor, en S-fase orchestrator ble undetectable 48t etter samtidig administrasjon av MS-275 og celekoksib. Disse resultater viser at celleveksthemming er knyttet til et G0 /G1 fase blokkering.
(A) ELISA-analyse av PGE
2 i cellekulturmedia 24 og 48 timer etter en pM MS-275 og 10 pM celekoksib behandling. (B) tidsavhengige effekter av MS-275 og celekoksib på cellevekst. (C) tidsavhengige effekter av 1 mM MS-275 og 10 uM celecoxib på apoptotisk celle-forhold av annexin V /PI flowcytometri og på caspase-3 spalting. (D) tidsavhengige effekter av en mikrometer MS-275 og 10 mm celekoksib på cellesyklus ved PI innlemmelse. (E) Western-blot påvisning av p21, p27, pRb ppRb og E2F1 på 20 mikrogram BxPC-3 proteiner 6 til 48 timer etter en mikrometer MS-275 og 10 mm celekoksib behandling. HSC70 ble anvendt som en kontroll lasting. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik, *** P 0,001, ** P 0,01, * P 0,05 versus DMSO eller angitte betingelser. n≥3 i hver tilstand.
BxPC-3 er en PDAC cellelinje kjennetegnet ved sin KRAS villtype, mens mutasjoner i genet som koder for dette proteinet er den vanligste genetiske endring observert i humane PDAC. Imidlertid BxPC-3-celler økt ekspresjon av COX-2, en situasjon som er angitt i 50% av human PDAC. Vi har besluttet å utvide våre observasjoner om interessen for kombinert behandling i bukspyttkjertelkreft ved å undersøke effektiviteten av en slik kombinert behandling på to menneskelige bukspyttkjertelen cellelinjer med rapportert KRAS-mutasjoner. Den første cellelinjen ble PANC-1 ([12 ASP] -KRAS) hvor COX-2 ble uoppdaget på proteinnivået [45]. Den andre cellelinjen var CFPAC-1 ([12 VAL] -KRAS), men hvori COX-2 ble detektert på proteinnivå [45].
PANC-1-cellelinjen ble dyrket med MS-275, celecoxib eller begge legemidler i kombinasjon. Celecoxib 10 mikrometer endret ikke cellevekst når MS-275 1 mikrometer reduseres signifikant (p , 001) cellevekst med 32%. Kombinasjonen av de to medikamenter reduserte PANC-1 cellevekst (49%, P 0,001). Imidlertid er kombinasjonen-indusert veksthemming var ikke signifikant forskjellig fra MS-275-indusert en (figur 5A). I denne cellelinje, ble MS-275 ikke indusere ekspresjon av COX-2 (data ikke vist).
(A) tidsavhengige effekter av MS-275 og celekoksib på PANC-1 cellevekst. (B) tidsavhengige effekter av MS-275 og celekoksib på CFPAC-en cellevekst. (C) Western-blot-påvisning av Cox-2, p21, p27 i 30 ug CFPAC-1-proteiner 48h etter 1 mM MS-275 og 10 uM celecoxib behandling. HSC70 ble anvendt som en kontroll lasting. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik, *** P 0,001 versus DMSO eller angitte tilstander. n≥3 i hver tilstand.
CFPAC-en cellelinje ble dyrket i samme forhold. Celecoxib 10 mikrometer redusert cellevekst med 54% (p , 001) og MS-275 1 mikrometer redusert cellevekst med 59% (p , 001). Her er kombinasjonen av de to medikamenter reduseres vesentlig (79%, P 0,001) CFPAC-1 cellevekst sammenlignet med hvert legemiddel alene (figur 5B). Vi deretter analysert ved western blot uttrykket av COX-2 og cellesyklus markører i CFPAC-1 celler 48t etter narkotika administrasjon. Vi viste en MS-275-indusert opphopning av COX-2 som i BxPC-3 celler (figur 5C). Vi fant også en opphopning av p21
WAF1 og p27
Kip1 etter samtidig bruk av MS-275 og celecoxib (figur 5C), noe som tyder på en cellesyklus arrest.
BxPC-3 CAM svulst etterligner menneske PDAC
evalueringen av nye legemidler eller legemiddelkombinasjoner for bukspyttkjertelen kreft vil bli lettet av tilgjengeligheten av lett, etisk og økonomisk bærekraftige dyremodeller. Derfor har vi foretatt for å avgrense et menneske bukspyttkjertelen chorioallantoic membran (CAM) modell basert på vårt innledende arbeidet [32]. Embedding BxPC-3 celler i matrigel før CAM implantasjon generert en stor forbedring i tumorvolumet. Faktisk, etter implantasjon, økt tumorvolumet lineært (R «> 2 = 0,87) til dag 7 (figur 6A). På tidspunktet for tumor samling (dag 7), et gjennomsnittlig tumorvolum på 59.95 ± 15,34 mm
3 (n = 10) ble observert. BxPC-3 CAM svulster vokste inni CAM bindevev som en unik sfærisk knute. Den samme prosedyre ble fulgt for BxPC-3, PANC-1 og CFPAC-1-cellelinjer. PANC-1 ikke vokse på CAM når CFPAC-en ble så meget små knuter (1 mm lang).
(A) Celler ble implantert i CAM ved embryodag 11 og samles 2, 4, 5, 6 eller 7 dager etter implantasjon. Makroskopiske bildene ble oppnådd på samme forstørrelse fra topp, bunn og side-visning. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik, n 5 ved hver tids-punkt. (B) Histologisk (hematoksylin-eosin eller Masson s Trichrome-farging) analyse av tumorer innsamlede 2, 4, 5, 6 eller 7 dager etter implantasjon. (C) immunohistologi av svulster 7 dager etter BxPC-3 implantasjon på CAM og menneske PDAC svulster. CK7 = Cytokeratin-7, CK19 = cytokeratin-19, CEA = carcinoembryonic antigen, PAS = Amylase-periodisk syre Schiff farging.
BxPC-3 CAM tumorhistologi (figur 6B) avslørte store holmer av sammenhengende celler, noen som viste en gryende sentrale lumen og ble isolert fra hverandre av en kollagenholdig ekstracellulære matrise med flere sparsom fibroblast-lignende celler som viser tilstedeværelsen av en mellomliggende stroma.
for ytterligere å validere vår menneskelige bukspyttkjertelen kreft CAM-modell, sammenlignet vi uttrykk for cytokeratin-7, -19, -20, CD56, CEA og Ki67 bruker immunhistokjemi for menneskers PDAC. Vi har også sjekket for mucin og proteoglykan produksjon utnytte PAS farging. Tumorceller fra både BxPC-3-CAM tumor og PDAC prøver var sterkt positive for cytokeratin-7 og -19, CEA og Ki67 (figur 6C), men negativ for cytokeratin-20 og CD56 (data ikke vist). Begge svulster var positive for PAS farging. Til sammen dataene viste bemerkelsesverdige histologi og biomarkør uttrykk likheter mellom BxPC-3 CAM-modellen og PDAC fra menneskelige pasienter.
Videre vårt siste arbeid på målrettbare biomarkører i menneskelige PDAC [46] identifiserte flere biomarkør kandidater blant disse myoferlin, transformerende vekstfaktor beta-indusert og latent-transformerende vekstfaktor beta-bindende protein 2. Immunhistokjemi og western-blot bekreftet nærværet av disse nye PDAC biomarkører i BxPC-3 CAM-tumorer (figur 7A-B). Til slutt, ved hjelp av western blot vi bekreftet at HDAC1, HDAC2, HDAC3 og COX-2 er uttrykt i BxPC-3 CAM tumor (figur 7A).
(A) Western-blot påvisning av HDAC1, HDAC2, HDAC3 , HDAC7, COX-2, TGFBI, MYOF, LTBP2 i 20 mikrogram PDAC-CAM eller BxPC-3 proteiner. HSC70 ble anvendt som en kontroll lasting. (B) Immunoperoxydase merking av MYOF, TGFBI, LTBP2, COX-2.
neste viste at svulstene var funksjonelt vaskualisert. BxPC-3 CAM blodårene ble farget av FITC-konjugert SNA og 3D rekonstruert etter confocal oppkjøpet. BxPC-3 CAM svulster vises blodårene rundt bukspyttkjertelen holmer (figur 8A). Fluorescens av tumor stroma etter fluorescerende fargestoff injeksjon i CAM blodkar bekrefter at fartøyene er funksjonelle (figur 8B) og påvisning av desmin positive pericytes antyder fartøy stabilisering (figur 8C).
(A) Imaris 3D rekonstruksjon fra en 35 mikrometer stablet bildet etter SNA farging (grønn). Kjerner ble teller farget med DAPI (blå). (B) Confocal image etter FITC (grønn) injeksjon i CAM blodkar. Kjerner ble teller farget med TOPRO (blå) (C) desmin immundeteksjon (rød) i PDAC-CAM farget med SNA (grønn). Kjerner ble teller farget med DAPI (blå).
Deretter BxPC-3 svulster ble behandlet i ferd dag 2 med enten 8 mikrometer celecoxib eller 0,2 mikrometer MS-275 eller med en kombinasjon av to medikamenter i deres respektive konsentrasjoner. MS-275-konsentrasjon ble valgt for å passe sammen med plasmatisk konsentrasjon målt i humant i en 5 mg /m
2 ukentlig doseringsplanen [15]. Mens celecoxib alene påvirket ikke tumorvekst, MS-275 alene induserte en redusert av tumorvekst med 50% (P 0,001) og induserte ekspresjon av COX-2. Kombinasjonen av celecoxib og MS-275 fullstendig opphevet (P 0,001) tumorveksten, som fører til ingen forandring i tumorvolum i forhold til begynnelsen av behandlingen (figur 9A-B). Tumorer som ble behandlet med MS-275 overexpressed COX-2 (figur 9C). Svulster behandlet med kombinasjon av celekoksib og MS-275 avslørte tomrom inne i svulsten. (Figur 9D). Vi stilte spørsmålet om denne reduksjonen av tumorvolumet skyldes induksjon av apoptose eller spredning arrest. Svulster som behandles med MS-275, celecoxib eller begge legemidlene ble sendt til en kløyvde caspase-3 deteksjon og ble merket for Ki67. Den full-lengde caspase-3 ble påvist i alle prøver, men ingen spaltes caspase-3, ble observert (figur 9E).
