Abstract
Histone deacetylase (HDAC) hemmere arrestere kreft celle vekst og forårsake apoptose med lav toksisitet og dermed utgjør en lovende behandling for kreft. I denne studien undersøkte vi antitumoraktivitet i lungekreftceller av den nye cykliske amid-bærende hydroksamsyre baserte HDAC-inhibitorer SL142 og SL325. I A549 og H441 lungekreftceller både SL142 og SL325 indusert mer hemming av cellevekst og celledød enn hydroksamsyre-baserte HDAC-inhibitor suberoylanilide hydroksamsyre (Saha). I tillegg gir kombinasjonen behandling med retinoid medikamenter Atrå eller
9-cis
RA sammen med SL142 eller SL325 betydelig indusert mer apoptose og undertrykte kolonidannelse enn engangsbruk av heller. Uttrykket av retinsyrereseptorer RARα, RARβ, RXRa og RXRβ var uendret med behandlingen. Men en luciferase reporter konstruksjon (pGL4. RARE 7x) inneholder syv tandem gjentakelser av retinsyre ansvarlig element (sjelden) generert betydelig transkripsjonen aktivitet etter kombinasjonsbehandling av retinoic syrer og SL142 eller SL325 i H441 lungekreftceller. Dessuten ble apoptose fremmende Bax ekspresjon og caspase-3 aktivitet økt etter kombinasjonsbehandling. Disse resultater tyder på at kombinasjonen behandling av SL142 eller SL325 med retinsyrer utøver signifikant anti-tumor-aktivitet og er en lovende terapeutisk kandidat til å behandle human lungekreft
relasjon:. Han S, Fukazawa T, Yamatsuji T, Matsuoka J, Miyachi H, Maeda Y, et al. (2010) Anti-tumor effekt i Human lungekreft med en kombinasjon Behandling av Novel histondeacetylase hemmere: SL142 eller SL325 og retinsyrer. PLoS ONE 5 (11): e13834. doi: 10,1371 /journal.pone.0013834
Redaktør: Rory Edward Morty, University of Giessen Lung Center, Tyskland
mottatt: 10 juni 2010; Godkjent: 11 oktober 2010; Publisert: 04.11.2010
Copyright: © 2010 Han et al. . Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering: Grant støtte : Kunnskapsdepartementet, Science, and Culture, Japan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
histone deacetylase (HDAC) og histon acetyltransferase (HAT) er involvert i co-regulering av kromatin remodellering og funksjonell regulering av gentranskripsjon [1]. HDACs regulere ulike typer av biologiske prosesser, inkludert proliferasjon, differensiering og apoptose [2]. Det er flere rapporter som endret HAT eller HDAC-aktivitet er assosiert med forskjellige cancere [3], [4], [5], [6]. En rekke små-molekyl HDAC hemmere har blitt utviklet som anti-kreft agenter. Faktisk ble HDAC-inhibitorer vist å indusere cellesyklusstans, differensiering og apoptose i en rekke ondartede celler. HDAC hemmere øke acetylering av histoner og transkripsjonsfaktorer, som kan reversere genet stanse dermed tilrettelegge genuttrykk [7]. Disse effektene formidles delvis av selektiv forandring i genekspresjon, slik som induksjon av p21waf uttrykk [8]. Imidlertid er ikke alle genene er oppregulert ved behandling med HDAC-inhibitorer, og forholdet mellom oppregulert å ned-regulerte gener er blitt funnet å være i nærheten av 01:01 [9].
Lungekreft den ledende dødsårsaken i verden [7]. De to viktigste formene for lungekreft er ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og småcellet lungekreft (SCLC). Behandlingsresultatene for avansert NSCLC bruker kjemoterapeutika har vært skuffende. Åpenbart er ytterligere etterforskning sterkt behov for behandling av avansert NSCLC. Nye behandlinger med nye virkningsmekanismer, herunder midler som er rettet mot angiogenese og regulering av genuttrykk ved retinsyrer har vært utforsket [10], [11], [12], [13]. Uten ligand, retinsyrer reseptorer fungere som transkripsjons repressors grunn av binding av corepressor komplekser som inneholder histone deacetylases (HDAC). Ligandbindende utgivelser disse co-repressors og rekrutterer co-aktivator komplekser, noe som kan generere histone Acetylase aktivitet [13], [14]. Det har blitt rapportert at de kombinasjoner av all-trans retinsyre og HDAC-inhibitorer har en anti-tumoreffekt [15], [16]. Kombinasjonen av all
trans
retinsyre (ATRA) og noen HDAC-inhibitorer viste en anti-tumoreffekt i neuroblastom [15], [16]. Kombinasjonsterapi av retinsyrer med HDAC-inhibitorer kan forbedre effektiviteten og reduserer bivirkninger Hensikten med denne studien er å utvikle en ny strategi for å behandle lungekreft. Vi har derfor analysert effekten av å bruke en kombinasjon av nye, selektive klasse cykliske amid-bærende hydroksamsyre baserte HDAC-inhibitorer SL142 eller SL325 [17] kombinert med retinsyrer for å teste deres effektivitet for behandling av lungekreft.
Materials og Methods
Reagenser
SL-142 ((E) -3- (2- (4-pyridin-4-yl) benzyl-1-oksoisoindolin-6-yl) -N- hydroxyacrylamide) og SL-325 ((E) -3- (2- (4-kinolin-3-yl) benzyl-1-oksoisoindolin-6-yl) -N-hydroksy-akrylamid) er nye isoindolinon-hydroksamsyre basert histon deacetylase (HDAC) hemmere avledet fra våre strukturelle utviklingsstudier av multi-drug mal thalidomid for etablering av struktur, nye legemidler (fig. 1a) [18], [19].
Å. Kjemisk struktur av Saha, SL142 og SL325. B. Påvisning av H4 acetylering av immunoblot 24 timer etter Saha SL142 eller SL325 behandling (0,5 eller 2,0 mm) i H441 lungekreftceller. β-aktin er vist som kontroll. C. Effekt på celleviabilitet indusert av Saha, SL142 eller SL325. Celler ble sådd ut i 96-brønners plater i en tetthet på 1 x 10
3 celler /brønn 24 timer før behandling med Saha, SL142 eller SL325 (0,1 til 10 uM). Cellelevedyktigheten ble evaluert ved 96 timer etter behandling med WST1 analyse (Roche, Basel, Sveits) i henhold til produsentens protokoll. **, Vesentlig forskjell fra cellen levedyktighet behandlet med 0,1 mikrometer av Saha, SL142 eller SL325 (p 0,01).
Cellelinjer og kultur betingelser
Den menneskelige ikke-liten celle lungekreftceller A549, H441 og H1299 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og dyrket i Hams F12 (A549-celler), RPMI 1640 (H1299-celler) med høy glukose Dulbeccos modifiserte Eagle medium supplementert med 10% varme -inactivated føtalt bovint serum. Alle cellelinjer ble dyrket i 10% CO
2 ved 37 ° C. Lysatene av human voksen lunge-vev ble oppnådd fra Novas Biologicals (Littleton, CO).
immunoblotanalyse
Cellene ble lysert i iskald lyseringsbuffer [1% Triton X-100, 20 mM Tris-HCL (pH 8,0), 137 mM NaCl, 10% glyserol (v /v), 2 mM EDTA, 1 mM natriumortovanadat (v /v) 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid]. Cellelysatene ble klaret ved sentrifugering (10 min ved 15000 x g ved 4 ° C) og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av DC-proteinanalysen (BioRad, Hercules, CA). Like mengder protein ble separert på en SDS-PAGE-gel. Gelen ble overført elektroforetisk til en Hybond PVDF overføringsmembran (Amersham, Arlington Heights, IL). Membranen ble inkubert med primære og sekundære antistoffer i henhold til den Supersignal
R West Pico kjemiluminescens-protokoll (Pierce, Rockford, IL) for å detektere sekundære antistoffbinding. Antistoff som er spesifikt for β-aktin-antistoff ble oppnådd fra Sigma (St. Louis, MO) og antistoff som er spesifikt for humant RARα og RXRa ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti RARβ, RXRβ og Histone H4 acetyl antistoff ble hentet fra Abcam (Cambridge, UK). Antistoff som er spesifikt for humant Bax, p21 og p27 ble erholdt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Sekundær pepperrot peroksidase-konjugerte antistoffer ble hentet fra Jackson Immunoresearch Laboratories (West Grove, PA).
Hemming og måling av caspase aktivitet
Caspase-3-aktivitet ble bestemt ved bruk ApoAlert caspase koloanalysesett fås fra Clontech (Mountain View, CA) ifølge produsenten protokollen. Den gangers økning i aktivitet ble bestemt ved å sammenligne nivåene av kaspase-aktivitet i behandlede celler med de i kontrollcellene (DMSO). For caspase hemming ble cellene inkubert med 100 mikrometer zVAD-FMK hentet fra BioVision (Mountain View, California).
flowcytometrisk analyse for apoptose
Celler ble sådd ut i 24-brønners plater på en tetthet av 0,5-1,0 × 10
5 celler per brønn 1 dag før behandlingene. Etter 72 eller 96 timer, ble cellene høstet og vasket en gang med PBS. Celler ble resuspendert i PBS inneholdende 0,2% Triton X-100 og 1 mg /ml RNase i 5 minutter ved romtemperatur og deretter farget med propidiumjodid ved 50 ug /ml for å bestemme sub-G
0 /G
1 DNA innhold ved hjelp av en FACScan. Dubletter, cellerester og feste gjenstander ble silt ut, og sub-G
0 /G
1 DNA ble bestemt ved hjelp av Cell quest Ver. 3.3 programvare.
klonogene overlevelses
H441-celler ble først sådd ut ved en tetthet på 2 x 10
5 celler per brønn i seks-brønns plater 24 timer før behandling. Etter behandling med HDAC-inhibitorer (0,5 um) og /eller retinsyrer (2,5 uM) i 36 timer, ble cellene frigjøres fra fatet ved inkubasjon med trypsin /EDTA, tellet, og sådd ut i triplikat ved en tetthet på 2 x 10
3 celler i 100 mm-retter til 16 dager. Cellene ble så fiksert med 100% metanol og tillatt å lufttørke. Cellene ble farget med 0,1% krystallfiolett. Kolonier (grupper av aggregerte celler nummerering på minst 50) ble deretter tellet. Det midlere antall av de PBS-behandlede celler ble vilkårlig satt til 100%, og alle andre tall ble normalisert tilsvarende.
Plasmider og Transient transfeksjon rapportør assays
dobbelttrådet DNA inneholdende sju gjentakelser av RARE sekvens [20], [21] ble syntetisert og ligert inn i NheI og Hindi områder av pGL.4.24 luciferase reporter konstruksjon (pGL4 RARE 7x,. Promega, Madison, WI). Luciferase reporter konstruere pGL4 Bax ble generert ved subkloning arrangøren regionen Bax -1570 /+ 68 fra genomisk DNA ved hjelp av PCR primere: 5′-tttctcgag
XhoIgaagtccaagagatcttcctgacaccctagtctga og 5’tttaagctt
HindIII caccgccgctcccgccgccgcctctcgccgggtcc. PCR-genererte fragmentet ble spaltet med Xhol og Hindlll og subklonet direkte inn i pGL.4.24 – luciferase reporter-konstruksjonen (Promega). Alle transfeksjoner ble utført i seks-brønns plater. H441 lungeceller ble utsådd 24 timer før transfeksjonen ved en tetthet på 0,3 x 10
6 /brønn. Transfeksjoner ble utført med Lipofectin (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California, USA) i overensstemmelse med fremstillingen protokoll. H441 lungeceller ble utsådd 24 timer før transfeksjonen ved en tetthet på 0,3 x 106 /brønn. Transfeksjoner ble utført med Lipofectin (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California, USA) i overensstemmelse med fremstillingen protokoll. 4 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med HDAC-inhibitorer og /eller retinsyrer. 24 timer etter HDAC-inhibitorer og /eller retinsyrer behandling ble cellene høstet. Resultatene av en representative forsøk er presentert som gangers induksjon av relative lysenheter normalisert til p-galaktosidase-aktivitet i forhold til det som ble observert for kontroll vektorer. Hvert eksperiment ble gjentatt minst tre ganger. Feilfelt angir standardavvik fra gjennomsnittet av triplikate prøver i ett eksperiment.
Statistisk analyse
statistisk signifikante forskjeller mellom middel og median av studerte grupper ble evaluert ved hjelp av t-test eller ikke-parametrisk Mann-Whitney U-test. En analyse av varians (ANOVA) test, hvor hensiktsmessig, ble brukt for å identifisere statistisk signifikans for multiple sammenligninger. Statistisk signifikans ble definert som p 0,05 (*, #), p. 0,01 (**)
Resultater
Effekter av SL142 og SL325 på H4 acetylering
Å analysere histondeacetylase aktiviteten til SL142 og SL325, ble immunoblot analyse utført. Inkubasjon av H441-celler i 24 timer med Saha, SL142 og SL325 forårsaket en doseavhengig økning i histon H4 acetylering. Både SL142 og SL325 viste sterkere H4 acetylering enn Saha ved konsentrasjoner på 0,5 uM og 2,0 uM. SL142 forårsaket en mye større økning i histon H4 acetylering enn SL325 ved en konsentrasjon på 2,0 uM (fig. 1B). Disse resultatene viser at både SL142 og SL325 økning histon H4 acetylering mer enn Saha [22] i H441 lungekreftceller.
SL142 og SL325 undertrykte betydelig celle levedyktighet i H441 og A549 lungekreft celler
for å analysere den anti-tumor effekt av HDAC-inhibitorer, målte vi cellelevedyktigheten ved MTS-assay etter behandling med Saha, SL142 og SL325 i H441, A549 og H1299 lungekreftceller. Den celleviabilitet analysen avslørte at alle HDAC-inhibitorer (Saha, SL142 og SL325) sterkt undertrykkes cellelevedyktighet H441, A549 og H1299 lungekreftceller i en konsentrasjon på 10 uM. I lavere konsentrasjoner (0,5-5,0 mm), både SL142 og SL325 undertrykte betydelig cellelevedyktigheten til H441 og A549 lungekreft celler (Fig. 1C). Disse resultatene tyder på at SL142 og SL325 er mer effektive i å undertrykke cellelevedyktighet H441 og A549 lungekreftceller enn Saha, og ved lavere konsentrasjoner.
SL142 og SL325 betydelig økt caspase-3 aktivitet indusert apoptose i H441 og A549 lunge kreftceller
Vi analyserte caspase-3-aktivitet og apoptose i H441, A549 og H1299 lungekreft celler etter behandling med HDAC hemmere. Saha, SL142 og SL325 økt caspase-3-aktivitet i alle celletyper. Betydelig, SL142 og SL325 indusert høyere caspase-3-aktivitet (2.25- til 2,48 ganger) enn Saha (1.42- 1,66 ganger) i H441 og A549 lungekreftceller (Fig. 2A). Neste vi undersøkt apoptose indusert av HDAC hemmere i lungekreftceller. Som vist på fig. 2B, SL142 og SL325 indusert mer sub-G
0 /G
1 DNA innhold (51,36 til 55,81% og 35,07 til 43,80% henholdsvis) enn Saha (10,47 til 12,12%) i H441 og A549 lungekreft celler etter en 72 timers behandling. Men disse HDAC-inhibitorer indusert apoptose i mindre H1299 lungekreftceller. Disse resultatene tyder på at SL142 og SL325 mer effektivt øke caspase-3 aktivitet og induserer apoptose i mer H441 og A549 lungekreftceller enn Saha.
A. Analyse av caspase-3-aktivitet i A549, H441 og H1299 lungekreft celler etter Saha, SL142 og SL325 behandling. Celler ble behandlet med Saha, SL142 eller SL325 ved en konsentrasjon på 2,5 uM i 36 timer. Triplikate eksperimenter ble utført; data representerer gjennomsnitt gangers økning ± S.E. Signifikant forskjell fra celler behandlet med PBS og celler behandlet med HDAC-inhibitorer er angitt ble vist (* p 0,05, ** 0,01). B. flowcytometrisk analyse av apoptose indusert av Saha, SL142 eller SL325. Celler ble infisert med Saha, SL142 eller SL325 ved en konsentrasjon på 2,5 uM i 72 timer og sub-G
0 /G
en DNA-innhold ble målt ved propidiumjodidfarging og flowcytometrisk analyse.
Atrå eller
9-cis
RA forbedret caspase-3-aktivitet indusert av SL142 eller SL325 og økt apoptose i H441 lunge adenokarcinomceller
for å analysere kombinasjonen effekten av retinsyrer med SL142 eller SL325, undersøkte vi caspase-3-aktivitet og sub-G
0 /G
1 DNA innhold ved hjelp propidiumjodidfarging med flowcytometri og caspase-3-aktivitet etter ett eller kombinasjonsbehandling. Som vist på fig. 3A, både Atrå og
9-cis
RA indusert ingen caspase-3-aktivitet mens en enkelt behandling av Saha, SL142 eller SL325 betydelig caspase-3-aktivitet økt (1.38- 2,13 ganger) i H441 lunge adenokarcinomceller . Viktigere, retinsyre forbedret caspase-3 aktivitet indusert ved Saha, SL142 eller SL325, og kombinasjonen av ATRA eller
9-cis RA
, og SL142 eller SL325 øket caspase-3 aktivitet (2.47- til 2,91 ganger) mer enn Atrå eller
9-cis
RA og Saha alene (1.90- til 2,04 ganger). 100 pM av zVAD-FMK effektivt inhiberte caspase-3 aktivitet i alle forsøkene. Deretter undersøkte vi mengden av apoptose indusert av HDAC-inhibitorer i lungekreftceller. Sub-G
0 /G
en DNA-innholdet ble øket til 5,98% til 8,58% etter en enkelt behandling av retinoinsyrer eller HDAC-inhibitorer. Men kombinasjonsbehandling av Saha og Atrå eller
9-cis
RA økt sub-G
0 /G
1 DNA innhold til henholdsvis 22,37% og 23,36%. Videre SL142 og Atrå eller
9-cis
RA økt sub-G
0 /G
1 DNA innhold til 32,82% og 56,92% og SL325 og Atrå eller
9-cis
RA økt innhold til henholdsvis 26,18% og 49,33% (fig. 3B). Den sub-G
0 /G
en DNA-innhold som induseres av den ene eller kombinasjonsbehandling på normale humane lungefibroblaster (NHLF) var mindre enn H441-celler (data ikke vist). Morfologisk analyse viste at mer celledød ble indusert etter kombinasjonsbehandling av SL142 og Atrå eller
9-cis
RA enn for engangsbruk (fig. 3C). Disse resultatene tyder på at ATRA eller
9-cis RA
økning caspase-3 aktivitet og apoptose indusert ved Saha, SL142 eller SL325.
A. Analyse av caspase-3 aktivitet indusert ved ATRA eller
9-cis RA
(2,5 uM) og /eller Saha, SL142 eller SL325 (0,5 pM) i H441 lungekreftceller. Celler ble behandlet med Saha, SL142 eller SL325 ved en konsentrasjon på 2,5 uM i 36 timer. Etter 36 timers behandling, ble sub-G
0 /G
en DNA-innhold målt ved propidiumjodidfarging og flowcytometrisk analyse. Triplikate eksperimenter ble utført; data representerer gjennomsnitt gangers økning ± S.E. *, Signifikant forskjell fra kontroll-celler (celler uten behandling) (p 0,05). B. Strømningscytometrisk analyse av apoptose indusert ved ATRA eller
9-cis RA
(2,5 uM) og /eller Saha, SL142 eller SL325 (0,5 pM) i H441 lungekreftceller. Etter 96 timers behandling, ble sub-G
0 /G
en DNA-innhold målt ved propidiumjodidfarging og flowcytometrisk analyse. C. Morfologisk analyse av H441-celler etter ATRA eller
9-cis RA
(2,5 uM) og /eller SL142 (0,5 uM) behandling.
Effekt av kombinasjonsbehandling av retinsyrer og SL142 eller SL325 på undertrykkelse av kolonidannelse av H441 lungekreftceller
for å analysere antitumor effekt av kombinasjonsbehandlingen av Atrå eller
9-cis
RA og SL142 eller SL325, en klonogene analyse ble utført. Som vist på fig. 4A og 4B, ATRA eller
9-cis RA
svakt undertrykker kolonidannelse av H441 lungekreftceller (69,1 til 78,0%), mens Saha, SL142 eller SL325 sterkere undertrykke kolonidannelse (40,2 til 69,4%). Betydelig, Atrå eller
9-cis
RA forbedret anti-tumor effekt av Saha, SL142 eller SL325 spesielt kombinert med SL142 eller SL325 og Atrå eller
9-cis
RA drastisk undertrykt kolonidannelse (2,52 til 13,22%). Disse resultater tyder på at kombinasjonen behandling av SL142 eller SL325 og ATRA eller
9-cis RA
synergically hemmer kolonidannelse av H441 lungekreftceller.
A. Kolonidannelse av H441-celler ble behandlet med ATRA eller
9-cis RA
(2,5 uM), eller /og Saha, SL142 eller SL325 (0,5 pM) i 36 timer. Analysen ble initiert av plating 2 × 10
3 celler per 100 mm-retter. Etter 16 dager ble cellene fiksert og farget med krystallfiolett. Representative bilder av eksperimenter utført i tre eksemplarer vises. B. Gjennomsnitt av kolonitall var avledet fra kvantifisering av triplikat retter for hver behandling og prosent-spesifikk cytotoksisitet i forhold til kolonidannelse i DMSO gruppen (kontroll) ble beregnet. *, P. 0,05 versus enkle midler
Kombinasjonen behandling av SL142 eller SL325 og Atrå eller
9-cis
RA øker synergically transkripsjonen aktivitet av RARE men endrer ikke uttrykk fra RAR og RXR
for å analysere transkripsjonen aktivitet av retinsyre responsive element (RARE) etter behandling av SL142 eller SL325 og Atrå eller
9-cis
RA, genererte vi en luciferase konstruksjon drevet av syv tandem gjentakelser av de sjeldne element: pGL4. RARE 7x [20], [21]. pGL4. RARE 7x generert betydelig promotering aktivitet (5.26- til 17,11 ganger) etter administrering av 2,5 mikrometer Atrå eller
9-cis
RA behandlinger i H441 lungekreftceller. Men konstruksjonen viste liten transkripsjonen aktivitet etter 0,5 mikrometer av Saha, SL142 eller SL325 behandling i cellene (1.26- til 1.43- fold). Viktigere, SL142 og SL325 forbedret mer betydelig arrangøren aktiviteten RARE etter behandling av Atrå eller
9-cis
RA. (29.94- til 37,42-fold, 55.58- til 60,14 ganger) sammenlignet med Saha (14.99- til 24,65-fold) (Fig. 5A). Imidlertid, som vist i fig. 5B, demonstrerte immun blot analyse som liten endring ble sett i uttrykket av RARα RARβ, RXRa og RXRβ uttrykk etter én eller kombinasjonsbehandling i H441 lungekreftceller.
A. Transient transfeksjon reporter analyser i H441 celler med pGL4. eller pGL4.RARE 7x (2 mikrogram), pluss pCMV. β-galaktosidase (2 ug) etter retinsyrer (2,5 uM) og /eller SL142 eller SL325 (0,5 uM) retinsyrer behandling. Resultatene er presentert som gangers induksjon av relative lysenheter normalisert til p-galaktosidase-aktivitet i forhold til det som ble observert for kontroll konstruksjoner.
#, vesentlig forskjell fra arrangøren aktivitet generert av pGL4.RARE 7x etter Atrå og Saha behandling (p 0,05). *, Signifikant forskjell fra promoteraktivitet som genereres av pGL4.RARE 7x etter
9-cis RA
og Saha behandlede celler (p 0,05). B. immunoblotanalyse av RARα, RARβ, RXRa og RXRβ uttrykk etter retinsyrer og /eller SL142 eller SL325 behandling i H441 lunge kreftceller. Humane lungekreftceller ble høstet 24 timer etter behandling med ATRA eller
9-cis RA
(2,5 uM), eller /og Saha, SL142 eller SL325 (0,5 uM). β-aktin er vist som kontroll.
Den kombinasjonsbehandling med SL142 eller SL325 og Atrå eller
9-cis
RA øker Bax uttrykk i H441 lungekreftceller
for å undersøke mekanismen av antitumoreffekten indusert av kombinasjonsbehandlingen av ATRA eller
9-cis RA
og SL142 eller SL325, analyserte vi ekspresjon av p21, p27 og Bax i H441 lungekreftceller. Som vist på fig. 6A, p21-ekspresjon ble betydelig økt etter SL142 behandling (Fig. 6A, spor 7-9). Etter ni-cisRA, Saha behandling eller kombinasjonsbehandling med Saha og retinoider økt p27 uttrykk (Fig. 6A, kjørefelt 1-6) som rapportert av andre [16], men ingen signifikant endring ble sett i p27 uttrykk etter SL142 eller SL325 behandling eller kombinasjonen behandling av SL142 eller SL325 og retinoider (fig. 6A, spor 7-12). Viktigere var Bax uttrykk øket 24 timer etter SL142 eller SL325 behandling (Fig. 6A, spor 7, 10) og ATRA eller
9-cis RA
forbedret uttrykket (felt 8, 9, 11,12) i H441 celler. Kombinasjonen behandling av
9-cis
RA og SL325 også økt Bax uttrykk (spor 6). Deretter analyserte vi Bax promoter aktivitet etter kombinasjonsbehandling med luciferase konstruksjon inneholdende Bax promoter region: pGL4. Bax. Som vist på fig. 6B, aktivering av promoteren Bax forble (3.58- til 6,07-ganger) etter en enkelt behandling av HDAC-inhibitorer eller retinsyrer i H441 lungekreftceller. Viktigere, Saha forbedret Bax promoter aktivitet indusert av Atrå eller
9-cis
RA (6.27- til 8,74 ganger) og SL142 og SL325 forbedret enda mer (10.14- til 18.44 ganger). Disse resultater tyder på at kombinasjonen behandling av SL142 eller SL325 og ATRA eller
9-cis RA
kan forbedre den transkripsjonelle aktivitet av Bax promoteren og indusere ekspresjon Bax i H441 lungekreftceller.
A . Immunoblot analyse av RARα, RARβ, RXRa og RXRβ uttrykk etter retinsyrer og /eller SL142 eller SL325 behandling i H441 lunge kreftceller. Humane lungekreftceller ble høstet 24 timer etter behandling med ATRA eller
9-cis RA
(2,5 uM), eller /og Saha, SL142 eller SL325 (0,5 uM). β-aktin er vist som kontroll. B. Forbigående transfeksjon reporter analyser i H441 celler med pGL4. eller pGL4.Bax (2 mikrogram), pluss pCMV. β-galaktosidase (2 ug) etter retinsyrer (2,5 uM) og /eller SL142 eller SL325 (0,5 uM) retinsyrer behandling. Resultatene er angitt som fig. 6A. *, Signifikant forskjell fra arrangøren aktivitet generert av pGL4.Bax etter Atrå eller
9-cis
RA (2,5 mm) eller Saha SL142 eller SL325 (0,5 mm) (p 0,05).
Diskusjoner
Lungekreft er den vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall på verdensbasis [23]. Behandling av lungekreft og kjemoterapi har forlenget overlevelse imidlertid kliniske fordeler med disse midler er begrenset til pasienter i ellers god helse og de i tidlige stadier. Men alle kjemoterapi behandlinger har også uønskede bivirkninger for pasienten [24]. Nylig har små molekyler blitt utviklet for å behandle lungekreft hos pasienter som bærer slike muterte gener som EGFR og EML4-ALK fusjonsgener. Disse små molekyler er utformet for å målrette kinase-domener av muterte gener og hemmer deres aktivitet [25], [26]. Imidlertid er en slik liten molekyl terapi ikke egnet for de fleste lungekreft hendelser, inkludert kreft forårsaket av et mutert gen KRAS [27]. Åpenbart er videre undersøkelser av nyere, tolereres midler med nye virkningsmekanismer presserende behov for å forbedre varigheten og livskvalitet for denne store pasientpopulasjon.
selektive hemmere av menneskelige histone deacetylases (HDAC) er rapportert å ha antitumoraktivitet
in vivo
, og flere av dem er under kliniske forsøk [9], [28], [29], [30], [31], [32], [33], [34], [35], [36]. Den første av disse har Saha blitt godkjent for behandling av kutan T-cellelymfom og det har også blitt rapportert at Saha har en anti-tumoreffekt mot lungekreftceller [37], [38]. Vi har tidligere utviklet nye amid-bærende hydroksaminsyrederivater som klasseselektiv HDAC-inhibitorer betegnes SL142 og SL325 (fig. 1A), og rapportert at disse små molekylene viser mer betydnings HDAC1, HDAC4 og HDAC6 inhiberende aktivitet i humane prostatacancerceller LNCaP enn Saha [17]. Halv maksimale hemmende konsentrasjoner (IC50s) av SL-142 mot HDAC1, HDAC4 og HDAC6 er 69 ± 5 nM, 53 ± 2 nM og 260 ± 70 nM. De IC50s av SL-325 mot HDAC1, HDAC4 og HDAC6 er 120 ± 4 nM, 65 ± 4 nM og 310 ± 50 nM. I motsetning til IC50s av klinisk brukes HDAC hemmer suberoylanilide hydroxaminsyren ZolinzaTM mot HDAC1 og HDAC4 er mye høyere ved 290 ± 50 nM, 340 ± 30 nM, og kan sammenlignes HDAC6 på 200 ± 10 nM. Derfor er disse forbindelser utviser mer potent inhibitorisk aktivitet på HDAC1 og HDAC4 og sammenlignbar HDAC6 inhibitorisk aktivitet sammenlignet med klinisk anvendt HDAC-inhibitor suberoylanilide hydroksamsyre (ZolinzaTM) [18], [19].
I den foreliggende undersøkelse , SL142 og SL325 viste mer betydelig HADC hemmende aktivitet (HAT aktivitet) i H441 lungekreftceller (fig. 1B) og undertrykt tumorviabilitet i H441 og A549 lungekreftceller enn Saha (fig. 1C), noe som indikerer at SL142 og SL325 er mer effektive HDAC hemmere enn Saha. I vår forrige rapport, SL142 og SL325 viste signifikant p21 promoter aktivitet og cytostatisk aktivitet i prostatakreftceller LNCaP [17]. Men i denne studien, er disse små molekyler også induserte signifikant caspase-3 aktivitet og subG
0 /G
en populasjon i H441 og A549 lungekreftceller. Disse resultatene tyder på at SL142 og SL325 kunne indusere apoptose i lungekreft.
retinsyrer modulere normal, premaligne og maligne celle fenotyper av endringer i genekspresjon som medieres gjennom binding til to klasser av nukleære hormonreseptorer, jo RAR filer og RXRs. ATRA binder RAR med høy affinitet, men binder seg ikke til RXR, mens
9-cis
RA er en ligand som binder og transaktiverer både RARs og RXRs [39], [40]. Retinsyrer regulere differensiering i luftveisepitelet og undertrykke kreft for lungekreft og hode- og halskreft [41], [42], [43]. Viktigere er det blitt rapportert at kombinasjonsbehandling av HDAC-inhibitorer og retinsyrer økt antitumoraktivitet i ondartede celler [44], [45], [46], [47]. Videre Epping et al. rapporterte at retinsyrereseptor (RAR) reaksjonsveien er rettet med HDAC-inhibitor og som antitumoreffekten av HDAC-inhibitor i tumorceller er, delvis, ved derepresjon av retinsyre [48]. I vår undersøkelse kombinasjonsbehandling av SL142 eller SL325 med disse retinsyrer synergically økt apoptose og undertrykket kolonidannelse i de celler (fig. 3A, 3B, 4A og 4B). Videre transkripsjonen aktivitet generert av RARE etter at kombinasjonsbehandlingen var mye høyere enn for en enkelt behandling (Fig. 5A). RAR er kjent for å danne en heterodimer med RXR og binder seg til et retinoinsyre responsive element (RARE) [49], [50]. Imidlertid ekspresjon av disse reseptorene ble ikke øket etter behandlingen i H441 lungekreftceller (Fig. 5B) [45], [51]. Både retinsyrer og HDAC-inhibitorer har blitt rapportert å aktivere cellesyklusen eller apoptose-relaterte gener og indusere celledifferensiering eller apoptose i kreftceller [52], [53], [54], [55], [56], [57], [58], [59], [60], [61]. I vår rapport, ekspresjon av p21 var tydelig øket etter SL142 behandling i H441 lungekreftceller og enda viktigere, Bax ekspresjon ble øket etter at kombinasjonsbehandling av HDAC-inhibitorer og retinsyrer. Uttrykk av p27 ble ikke endret etter SL142 eller SL325 og /eller retinoid behandling [16]. Promoteren til p21-genet inneholder en funksjonell RARE [62], og dette er i overensstemmelse med våre resultater (fig. 5A). Imidlertid p21 ble opprinnelig identifisert som et molekyl som regulerer overgangen fra den G1 fase til S-fasen av cellesyklusen, og overekspresjon av p21 er blitt vist å indusere differensiering i forskjellige celler i stedet for å indusere caspase-3 aktivitet og apoptose [63] , [64], [65], [66]. På den annen side over uttrykk for Bax induserer caspase-3 aktivitet og apoptose i mange typer celler [67], [68], [69]. I denne studien var kombinasjonen behandling av SL325 og retinsyrer betydelig indusert celledød i H441 lungekreftceller. Likevel kombinasjonsbehandling neppe økt p21-ekspresjon (Fig. 6A). Som vist på fig. 6A, p53 uttrykk ble ikke endret etter behandlingen og H441 ikke-små lungekreftceller bære mutert p53. Disse resultater antyder at oppregulering av Bax kan ha en viktig rolle i antitumoreffekt av kombinasjonsbehandlingen av SL142 eller SL325 og ATRA eller
9-cis RA
i H441 lungekreftceller [54] og Bax var opptil regulert i p53 uavhengig sti. Som vist på fig. 6A, p53 uttrykk ble ikke endret etter behandlingen og H441 ikke-små lungekreftceller bære mutert p53. På den annen side, som vist i fig. 1C og fig.
