Abstract
fibroblast vekstfaktor 2 (FGF2) er produsert av eggstokkene kreftceller og det har blitt foreslått å spille en viktig rolle i tumorprogresjon. I denne studien rapporterer vi at FGF2 behandling nedregulert E-cadherin med opp-regulere sine transkripsjons repressors, Slug og ZEB1, i menneskelige eggstokkreft celler. Den farmakologiske inhibering av fosfatidylinositol-3-kinase (PI3K), pattedyr-target av rapamycin (mTOR), og MEK antyder at både PI3K /Akt /mTOR og MAPK /ERK-signalering er nødvendig for FGF2-indusert E-cadherin nedregulering. Videre FGF2 oppregulert Slug og ZEB1 uttrykk via PI3K /Akt /mTOR og MAPK /ERK signalveier, henholdsvis. Til slutt ble FGF2-indusert celle invasjon avskaffet ved inhibering av PI3K /Akt /mTOR og MAPK /ERK trasé, og den tvangs ekspresjon av E-cadherin avtatt egenverdi invasivitet av eggstokkreft celler, så vel som den FGF2-indusert celle invasjon . Denne studien viser en ny mekanisme hvor FGF2 nedregulerer E-cadherin uttrykk gjennom aktivering av PI3K /Akt /mTOR og MAPK /ERK signalering, og den opp-regulering av Slug og ZEB1 i humane eggstokkreft celler.
Citation: Lau MT, så WK, Leung PCK (2013) fibroblastvekstfaktor 2 induserer E-cadherin nedregulering via PI3K /Akt /mTOR og MAPK /ERK signale i eggstokkreft celler. PLoS ONE 8 (3): e59083. doi: 10,1371 /journal.pone.0059083
Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia
mottatt: 07.12.2012; Godkjent: 11 februar 2013; Publisert: 15 mars 2013
Copyright: © 2013 Lau et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av driftsstøtte fra den kanadiske Institutes of Health Research til PCKL. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarialcancer (EOC), som omfatter 90% av alle eggstokkene maligniteter, er den vanligste og dødelig form for gynekologisk kreft i utviklede land [1], har dødeligheten for denne sykdommen ikke forandret seg mye i de siste 50 årene.
fibroblast vekstfaktor-2 (FGF2) formidler ulike cellulære hendelser, herunder spredning, motorisk uro og differensiering [2], [3], og ondartede ovarietumorer er vanlig hos pasienter med forhøyet FGF2 [4] – [6]. Imidlertid er rollen til FGF2 i kreft progresjon eggstokkene fortsatt kontroversielt. Ovarietumorer med høy cytoplasmisk FGF2 er forbundet med redusert tumor aggressivitet og økt overlevelse sammenlignet med pasienter med lave nivåer av FGF2 [7], [8]. I motsetning til dette tidligere
in vitro-studier og
genekspresjonen profilering av avansert kreft i eggstokkene tyder på at FGF2 fungerer som en autokrin vekstfaktor for ovariecancer celleproliferasjon [9] – [11] og invasjon [12]. Dessuten, FGF2 regulerer ekspresjonen av flere gener involvert i angiogenese eller metastase, herunder metalloproteinaser [13], vaskulær endotelial vekstfaktor [14], og E-cadherin [13], [15], [16].
E-cadherin fungerer som en celle-celle adhesjon protein og tumor suppressor som er dempet i mange ondartede sykdommer, og tapet av E-cadherin ekspresjon eller funksjon er et vanlig arrangement i tumorprogresjon [17], [18]. E-cadherin er kjent for å undertrykke tumorcelle invasjon, og re-ekspresjon av E-cadherin i E-cadherin-manglende karsinomer går tilbake cellene til en mindre invasiv, mindre aggressiv fenotype [19] – [21], mens tapet av E -cadherin er assosiert med eggstokkreft metastaser, peritoneal formidling, og dårlig prognose [22] – [26]. Tapet av E-cadherin funksjonen kan oppnås ved mutasjon av E-cadherin-genet [27], den hypermethylation av E-cadherin-promoteren [28], [29], og den transkripsjonelle undertrykkelse av E-cadherin [30] – [33]. Flere transkripsjonsfaktorer har blitt identifisert til å undertrykke E-cadherin inkludert Snail, Slug, Twist og ZEB1 via deres interaksjon med E-box bindingssete i E-cadherin promoter [30], [31], [34] – [36] .
Tidligere undersøkelser har vist at FGF2 undertrykker E-cadherin i forskjellige celletyper [13], [15], [16]; Men de underliggende mekanismene er fortsatt i stor grad ukjent. I denne studien, viser vi at FGF2 reduserer E-cadherin mRNA og proteinnivåer i et tids- og doseavhengig måte. Videre økte Slug og ZEB1 uttrykk via aktiveringen av PI3K /Akt /mTOR og MAPK /ERK signalveier, henholdsvis, medierer potensielt virkningene av FGF2 på E-cadherin. Til slutt, våre resultater tyder på at nedregulering av E-cadherin-mediert FGF2 forbedrer invasivitet i eggstokkreft celler.
Materialer og metoder
Material
FGF2 ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Ontario, Canada). Rapamycin, U0126 og Wortmannin ble kjøpt fra Calbiochem (San Diego, California). E-cadherin antistoffer ble kjøpt fra BD Biosciences (San Jose, California). Akt, fosfor-Akt (Ser473), P44 /42 MAPK (ERK), fosfor-P44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204), p70S6K og fosfor-p70S6K (Thr389) antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA). Den β-actin antistoff ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). Pepperrot-peroksidase-konjugert geit anti-kanin IgG og geite-anti-muse-IgG-antistoffer ble anskaffet fra Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA).
plasmidkonstruksjoner
pcDNA-GFP (GFP) ble sjenerøst gitt av Dr. Alonzo H. Ross [37]. Den pcDNA-Ecadherin-GFP (ECAD-GFP) var en slags gave fra Dr. Jennifer L. Stow [38].
Cellekultur og trans
Menneske eggstokkreft cellelinjer (OVCAR- 4 og Skov-3) ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), og deres bruk ble godkjent av University of British Columbia klinisk Screening Committee for forskning og andre studier som omfatter mennesker. Celler ble dyrket i Medium 199: MCDB 105 (01:01; Sigma-Aldrich) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS; Hyclone Laboratories Ltd., Logan, UT), 100 U /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycin ( life Technologies, Inc., Rockville, MD) i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 til 95% luft ved 37 ° C. Cellene ble passert med 0,06% trypsin (1:250) /0.01% EDTA i Mg
2 + /Ca
2+ – gratis HBSS ved samløpet
Alle transfections ble utført ved hjelp av Lipofectamine. 2000 reagens (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) i henhold til produsentens protokoll.
revers transkripsjon kvantitativ real-time PCR (RT-qPCR)
Total RNA ble fremstilt ved bruk TRIzol reagens (Invitrogen ) i henhold til produsentens instruksjoner. Enkelt-trådet cDNA ble syntetisert fra 2 ug total RNA i henhold til produsentens prosedyre (Amersham Biosciences, Quebec, Canada). Primerne anvendt for SYBR grønn RT-qPCR var som følger: for human E-cadherin, følelse, 5′-ACA GCC CCG CCT TAT GAT T-3 «og antisense, 5′-TCG GAA CCG CTT CCT TCA-3′; for Slug, følelse, 5»-TTC GGA CCCACA CAT TAC CT-3 «og antisense, 5′-GCA GTG AGG GCA AGA AAA AG-3′; for ZEB1, følelse, 5»-GCA CCT GAA GAG GAC CAG AG-3 «og antisense, 5′-TGC ATC TGG TGT TCC ATT TT-3′; og for GAPDH, følelse, 5»-ATG GAA ATC CCA TCA CCA TCT T-3 «og antisense, 5′-CGC CCC ACT TGA TTT TGG -3». RT-qPCR ble utført ved anvendelse av Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System er utstyrt med en 96-brønners reaksjonsplate optisk. Relativ kvantifisering av mRNA-nivåer ble utført ved hjelp av sammenlignende Cq-metoden (ΔΔCq metoden) med GAPDH som referanse-genet.
Western blot-analyse
Cellene ble høstet i lyseringsbuffer [50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% natriumdeoksycholat, 1 mM EDTA, 0,1% SDS] som inneholdt protease-inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich), og proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved anvendelse av DC-proteinanalysen (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). Protein (40 ug) ble underkastet elektroforese på 7,5% SDS-polyakrylamidgeler, overført til nitrocellulosemembraner (Amersham Bioscience), og inkubert med spesifikke primære antistoffer ved 4 ° C over natten. Etter vasking ble membranene inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer i 1 time og ble visualisert med forbedret kjemiluminescerende substrat (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA).
Invasion assay
Twenty -Fire-godt transwell setter inn med en 8-mikrometer pore belagt med 1 mg /ml Matrigel (50 ul /brønn; BD fag, Mississauga, ON, Canada) ble brukt for å vurdere celle invasjon. Trypsinisert-celler (1 x 10
5) i 0,1% FBS medium, med eller uten FGF2, ble sådd ut i triplikat i det øvre kammer. 1% FBS-medium ble plassert i de lavere brønner. Kamrene ble inkubert i 24 timer ved 37 ° C i en 5% CO
2 atmosfære. Celler som ikke trenger gjennom filteret var tørket av, og invaderte celler på den nedre overflate av filteret ble fiksert med iskald metanol og farget med 0,5% krystallfiolett. Resultatene er presentert som gjennomsnittlig antall invaderte celler av fem felt (ved 100 x forstørrelse) ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter.
Dataanalyse
Alle verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM fra tre seks uavhengige forsøk. Data ble analysert av en enveis ANOVA etterfulgt av Tukey sin
post hoc
test med GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, California).
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Effekt av FGF2 på E-cadherin uttrykk i eggstokkreft celler
Som et første skritt mot å analysere rollen til FGF2 i progresjon av kreft i eggstokkene, undersøkte vi effekten av FGF2 på E-cadherin ekspresjon i OVCAR-4 og SKOV-3-celler. Våre resultater viste at behandling med FGF2 nedregulert E-cadherin mRNA-nivåer i både en tids (Fig 1 A) og doseavhengig måte (figur 1B). På samme måte viste Western blot-analyse som behandling med FGF2 nedregulert E-cadherin protein nivåer på en doseavhengig måte i eggstokkreft celler (figur 1C).
(A) OVCAR-4 og SKOV-3-celler ble behandlet med 10 ng /ml FGF2 for 0 til 24 timer som indikert, og deretter E-cadherin mRNA-nivåene ble analysert ved hjelp av RT-qPCR. (B og C) OVCAR-4 og SKOV-3-celler ble behandlet med forskjellige doser av FGF2 i 24 timer, hvoretter E-cadherin mRNA-nivåer (B) og proteinnivåer (C) ble analysert ved henholdsvis RT-qPCR og Western blotting, . Resultatene representerer gjennomsnitt ± SEM (n = 3; verdiene uten en felles bokstav er vesentlig forskjellige,
P
0,05). Data ble analysert ved enveis ANOVA etterfulgt av Tukey multippel sammenligningstest.
FGF2-induserer E-cadherin nedregulering via PI3K /Akt og MAPK /ERK stier
Det er godt dokumentert at PI3K /Akt og MAPK /ERK trasé er ofte forsterket og tjene som overlevelses trasé i eggstokkene karsinomer [39]. I tillegg er FGF2 kjent for å aktivere den PI3K /akt og MAPK /ERK trasé [40], [41], og er rapportert å regulere E-cadherin nedregulering [42], [43]. Derfor analyserte vi om disse to banene var involvert i undertrykkelse av E-cadherin uttrykk ved FGF2. Vi først undersøkt fosforylering status av Akt og ERK ved behandling med 10 ng /ml FGF2 på 5, 15, 30, 60, og 120 minutter etter behandling, og fant at FGF2 behandling indusert fosforylering av Akt (Ser473) og ERK (Thr202 /Tyr204) på en tidsavhengig måte i SKOV-3-celler (figur 2A). For å avgjøre hvorvidt disse to banene var involvert i undertrykkelse av E-cadherin uttrykk ved FGF2, brukte vi to farmakologiske hemmere, Wortmannin og U0126, spesielt for å blokkere PI3K /Akt og MAPK /ERK veier henholdsvis i Skov-3 celler og OVCAR-4 (fig 2 B), respektivt. Som vist på fig. 2C, den PI3K og ERK hemmere betydelig økt basal E-cadherin uttrykk og markert redusert, men ikke helt avskaffe, FGF2-indusert undertrykkelse av E-cadherin uttrykk, som viste involvering av PI3K /Akt og MAPK /ERK baner i FGF2-mediert nedregulering av E-cadherin ekspresjon i eggstokkreft celler.
(A) SKOV-3-celler ble behandlet med 10 ng /ml FGF2 til 0 til 120 min som angitt. Fosforylert og total Akt, fosforylert og total ERK, og p-aktin-nivåene ble analysert ved hjelp av Western blot-analyse. (B) OVCAR-4 og SKOV-3-celler ble forbehandlet med Wortmannin (1 uM) eller U0126 (10 uM) i 30 minutter før tilsetning av FGF2 (10 ng /ml) i 30 min. Fosforylerte og total Akt, fosforylerte og total ERK proteinnivåer ble analysert ved Western blotting. Den β-aktin-antistoff ble anvendt som en kontroll for lik belastning. (C) OVCAR-4 og SKOV-3-celler ble forbehandlet med Wortmannin (1 uM) eller U0126 (10 pM) alene eller i nærvær av 10 ng /ml FGF2 i 24 timer, hvoretter E-cadherin proteinnivåer ble analysert ved hjelp Western blotting. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SEM [(A) og amp; (B) n = 3; (C) n = 6; verdier uten et felles brev er vesentlig forskjellige,
P
0,05]. Data ble analysert ved enveis ANOVA etterfulgt av Tukey multippel sammenligningstest.
FGF2 forskjellig opp-regulerer Slug og ZEB1 uttrykk via PI3K /Akt og MAPK /ERK veier henholdsvis
for å undersøke om FGF2 nedregulerer E-cadherin uttrykk ved å modulere transcriptional regulering av E-cadherin, brukte vi RT-qPCR å undersøke mRNA nivåer av e-cadherin transkripsjons repressors Snail, Slug, Twist og ZEB1. Behandling med FGF2 betydelig økt Slug og ZEB1 mRNA-nivåer i en tids (figur 3A og 3B) og doseavhengig måte (figur 3C og 3D), men hadde ingen signifikant innflytelse på sneglen og Twist mRNA-nivåer (data ikke vist). For å bestemme hvorvidt den PI3K /Akt og MAPK /ERK signalbaner som er involvert i FGF2-induserte økninger i Slug og ZEB1 mRNA, ble cellene behandlet med PI3K-inhibitor (Wortmannin) eller MEK-inhibitor (U0126) i nærvær eller fravær av FGF2. Interessant, Wortmannin undertrykte betydelig basal Slug mRNA nivå og helt avskaffet effekten av FGF2 på Slug mRNA nivåer (figur 3E), mens FGF2 forbedret ZEB1 mRNA nivåer ble ikke påvirket (figur 3F). På den annen side, U0126 behandling fullstendig avskaffet virkningene av FGF2 på ZEB1 mRNA-nivåer (figur 3F), stoffet hadde ingen effekt på Slug mRNA-nivåer (figur 3E).
(A og B) OVCAR-4 og SKOV-3-celler ble behandlet med 10 ng /ml FGF2 til forskjellige tider, og mRNA-nivåer av Slug (A) og ZEB1 (B) ble analysert ved RT-qPCR. (C og D) OVCAR-4 og SKOV-3-celler ble behandlet med forskjellige doser av FGF2 i 6 timer (Slug, c) eller 24 timer (ZEB1, D), og mRNA-nivåer ble analysert ved RT-qPCR. (E og F) OVCAR-4 og SKOV-3-celler ble forbehandlet med Wortmannin (1 uM) eller U0126 (10 uM) i 30 minutter før tilsetning av 10 ng /ml FGF2 i 6 timer (E) og 24 timer ( F). Slug og ZEB1 mRNA nivåer ble analysert ved RT-qPCR. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SEM (n = 3; verdiene uten en felles bokstav er vesentlig forskjellige,
P
0,05). Data ble analysert ved enveis ANOVA etterfulgt av Tukey multippel sammenligningstest.
FGF2-indusert E-cadherin nedregulering via PI3K /Akt /mTOR sti
Neste, vi undersøkt rollen til mTOR-reaksjonsveien i FGF2-indusert E-cadherin nedreguleringen, fordi mTOR er en bane på nedstrømssiden av PI3K /Akt signalering som er blitt vist å være involvert i E-cadherin nedregulering [44]. Som vist ga behandling med FGF2 indusert aktivering av mTOR signalering i en tidsavhengig måte i SKOV-3-celler, som angitt ved fosforylering av mTOR nedstrøms molekyl, p70S6K (figur 4A). For å avgjøre om PI3K /Akt /mTOR signalveien var involvert i reguleringen av E-cadherin nivåer av FGF2, brukte vi mTOR-spesifikk hemmer rapamycin å blokkere mTOR sti i Skov-3 celler og OVCAR-4 (fig 4B) . I likhet med Wortmannin, rapamycin helt avskaffet FGF2-indusert heving av Slug mRNA (fig 4C), mens rapamycin viste ingen effekt på ZEB1 mRNA nivåer (Fig 4D). Videre rapamycin behandling betydelig økt protein nivåer av E-cadherin og markert redusert den undertrykkende virkning av FGF2 på E-cadherin proteinnivåer (figur 4E), noe som indikerer at PI3K /Akt /mTOR-reaksjonsveien er involvert i FGF2-indusert E-cadherin undertrykkelse i eggstokkreft celler.
(A) SKOV-3-celler ble behandlet med 10 ng /ml FGF2 til 0 til 120 min som angitt. Fosforylerte og totale p70S6K-nivåene ble analysert ved hjelp av Western blot-analyse. (B) OVCAR-4 og SKOV-3-celler ble forbehandlet med Wortmannin (1 uM) eller rapamycin (20 nM) i 30 minutter før tilsetning av 10 ng /ml FGF2 i 30 min. Fosfo-Akt og Akt, sammen med fosfo-p70S6K, og p70S6K proteinnivåer ble analysert ved Western blotting. Den β-aktin-antistoff ble anvendt som en kontroll for lik belastning. (C og D) OVCAR-4 og SKOV-3-celler ble forbehandlet med rapamycin (20 nM) i 30 minutter før tilsetning av 10 ng /ml FGF2 i 6 timer (C) og 24 timer (D). Slug og ZEB1 mRNA nivåer ble analysert ved RT-qPCR. (E) OVCAR-4 og SKOV-3-celler ble forbehandlet med rapamycin (20 nM) i 30 minutter før tilsetning av 10 ng /ml FGF2 i 24 timer, hvoretter E-cadherin proteinnivåer ble analysert ved Western blotting. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SEM [(A) – (D) n = 3; (E) n = 6; verdier uten et felles brev er vesentlig forskjellige,
P
0,05). Data ble analysert ved enveis ANOVA etterfulgt av Tukey multippel sammenligningstest.
Aktivering av PI3K /Akt /mTOR og MAPK /ERK signalveier er avgjørende for FGF2-indusert celle invasjon
Flere bevislinjer indikerer at FGF2 spiller en viktig rolle i de invasive egenskaper av humane kreftceller [45], [46]. Derfor undersøkte vi effekten av FGF2 på celle invasjon i eggstokkreft celler ved hjelp av Matrigel-belagte Transwell invasjons analyser. OVCAR-4 og SKOV-3-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av FGF2, resulterte i en doseavhengig stimulering av invasjon (figur 5A). Involvering av PI3K /Akt /mTOR og MAPK /ERK signalveier i FGF2-stimulert celle invasjonen ble også vurdert. Våre resultater viste at FGF2-indusert celle invasjon ble markert redusert, men ikke fullstendig, ved behandling med Wortmannin, rapamycin eller U0126 alene (figur 5B), mens kombinert inhibering av PI3K /Akt /mTOR og MAPK /ERK signalveier helt avskaffet FGF2 indusert celle invasjon (fig 5B). Samlet utgjør disse resultatene indikerer at MAPK /ERK og PI3K /Akt /mTOR veier er involvert i FGF2-indusert eggstokkreft celle invasjon.
(A) eggstokkreft celler ble sådd i Matrigel-belagte Transwell innsatser og behandlet med forskjellige doser av FGF2 i 24 timer. (B) Celler ble forbehandlet med Wortmannin (1 uM), rapamycin (20 nM) eller U0126 (10 uM) i 30 minutter og podet i Matrigel-belagte Transwell innsatser og dyrket med 10 ng /ml FGF2 i 24 timer. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SEM [(A) n = 3; (B) n = 6; verdier uten et felles brev er vesentlig forskjellige,
P
0,05]. Data ble analysert ved enveis ANOVA etterfulgt av Tukey multippel sammenligningstest.
nedregulering av E-cadherin formidler FGF2 stimulert eggstokkreft celle invasjon
Deretter spurte vi om nedregulering av E-cadherin mediert FGF2-indusert celle invasjon. SKOV-3-celler ble transient transfektert med vill-type human E-cadherin ekspresjonsplasmid i 48 timer og deretter ble behandlet med FGF2 i ytterligere 24 timer (figur 6A). FGF2 behandling reduserte E-cadherin proteinnivåer i celler transfektert med tom vektor, mens ingen virkning ble påvist i celler som overuttrykker E-cadherin (figur 6A). Overekspresjon av E-cadherin redusert basal invasivitet og avskaffet evne FGF2 å indusere kreft i eggstokkene celle invasjon (Fig 6B), impliserer at E-cadherin spiller en avgjørende rolle i FGF-stimulert eggstokkreft celle invasjon.
( A) SKOV-3-celler ble forbigående transfektert med pcDNA-GFP (GFP) eller human E-cadherin ekspresjonsplasmider (ECAD-GFP) i 48 timer. Etter transfeksjon ble cellene behandlet med 10 ng /ml FGF2 i 24 timer og utsatt for immunblotting for E-cadherin og β-aktin. (B) Etter 48 timer med transfeksjonen ble cellene trypsinert utsådd i Matrigel-belagte Transwell innsatser, og dyrket med 10 ng /ml FGF2 i 24 timer. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SEM (n = 6; verdiene uten en felles bokstav er vesentlig forskjellige,
P
0,05). Data ble analysert ved enveis ANOVA etterfulgt av Tukey multippel sammenligningstest.
Diskusjoner
FGF2, som er medlem av FGF-familien, vanligvis presenterer i plasma ved en konsentrasjon mindre enn 10 pg /ml, og forhøyede nivåer (opp til 6 ng /ml) kan bli funnet i asket fluid fra ovarier cancerpasienter [4]. Kliniske studier har vist en høy grad av FGF2 og dets mRNA i avanserte primære eggstokk-kreft når sammenlignet med normale eggstokkene [6]. Dessuten har flere studier vist økt plasmanivå av FGF2 i eggstokkreft pasienter [4], [47], [48]. De forhøyede nivåer av FGF2 og dets reseptorer som er tilstede i eggstokkene ondartede svulster antyder at FGF2 spiller en viktig rolle i ovarial tumor progresjon [9]. Flere
in vitro-studier og
genekspresjonen profilering studier i fremskreden kreft i eggstokkene viser at FGF2 fungerer som en autokrin vekstfaktor for ovariecancer celleproliferasjon [9] – [11], og invasjon [12]. Dessuten regulerer FGF2 ekspresjon av forskjellige gener involvert i angiogenese eller metastase [13] – [15], [49], noe som antyder at FGF2 signaleringen kan være et potensielt terapeutisk mål. Imidlertid gjen rolle FGF2 i ovarial tumor progresjon som skal belyses. Den foreliggende undersøkelse viser at FGF2 indusert den nedregulering av E-cadherin uttrykk, som er involvert i FGF2-indusert eggstokkreft celle invasjon. I tillegg er våre studier tyder på at FGF2 utøver sin effekt i menneskelig eggstokkreft celler via aktivering av PI3K /Akt /mTOR og MAPK /ERK signalveier og påfølgende økt uttrykk av Slug og ZEB1.
FGF2 spiller en fundamental rolle i forskjellige biologiske aktiviteter, inkludert celle proliferasjon, migrering og differensiering [2], [3]. FGF2 er også blitt beskrevet som en angiogen faktor [50], og mer nylig har vist seg å bidra til utvikling av metastaser peritioneal [51]. Dysregulert FGF signalering er vanlig i mange kreftformer, inkludert kreft i eggstokkene [4] – [6], [52], som tyder på at denne signalering kan fremme tumorutvikling og progresjon. FGF2 har blitt rapportert til å modulere E-cadherin-ekspresjon i en rekke forskjellige celletyper. Imidlertid sin rolle på E-cadherin ekspresjon synes å være celletypespesifikk. I pankreatisk adenokarsinom, har FGF-1 og FGF2 blitt vist å oppregulerer E-cadherin uttrykk [53]. I motsetning til dette, har den nedregulering av E-cadherin uttrykk med FGF2 behandling er observert i tubulære epitelceller og NBT-II-carcinoma-celler, noe som resulterer i øket cellemigrering og invasjon [13], [15]. Også, FGF2 har vist seg å ned-regulere E-cadherin-ekspresjon i humane umbilikalvene endotelceller via JNK-signalreaksjonsveien [16]. De aktuelle data støtter en viktig rolle for FGF2 i nedregulering av E-cadherin in ovarian carcinoma celler via PI3K /Akt /mTOR og MAPK /ERK-signalveier. Bindingen av FGF2 til sine reseptorer fører til aktivering av nedstrøms signalveier som PI3K /Akt og MAPK /ERK [40], [41]. Emerging bevis tyder på at disse banene er involvert i reguleringen av E-cadherin [42], [43]. Videre er avvikende inhibering av mTOR vei, som er nedstrøms av PI3K /Akt signale blokkert FGF2-indusert E-cadherin nedregulering og celle invasjon. Disse resultatene er i tråd med vår forrige undersøkelse viser en forutsetning for mTOR signalisering i insulin-like growrh faktor 1-indusert E-cadherin nedregulering i eggstokkreft celler [54]. Tatt sammen, våre resultater indikerer at den FGF2 avhengige PI3K /Akt /mTOR og MAPK /ERK-aktivering er involvert i FGF2-indusert E-cadherin nedregulering, og celle invasjon i eggstokkreft celler.
Tapet av E-cadherin genuttrykk skyldes i hovedsak en overekspresjon av transkripsjons repressors inkludert sneglen, Slug og ZEB1 [34] – [36]. Faktisk har forhøyede Slug og ZEB1 mRNA nivåer ble funnet i ovarialcancer [55], [56]. Videre er en tidligere studie vist at overekspresjon av Slug i SKOV-3-celler resulterer i en nedregulering av E-cadherin, forbedret motilitet og invasivitet [57]. Men mye mindre er kjent om regulering av disse transkripsjons repressors. Slug ekspresjon kan reguleres ved PI3K /akt-signalering, som også kan aktiveres ved behandling FGF [40], [41], [43], [45]. I samsvar med disse resultatene, hemming av PI3K /Akt signal av Wortmannin redusert basal og avskaffet FGF2-indusert Slug nivåer uttrykk, noe som tyder på at denne veien er kritisk for Slug uttrykk. Aktiveringen av PI3K /Akt signalering har vist seg å stimulere Slug ekspresjon via GSK-3β /β-catenin signalering og deretter å ned-regulere E-cadherin i livmor carcinosarcomas og normale hepatocytter [43], [58]. Det er vel kjent at PI3K /Akt signale induserer atom β-catenin opphopning gjennom inhibering av GSK3P [59], [60]. I tillegg, inhibering av mTOR signalering av rapamycin blokkene økt β-catenin translokasjon inn i kjernen i humane pankreatiske p-celler [61]. FGF2 kan aktivere PI3K /Akt signal og nedstrøms GSK3p og mTOR trasé å indusere β-catenin avhengig transkripsjon inkludert som Slug. Videre studier er nødvendig for å klargjøre den nøyaktige mekanismen for heving av Slug nivåer av mTOR veien. Spesielt, E-cadherin protein nivåer ble klart økt med rapamycin, mens basal Slug mRNA nivåer ikke ble berørt. Dermed tyder våre resultater at mTOR signalveien modulerer også E-cadherin nivåer i Slug-uavhengig måte. Interessant, behandling med MEK hemmer U0126 bare blokkert FGF2-indusert ZEB1 uttrykk, men hemmet ikke FGF2-indusert Slug uttrykk. Våre data tyder på at MAPK /ERK er et oppstrøms faktor på ZEB1 aktivering i eggstokkreft celler
in vitro
. FGF2 har vist seg å aktivere MAPK /ERK-reaksjonsveien i forskjellige kreftceller [62], [63], og vi viser i OVCAR-4 og SKOV-3-celler som ZEB1 ekspresjon er MAPK /ERK-avhengig. Disse resultatene er i overensstemmelse med en tidligere undersøkelse som viser et behov for MAPK /ERK-signalisering i IGF-1-indusert ZEB1 ekspresjon i prostatakreftceller [42]. Videre, en fersk studie viste at ERK2, men ikke ERK1, redusert E-cadherin nivåer via Fra1-mediert ZEB1 /2 i en ikke-omformet human bryst epitel cellelinje, MCF-10A celler [64]. Til sammen våre funn tyder på at FGF2 forskjellig regulerer Slug og ZEB1 uttrykk via PI3K /Akt /mTOR og MAPK /ERK signalveier i humane eggstokkreft celler.
Den biologiske betydningen av E-cadherin reduksjon i eggstokkreft invasivitet ble demonstrert ved det faktum at overekspresjon av E-cadherin blokkert FGF2-indusert celle invasjon
in vitro
. Mye tyder på at tapet av E-cadherin er assosiert med eggstokkreft metastaser, peritoneal formidling og dårlig pasient overlevelse [22] – [26], noe som tyder på at E-cadherin fungerer som en suppressor av svulst invasivitet. Faktisk tie E-cadherin av siRNA forbedrer eggstokk-kreft-celle invasjon via en opp-regulering av α5-integrin [24]. Vi har også funnet at E-cadherin knockdown av RNA-interferens øker PI3K /Akt signalveien [65], som i svinger, formidler E-cadherin-uttømming-indusert invasjonen i eggstokkreft celler (Lau
et al
., upublisert). Videre er overekspresjon av en dominant-negativ E-cadherin mutant in ovarian carcinoma celler resulterer i øket mesenchymale cellevandring [66]. Våre resultater viser at FGF2 forbedrer celle invasivitet ved å nedregulere E-cadherin og at E-cadherin overekspresjon hemmer basal invasivitet og opphever FGF2-indusert invasjon. Den PI3K /Akt og MAPK /ERK signalveier er involvert i FGF2-indusert celle invasjonen [45], [46]. Videre er tilleggsmekanismer som for eksempel heving av proteaseaktivitet /sekresjon, modulering av aktin cytoskjelettet, og økt bevegelighet også blitt beskrevet [12], [46], [67]. Mens tap av E-cadherin er blitt vist å stimulere MMP-formidlet invasjon i prostata cancer og bronkiale tumorceller [68], [69]. Samlet utgjør disse resultatene viser at E-cadherin fungerer som en avgjørende suppressor av eggstokkreft invasivitet, og sammen med andre som er beskrevet mekanismer, tap av E-cadherin spiller en viktig rolle i FGF2-indusert celle invasjon.
Oppsummert viser våre resultater at FGF2 nedregulerer E-cadherin uttrykk, mest sannsynlig gjennom den transkripsjonelle undertrykkelse av Slug og ZEB1, som samtidig uttrykt ved aktivering av PI3K /Akt /mTOR og MAPK /ERK veier. I tillegg foreslår den foreliggende studie at nedregulering av E-cadherin medierer FGF2-indusert kreft i eggstokkene celle invasjon (figur 7). Hemming av enten PI3K /Akt /mTOR eller MAPK /ERK signal resultater i delvis blokkert FGF2-indusert E-cadherin nedregulering og celle invasjon. Dermed disse funnene tyder på at utformingen av kombinerte behandlinger rettet mot FGF2 relaterte signalkaskader kan ha relevante implikasjoner i forebygging og behandling av denne malignitet.
Takk
Vi takker Dr. Alonzo H. Ross (University of Massachusetts Medical School, Massachusetts), Dr. Jennifer L. Stow (University of Queensland, Brisbane, Queensland, Australia) for vennlig og sjenerøst gi oss konstruksjoner.
PCKL er mottaker av et Distinguished Scientist Award fra barnet og familien Research Institute.
