Abstract
Det menneskelige genom inneholder seks gener som koder for proteiner validert
in vitro
som spesifikke aktivatorer av de små GTPases «Ras-relatert protein Ral-A» og «Ras-relatert protein Ral-B», generelt kalt Ral-guanin nukleotid utvekslings faktorer (RalGEF). Ral proteiner er viktige bidragsytere til Ras onkogene signal, og
RAS
onkogener er viktig i menneskets ikke-småcellet lungekarsinom (NSCLC). Derfor i dette arbeidet, RalGEF bidrag til onkogene og ikke-onkogene funksjoner på menneske NSCLC cellelinjer, som ankringsavhengig og uavhengig vekst, celleoverlevelse, og spredning, ble undersøkt. Blant alle menneskelige RalGEF, stanse av
RGL1 Hotell og
RALGPS1
hadde ingen påviselig effekt. Men stanse av enten
RGL2
,
RGL3
,
RALGDS
eller, i større grad,
RALGPS2
hemmet cellebefolkningsvekst i forankringsavhengig og uavhengige tilstander (opp til 90 og 80%, henholdsvis).
RALGPS2
lyddemping også forårsaket en økning i antall apoptotiske celler, opp til 45% av cellen befolkningen i transform bronkial BZR celler. I H1299 og A549, to NSCLC cellelinjer,
RALGPS2
lyddemping forårsaket en arrestasjon av celler i G0 /G1-fasen av cellesyklus. Videre ble det forbundet med modulering av viktige cellesyklus regulatorer: E3 Ubiquitin Protein Ligase S-fase kinase-assosiert protein 2 (Skp2) var sterkt nedregulert (både på mRNA og proteinnivåer), og dens mål, celle syklus hemmere p27 og p21, ble oppregulert. Disse molekylære effekter ikke ble etterlignet av stanse
Rala
,
RALB
, eller begge deler. Men
RALB
lyddemping forårsaket en beskjeden hemming av cellesyklusprogresjon, som i H1299 celler var assosiert med Cyclin D1 regulering. I konklusjonen,
RALGPS2
er innblandet i kontrollen av cellesyklusprogresjon og overlevelse i
in vitro
vekst av NSCLC cellelinjer. Denne funksjonen er i stor grad uavhengig av Ral GTPases og forbundet med modulering av Skp2, P27 og P21 cellesyklus regulatorer
Citation. O. Santos A, Parrini MC, Camonis J (2016) RalGPS2 er avgjørende for overlevelse og Cell Cycle Progresjon av lungekreft celler Uavhengig av sine etablerte Underlag Ral GTPases. PLoS ONE 11 (5): e0154840. doi: 10,1371 /journal.pone.0154840
Redaktør: David J. Reiner, Texas A M University Health Science Center, UNITED STATES
mottatt: 13 januar 2016; Godkjent: 20 april 2016; Publisert: 05.05.2016
Copyright: © 2016 O. Santos et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. AOS lønn ble støttet av en bevilgning fra «Fondation de France» (Ref Engt 2008005019, https://www.fondationdefrance.org/) og en fellesskap fra «Institut National de la Santé et de la recherche MEDICALE» (INSERM, https://www.inserm.fr/), Frankrike, som «Soutien pour la dannelse à la recherche translationnelle en cancérologie» (Convention n ° 201103) . arbeidet ble støttet med tilskudd fra «Fondation de France» (JC: Ref Engt 2008005019), «Association pour la Recherche sur le Cancer» (JC: SFI20111203931; MCP: SFI20121205710, https://www.fondation-arc.org /), «Ligue National contre le Cancer» (JC: RS12 /75-62, MCP: RS14 /75-54, https://www.ligue-cancer.net/), og ved Association Chris BOUILLOT (http: //bouillot-christelle.fr/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Ras-proteiner er små GTPases ofte mutert i menneskelig kreft. De har mange nedstrøms effektorer, inkludert de små GTPases «Ras-relatert protein Ral-A» (Rala) og «Ras-relatert protein Ral-B» (RalB), som aktiveres ved guanin nukleotid veksling Factors (RalGEF). Den RalGEF-Ral pathway fått spesiell oppmerksomhet etter funn som uttrykk for en mutant form av GTPase HRAS som spesifikt og utelukkende aktiverer denne signalveien er tilstrekkelig for Ras-indusert transformasjon av humane celler [1]. Det er seks Ral-spesifikke guanin nukleotid utvekslings faktorer. Fire av dem, Ral guanin nukleotid dissosiasjon stimulator (RalGDS), RAL guanin nukleotid dissosiasjon stimulatorer-lignende en, -lignende 2 og lignende 3 (RalGDS-lignende en, -lignende 2 og lignende 3 eller alternativt RGL1, RGL2 og RGL3), båtplass Ras-bindende områder og kan derfor direkte signal nedstrøms Ras proto-onkogener mot RAL GTPases. I tillegg Ral guanin nukleotid utveksling faktor med PH domene og SH3 domene-bindende motiv 1 (RalGPS1) og Ral guanin nukleotid utveksling faktor med PH domene og SH3 domene-bindende motiv 2 (RalGPS2) er to Ras-uavhengig RalGEF [2] . Ras-avhengige RalGEF (gjennomgått i [3]) er blitt studert mer enn Ras-uavhengig RalGEF, som kjente funksjoner er begrenset til cytokinese av HeLa-celler [4] og rotte feokromocytom differensiering i henhold til nervevekstfaktor stimulus [5]. I tillegg, til tross for omfattende arbeid med Rala og RalB GTPases bidrag til kreft hos mennesker [6], bare nylig sin rolle i lungekreft, ofte husing Ras onkogene mutasjoner, har blitt rapportert [7,8]. Likevel RalGEF rolle i menneskets ikke-småcellet lungekarsinom (NSCLC) er ukjent.
I dette arbeidet ble bidraget fra de seks RalGEF gener til human NSCLC celle overlevelse, spredning, og transformerte funksjoner undersøkt. Hovedstrategien var å systematisk taushet hver RalGEF hos NSCLC cellelinjer som bærer forskjellige Ras mutasjoner (tabell 1) og for å studere funksjonelle bidrag fra hver RalGEF genet. På denne måten kunne vi avdekke uante funksjoner av en bestemt RalGEF, den RalGPS2 protein i celleoverlevelse og G1-S cellesyklus fase overgang.
Materialer og metoder
Cell linjer og kultur
HeLa og menneske NSCLC cellelinjer H23, H1299, A549, og H838, var fra American Type Culture Collection (ATCC, katalognummer CCL-2, CRL-5800, CRL-5803, CCL -185, CRL-5844, henholdsvis) og ble dyrket i henhold til leverandørens anbefalinger. Den humane HeLa-cellelinjen ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) (GIBCO, ref. 41966-029 Invitrogen) supplert med 10% varme-inaktivert FBS, og 2 mM L-glutamin. NSCLC-cellelinjer ble dyrket i RPMI-Glutamax (GIBCO, ref. 61870-010, Invitrogen) supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS, MP Biomedicals, ref. 092 910 154), 4,5 g /l glucose (ref. G8769 , Sigma) og 1 mM natriumpyruvat (ref.15070-063, Invitrogen). Alle celler ble opprettholdt i eksponentiell vekstbetingelser ved 37 ° C i en fuktig atmosfære (90%), inneholdende 5% CO
2. Rutinemessig ble det ingen antibiotika tilsatt til kulturmediet og kulturer ble bekreftet å være fri for mycoplasma forurensning ved hjelp av polymerase kjedereaksjon (PCR) (VenorGeM Classic, ref. 11-1100).
Menneskelige embryoniske nyreceller som stabilt uttrykker tidlig regionen SV40, den katalytiske subenhet av telomerase hTERT HEK-HT (HekHT) og HEK-HT-Ras
G12V (HekRasV12) celler ble vennlig levert av Christopher Counter [9,10] og ble dyrket i DMEM supplert med 10 % varme-inaktivert FBS, 2 mM L-glutamin, og antibiotika for seleksjon (hygromycin 100 ug /ml neomycin 400 ug /ml, og i tilfelle av HekRasV12 også puromycin 0,5 ug /ml).
BEAS -2b og BZR ble kjøpt fra ATCC (katalognummer CRL-9609 og CRL-9483, henholdsvis) og ble dyrket i LHC-9 medium (GIBCO, ref. 12680-013, Invitrogen) i belagte plater (uten tilsatt BSA) . Beleggoppløsningen ble sammensatt av 0,01 mg /ml fibronektin (Sigma, ref. F0895, Sigma-Aldrich) og 0,03 mg /ml Collagen Type I (ref. 207 050 357, Institut de Biotech., Frankrike) i LHC Basal medium med 0,01 mg /ml BSA (Sigma). For å splitte celler, eller plating for eksperimenter, ble cellene løsnet ved hjelp Accutase Solution (SIGMA, ref. A6964, Sigma-Aldrich), sentrifugert og resuspendert i friskt medium.
siRNA oligonukleotider og transfeksjon av celler
siRNA ble stort sett kjøpt fra Eurogentec SA (Belgia) i form av avsaltes annealed tomannsboliger, enten tørre eller i løsning. Kontrollen siRNA sekvens (ON-TARGETplus Non-targeting siRNA # 1, heter Sint i forkortet form) ble alltid kjøpt fra Dharmacon, (Thermo Fisher Scientific, USA). Målsekvenser er beskrevet i tabell 2. -siRNA arkiv konsentrasjonene var alltid ble bekreftet ved å måle oppløsning absorbans ved 260 nm, ved hjelp av ekstinksjonskoeffisienten som beregnet av Dharmacon websted for hver siRNA hybrid (https://www.thermoscientificbio.com/custom- modifisert siRNA /), fortynnet i siRNA-buffer (300 mM KCl, 30 mM HEPES pH 7,5, 1,0 mM MgCl
2 -fra 5x buffer-oppløsning innkjøpt fra Dharmacon, USA) og alikvotert å minimalisere gjentatte fryse /tine sykluser. I noen forsøk bassenger sirnas ble anvendt, som besto i blandinger av ekvimolare mengder av 3 oligonukleotider.
siRNA oligonukleotider ble tilsatt til cellene i form av 5X lipoplexes fremstilt i OptiMem (Invitrogen) med en kommersielt transfeksjon reagens (Lipofectamine RNAiMAX, ref. 13778030, Invitrogen), å oppnå den endelige konsentrasjonen optimalisert for hver cellelinje (vanligvis 10 nM eller 12 nM). Forholdet mellom transfeksjon reagens for å siRNA var enten en pl: 10 pmol eller en pl: 12 pmol, i alle andre aspekter fremstilt i henhold til produsentens instruksjoner. Eksperimentelle forhold var optimalisert for hver cellelinje for å få minimum transfeksjon toksisiteten (forskjell mellom ubehandlet og Sint-behandlede celler) og maksimal positiv kontroll effekt (siPLK1).
Resazurin reduksjon assay
Celler ble platet kvelden før transfeksjon i 96-brønners-plater, ved den optimaliserte tetthet for hver cellelinje som garanteres under-konfluens på det siste tidspunkt. Ubehandlet, Sint og siPLK1 kontrollene var til stede på hver plate. Optimale betingelser var de hvor i gjennomsnitt den relative resazurin reduksjon av celler behandlet med SINT (ikke-målsøkende kontrollsekvens) var over 75%, og av celler behandlet med siPLK1 var 10% eller mindre. For transfeksjon, ble mediet erstattet med 64 mL av fersk komplett medium uten antibiotika og siRNA: Lipofectamine RNAiMax lipoplexes ble tilsatt i 16 pl til brønner i fire. Friskt medium ble tilsatt til brønnene i 24 eller 48 timer etter transfeksjon. På det siste tidspunkt (72 timer for Hela, 96h for A549, H1299, HekHT og HekRasV12, og 120h for H23-celler) medium ble erstattet med 200 ul RPMI uten fenol rød, inneholdende resazurin (SIGMA
®, Sigma-Aldrich Chemie GmbH) ved 10 ug /ml og inkubert ved 37 ° C i 2 h-4 timer. Fluorescens ble avlest med en plateavleser ved bølgelengder på 540 nm (eksitasjon) og 620 nm (emisjon), og resultatene ble uttrykt som prosentandel av det fluorescens-signalet fra ubehandlede celler etter bakgrunn subtraksjon.
Western blots
Celler ble sådd ut i 6-brønns plater over natten, og før transfeksjon ble mediet erstattet med 2 ml friskt komplett vekstmedium (uten antibiotika). Cellene ble behandlet med 0,5 ml 5X siRNA lipoplexes som beskrevet i forrige avsnitt. 48 timer til 96 timer etter transfeksjon ble cellene vasket med fosfatbuffer saltvannsoppløsning uten kalsium og lysert med Triton lyseringsbuffer (1% Triton X-100, 5 mM MgCl
2, 150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7,4) supplementert med proteaseinhibitorer cocktail tablett (ref. 11873580001 Roche) i henhold til standardprosedyrer, eller direkte lysert med 2X Laemmli buffer (Tris-HCl 62,5 mM, glycerol 15%, SDS 4%, bromfenolblått 0,01%, DTT 200 mM, pH 6,8) supplementert med fosfatase hemmere og kokt. Løselige proteinprøver fra Triton lysater ble kvantifisert ved anvendelse av BCA proteinanalysesett (Pierce, ref. 23 225, Thermo Scientific), og deretter fortynnet i lyseringsbuffer til den samme konsentrasjon mellom rørene, Laemmli-buffer tilsatt til 1X konsentrasjon, og kokt. Laemmli buffer lysatene ble kvantifisert ved hjelp av en turbidimetrisk Protein Kvantifisering analysen (ref. 740967,250, Machery-Nagel) og fortynnet til tilsvarende konsentrasjoner. Prøvene ble fylt på prefabrikerte (4-15% eller «noen kD» gradient polyakrylamidgeler, Bio-Rad) eller på nylig støpt 10 eller 12% polyakrylamidgeler. Etter elektroforese ble proteinene overført til et 0,2 uM nitrocellulosemembran overføring (Whatman). Følgende primære antistoffer og fortynninger ble brukt: mus anti-Adaptin α (ref 610502, BD Biosciences, 1:. 1000), mus anti-Rala (ref 610222, BD Biosciences, 1:. 1000), mus anti-Actin (ref . A5441, Sigma-Aldrich, 1: 10000), kanin anti-RalB (ref 3523, Cell Signaling, en. 500), mus anti spaltet PARP (ref 552597, BD Pharmingen, 1:. 1000), kanin anti-Cyclin D1 (ref 2922, Cell signalering. 1: 1000), mus anti-Cyclin D3 (ref 2936, Cell signalering. 1: 2000), mus anti-p21 (ref 2946, Cell signalering. 1: 1000), kanin anti-p27 (ref. sc-527, Santa Cruz, 1: 1000) (ref. sc-7164, Santa Cruz, 1: 1000), kanin anti-Skp2. Passende konjugerte sekundære antistoffer ble brukt enten for visualisering av blotter ved forbedret chemiluminescence deteksjon (Western Lightning
® Plus-ECL, PerkinElmer) eller licor Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR biovitenskap).
Kvantitativ real- tid revers-transkripsjon PCR
Celler ble belagt kvelden før transfeksjon og transfektert som beskrevet for Western blot analyse. På det angitte tidspunkt ble supernatanten fjernet og cellene ble lysert med 350 ul buffer RTL fra RNeasy
® Mini Kit (Qiagen GmbH, Hildon, Tyskland) med extemporaneously tilsatt beta-merkaptoetanol, og holdt ved -80 ° C. Total RNA ble isolert med RNeasy
® mini-kit, i henhold til produsentens instruksjoner, inkludert genomisk DNA eliminering. Absorbansen ved 260 nm, og 260 /230-260 /280 nm-forhold, ble benyttet for å kvantifisere og bestemme kvaliteten av den isolerte RNA. 1 pg RNA ble reverstranskribert ved hjelp av iScript
™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories) i henhold til produsentens protokoll. Kvantitativ revers-transkripsjon real-time PCR (qPCR) ble utført ved hjelp av enten spesifikke primere (kjøpes på Sigma Proligo, tabell 3) og SYBR Grønn PCR Master Mix (ref. 4367659, Applied Biosystems), eller TaqMan probe sett (Applied Biosystems, Table 4) og Taqman PCR Master Mix (Applied Biosystems). Reaksjonene ble utført i 25 pl (SYBR grønn) eller 20 ul (TaqMan) av endelige volumet med Chromo4 termosykler (Bio-Rad Laboratories). Annealing og forlengelse temperatur var 60 ° C og primere var på 300 nM. I SYBR grønn analyser smeltekurven protokollen ble startet umiddelbart etter forsterkning for å bekrefte spesifisiteten av reaksjonen. Prosentandelen av hvert mRNA ble beregnet ved Pfaffl metoden [11] med
Beta-2-mikroglobulin
som referanse genet. Primer effektivitet ble eksperimentelt bestemt fra kalibreringskurver som inngår i hvert fall i de tre første reaksjoner, og en gjennomsnittlig effektivitet verdi ble brukt de andre gangene.
trypanblått eksklusjon analysen
celler ble sådd ut i 6-brønns plater og transfektert med sirnas som beskrevet ovenfor. Ved hvert 24 timers intervall, ble begge supernatanter og cellene løsnet med trypsin og oppsamlet i koniske rør, sentrifugert, deretter ble cellene resuspendert i omtrent 0,7 ml friskt medium. Levedyktige og unviable celler ble automatisk regnet ved hjelp av Vi-Cell celleteller (Backman) som bestemmer cellenes levedyktighet ved trypan blå eksklusjon.
Anchorage uavhengig vekst
H1299 celler ble sådd ut i 6-brønners plater og transfektert med siRNA som beskrevet ovenfor. Den følgende dag (ca. 20 timer senere), ikke-klebrig 6-brønners plater (ubehandlede plast ytterligere belagt med 0,01% Pluronic, Sigma-Aldrich), ble belagt med 2 ml 0,75% lav smeltetemperatur agarose (Sigma-Aldrich), fremstilles ved å blande like volumer av 1,5% agarose fremstilt i vann og 2X komplett medium uten fenol rød, og til venstre for å størkne ved romtemperatur. Før bruk, ekstra lav smeltetemperatur agarose på 0,75% ble fremstilt og holdt i et vannbad ved 37 ° C. Celler ble samlet opp med Accutase, telles, fortynnet til samme konsentrasjon (25 000 /ml) og fordelt i 5 ml polypropylenrør (0,8 ml per rør). En porsjon av den samme cellesuspensjonen ble fordelt i parallell for å gjenskape brønner på hvite 96-brønners plater for å bekrefte inngang ved Celltiter Glo-analyse (ref. G7571, Promega). 3,2 ml av 0,75% agarose ble grundig, men nøye blandet med celler og 1 ml /brønn ble øyeblikkelig belagt i tre eksemplarer. Etter størkning av agarose, ble ekstra medium (uten fenolrødt) tilsatt til brønnene, platene ble overført til cellen inkubatoren og væskemedium i topp nøye erstattet hver 2-3 dager.
Etter 14 dager, ble mediet fjernet, og 0,3 ml av en 0,05% MTT-løsning i PBS ble tilsatt til hver brønn. Platene ble inkubert i 30 min til 1 time ved 37 ° C og deretter skannet med høy oppløsning (Epson Perfection V700 Photo) og kolonier telles ved hjelp av programvaren ImageJ.
Cellesyklus distribusjon og aktiv caspase-3 evaluering av flyt cytometri
Celler ble sådd ut i 12-brønners plater og transfektert med sirnas som beskrevet ovenfor. Ved 72 timer etter transfeksjon, ble supernatanter oppsamlet i 15 ml rør og lagt på is. Cellene ble høstet med Accutase og tilsatt til hver supernatant respektive rør. Rørene ble sentrifugert ved 4 ° C og cellepelletene ble resuspendert i PBS inneholdende 0,05% BSA. Celler ble fiksert og permeabilisert ved tilsetning av på forhånd avkjølt -20 ° C 70% etanol dråpevis til cellene, og deretter holdt i is i minst 30 min. Cellene ble vasket med PBS, deretter med PBS inneholdende 0,05% BSA, og resuspendert i 0,25 til 0,4 ml PBS inneholdende 0,05% BSA pluss propidiumjodid (50 ug /ml). RNase (5 ul av en lager-konsentrasjon på 10 mg /ml) og 6 ul av anti-aktiv caspase-3-antistoff (Ref 559341, BD Biosciences) ble tilsatt til 0,2 ml propidiumjodid-fargede celler i 5 ml FACS-rør, inkubert beskyttet mot lys ved romtemperatur i minst ca. 15 minutter og analysert ved flowcytometri (BD ™ LSRII, BD Biosciences) eller oppbevart ved 4 ° C og fikk sistnevnte på samme dag. Dataanalyser ble utført i tilfelle av aktiv caspase-3 med FlowJo Software (flojo, LLC) eller, i tilfelle av cellesyklusfordeling, med ModFit LT ™ (Verity Software hus).
Ral-GTP trekk- ned
Cellene ble sådd ut på 15 cm plater, og høstet mens cellemonolaget var mindre enn 70-80% sammenflytende. En plate hver gang, i kjølerommet, på is ble cellene vasket en gang med iskald PBS. Celler ble lysert med lyseringsbuffer (1 ml, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP40, Glyserol 15%, NaCl 200 mM, MgCl2 5 mM, supplementert med proteasehemmere) og lysater ble fjernet ved sentrifugering (2 min ved 10 000 rpm, i kaldt rom). Supernatantene ble alikvotert i 3 rør (for protein kvantifisering, inngangs- Western blots og pull-down eksperimenter), deretter umiddelbart hurtigfrosset i flytende nitrogen.
glutation magnetiske kuler (Pierce # 88822) ble vasket 3 ganger med 3 -gangers deres volum av vaskebuffer A (Tris * HCl 125 mM, pH 8, 150 mM NaCl, supplert før bruk med proteasehemmere), inkubert i 30 min til 1 time i den samme buffer på et roterende hjul ved 4 ° C med lysater fra
E
.
coli
celler som uttrykker GST-smeltet Ral bindende domene fra Sec5 (GST-Sec5-RBD, RBD blir det N-terminale 1-99 aa av Sec5) [12,13], og igjen vasket 3 ganger med Vaske buffer A. Deretter perler ble resuspendert i lyseringsbuffer og delt inn i ulike mikrorør (40 mikroliter perler seng per microtube).
Hver lysat ble tint og ønsket protein beløpet ble inkubert i 45 min til en time med GST -Sec5-RBD-perler på roterende hjul ved 4 ° C. Kulene ble deretter raskt vasket to ganger med 0.5 ml vaskebuffer B (25 mM Tris * HCl, NaCl 40 mM, MgCl2 30 mM, pH 7,5). Da 15 ul 2X Laemmli-prøvebuffer ble tilsatt perler, som så ble kokt 2 min, og umiddelbart frosset eller lastet på gel.
Diskusjon
RGL2, RGL3, RalGDS og RalGPS2
Resultater og er kreves for in vitro forankringsavhengige og forankrings-uavhengig cellepopulasjon vekst
Vi startet ved å evaluere nødvendigheten av hver av de seks RalGEF for
in vitro
proliferasjon og /eller overlevelse av fire human NSCLC cellelinjer som bærer forskjellige Ras mutasjoner (A549, H23, H1299, H838), sammenlignet med andre cellelinjer hvor Ral og RalGEF proteiner har blitt studert i det siste: HeLa (cervix cancer), HEK-HT-HRAS
G12V (transformert cellelinje, fra nå av navngitt HekRasV12) og dens isogene par HEK-HT (udødeliggjort cellelinje, heri også kalt HekHT) [10]. Detaljer på vev histologi og Ras mutasjon status for cellelinjer benyttet i dette arbeidet er gitt i Tabell 1.
Effektivitet av siRNA oligonukleotider mot RalGEF (to til tre sirnas pr genet) ble bekreftet ved qPCR (S1 Fig ): mål-mRNA-ekspresjon var under 30% av endogent nivå for alle siRNA-sekvenser, ved 72 timer etter transfeksjon, klare, i det minste i to uavhengige cellelinjer
metabolsk resazurin reduksjonen analyse ble anvendt for å måle celle. befolkningsvekst. For hver cellelinje, ble transfeksjon forhold og varighet av celledyrkningsperioden velges ved å forsikre: 1- celler som ikke nådde konfluens i løpet av analysen; 2- at den veksthemmende virkning av en ikke-målsøkende siRNA (Sint, den negative kontroll) var minimal ( 15-20%) sammenlignet med celler som ikke er fremlagt for transfeksjon (ubehandlede celler); og 3- at den veksthemmende virkning av et siRNA mot en positiv kontroll, (vi valgte polo-lignende kinase 1) var maksimal (≥ 90%). Ved hjelp av denne analysen, observerte vi at
RGL1 Hotell og
RalGPS1
mRNA lyddemping hadde ingen påviselig effekt på cellebefolkningsvekst (Fig 1A og 1E, henholdsvis), noe som tyder på at de er unnværlig for cellebefolkningsvekst , påvirker i det vesentlige ingen overlevelse eller proliferasjon i disse cellene. Imidlertid kan utholdenhet av disse to proteiner på grunn av høy proteinstabilitet ikke utelukkes, siden vi ikke kunne følge protein forfall over tid på grunn av utilgjengelighet av spesifikke antistoffer. Uttømming av RGL2, RGL3, eller RalGDS indusert delvis vekstinhibisjon (varierende 12-70% sammenlignet med sint, figur 1B, 1C og 1D). Interessant, stanse av Ras-genet uavhengig RalGEF
RALGPS2
induserte en meget sterk hemming av cellepopulasjonen vekst i alle NSCLC-cellelinjene som ble testet (opp til 90%, figur 1F). Dessuten var denne effekten ikke bestemt av NSCLC-cellelinjer, siden det ble observert også i cellelinjer med opphav i nyre (HekHT /HekRrasV12) og cervix (HeLa-celler), og i en ikke-transformert cellelinje (HekHT). Uavhengighet fra tilstedeværelsen av et aktivert Ras genet kan ha vært forventet for en Ras-uavhengig RalGEF.
(A-F) Cell befolkningsvekst i tilslutning ble målt ved hjelp av resazurin reduksjon analysen og uttrykkes i prosent av ubehandlede (ikke-transfekterte) celler (gjennomsnitt ± SEM,). Det ble evaluert fra 72 til 120 timer etter celle transfeksjon, avhengig av den optimaliserte betingelse for hver enkelt cellelinje. Hvert panel viser effekten av stanse en RalGEF med to eller tre uavhengige siRNA oligonukleotider: (A)
RGL1
; (B)
RGL2
; (C)
RGL3
; (D)
RALGDS
; (E)
RALGPS1
; (F)
RALGPS2
. Effekten av hver siRNA ble statistisk sammenlignet med effekten oppnås med SINT av to-veis ANOVA og Bonferroni posttester (*
p
≤ 0,05, **
p
≤ 0,01, ***
p
≤ 0,001;
n
= 2 til 4 middelverdier fra uavhengige eksperimenter, hver utført i fire brønner). (G) krings-uavhengig vekst av H1299-celler ble evaluert over 14 dager og er uttrykt som gjennomsnittlig relativ koloni tall med hensyn til Sint-behandlede celler. Data ble samlet inn fra uavhengige eksperimenter der siPLK1 (positiv kontroll) oppsto ingen eller svært få kolonier. (H) Illustrerende bilder av H1299 kolonier i agarose på 14 dager vekst etter Sint, siPLK1, siRalGPS2 # 231, og siRalGPS2 basseng, som indikert. Statistiske sammenligning ble gjort av Enveis ANOVA med Dunnetts posttest. (*
p
≤ 0,05, **
p
≤ 0,01, ***
p
≤ 0,001;
n
= 2 (siRGL1 og siRALGPS1 ), 3 (siRalGPS1 og siRalGPS2) eller 4 (siRGL2, siRGL3 og siRalGDS) uavhengige eksperimenter, hver utført i tre eksemplarer brønner.
Ordreantaludødeliggjorte celler, transformerte celler vise evne til å overleve og formere seg i forankringsuavhengig vekstvilkår. effekten av RalGEF uttømming i forankringsuavhengig vekst ble testet ved å score antall kolonier av H1299 celler i agarose jellified medium. Mens
RGL1 Hotell og
RALGPS1
stanse hadde fram ingen påviselig effekt,
RGL2
,
RGL3
,
RALGDS Hotell og
RALGPS2
transient stanse vesentlig hemmet forankringsuavhengig vekst av H1299 celler, parallelt observasjonene gjort i tilslutning forhold (figur 1G). det er interessant den hemmende effekten av
RGL3
og
RALGDS
stanse i forankringsuavhengig vekst er mer uttalt (ca. 75% hemming) enn den effekt som observeres på adherent celler (ca. 45% og 35% veksthemming). Siden
RALGPS2
stanse vist den sterkeste fenotype, alt videre arbeid rettet mot RalGPS2.
RalGPS2 er nødvendig for in vitro celleoverlevelse
Ved tømming av RalGPS2 en høy prosentandel av cellepopulasjon vises fenotypiske tegn på celledød: celler avrunding opp, løsner og blebbing (S2 fig). Videre trypanblått eksklusjon assay viste at sterk veksthemning ved dager 3 og 4 etter transfeksjon av H1299-celler (figur 2A) ble i det minste delvis på grunn av en 10 til 20% reduksjon av cellelevedyktighet (figur 2B). Derfor er RalGPS2 nødvendig for celleoverlevelse. Videre ble celler sannsynligvis døde ved apoptose, som angitt ved 10 til 15% økning i antall celler med aktiverte Caspase-3 som analysert ved flowcytometri på H1299-celler (figur 2C), og deteksjon av spaltet Poly [ADP-ribose ] polymeraser (PARP) i Western avsetninger av A549-celler (S3 fig). Den RalGPS2 uttømming-effekt på apoptose ble videre undersøkt i en HRAS
G12V onkogen sammenheng ved å stanse sitt uttrykk i isogen par bronkial cellelinjer BEAS-2B (udødeliggjort) og BZR (BEAS-2B uttrykker HRAS
G12V) . Interessant, Caspase-3-aktivering ved RalGPS2 uttømming i BZR celler var omtrent to ganger mer hyppig enn i isogene immortalisert human bronkial epitelcellelinje BEAS-2B (figur 2D). Dette resultatet tyder på HRAS
GV12 onkogen-indusert sensibilisering av celler til RalGPS2 for å overleve, selv om den globale effekten på cellepopulasjon, som vurderes av Resazurin reduksjon analysen, var lik (S4 figur), som for de andre isogen paret ( HekHT og HekRasV12, figur 1).
(A) antall levedyktige H1299 celler og (b) prosentandel av levedyktigheten etter induksjon av RalGPS2-uttømming ble oppnådd daglig i fire dager med trypanblått eksklusjon assay og statistisk sammenlignet med to-veis ANOVA og Bonferroni posttester (*
p
≤ 0,05, ***
p
≤ 0.001,
n
= 2 uavhengige eksperimenter, hver i tre eksemplarer ). (C) Andelen av celler som aktiv caspase-3 ble undersøkt 72 timer etter transfeksjon med siRalGPS2, ved strømningscytometri-analyse, på H1299-celler og (D) i isogene par av de udødeliggjort BEAS-2B og HRAS
G12V transformerte BZR celler. Statistisk signifikans ble evaluert henholdsvis ved enveis ANOVA med Dunnetts posttest, **
p
≤ 0,01 og ***
p
≤ 0.001,
n
= 4 eller 5 uavhengige eksperimenter (C); og to-veis ANOVA med Bonferroni posttest,
### p ≤ 0,001,
n
= 2 eller 3 uavhengige eksperimenter (D).
RALGPS2-silencing Effektene utover Rala og RalB
Deretter spurte vi i hvilken grad Ral proteiner er innblandet nedstrøms RalGPS2 i cellebefolkningsvekst og overlevelse.
Rala
lyddemping hadde ingen effekt på cellepopulasjon vekst (med unntak av en delvis 20% veksthemning i bare en cellelinje H1299, ut av de seks testes), mens ved RalB tømming var der en delvis inhibering av veksten i fem av seks cellelinjer som ble testet (24-38% bety forskjellen fra Sint, figur 3A), men mindre omfattende enn det som ble observert av stanse
RALGPS2
i de samme cellene (61-96% gjennomsnittlig forskjell fra Sint i lunge kreft cellelinjer, 41-62% gjennomsnittlig forskjell fra Sint i ikke-lunge kreft cellelinjer, figur 1F). Videre, i motsetning til den etablerte rolle RalB i celleoverlevelse [14], vi ikke observere apoptose ved RalB uttømming i hverken A549 eller H1299 lungecellelinjer, som analysert ved hjelp av Caspase-3-aktivering (figur 3B) og spaltet PARP (Fig 3C). Disse resultatene indikerer at befolkningen veksthemming indusert av
RALB
lyddemping var ikke på grunn av celledød, i hvert fall i disse to NSCLC cellelinjer, og hevet muligheten for at
RALB
lyddemping kan påvirke celle syklusprogresjon, som behandles i neste avsnitt.
(A) Cell befolkningsvekst ble evaluert i cellelinjer som er angitt i diagrammet ved Resazurin reduksjon 72-120 timer etter transfeksjon, og uttrykt som prosentandel av resazurin reduksjon relativt til ubehandlede celler. Effekten av hver siRNA ble statistisk sammenlignet med effekten oppnås med SINT (negativ kontroll) av to-veis ANOVA og Bonferroni posttester (*
p
≤ 0,05, **
p
≤ 0,01, ***
p
≤ 0,001;
n
= 2 eller 3 uavhengige eksperimenter, hver gjennomsnittet hentet fra kvadruplikeres brønner). (B) Caspase-3 aktivering ble evaluert ved flow cytometri-analyse 72 timer etter transfeksjon, og er uttrykt som prosentandel av cellepopulasjonen med positiv staning. Statistisk signifikans ble evaluert ved en-veis ANOVA med Dunnetts posttest, men ingen signifikans ble oppnådd (
n
= 3 uavhengige eksperimenter). (C) Western blot av det angitte cellelinjer og tidspunkter viser Rala og RalB protein downregulation, kløyvde Poly [ADP-ribose] polymeraser (kl. PARP) immundeteksjon og Actin eller Adaptin lasting kontroll.
Siste Theodorescu laboratorium arbeid viste at i lunge kreft cellelinjer effekten av stanse
Rala Hotell og /eller
RALB
er cellelinje avhengig, og trolig avhengig av hvilken type Ras mutasjon stede [7] . Konsekvent med denne celletype variasjon, kunne vi observere en moderat økning i kløyvet PARP på Western blot med HeLa og lungekreft H23 cellelinjer, men ikke med A549 og H1299 cellelinjer (figur 3C), noe som tyder på at celledød kan faktisk bidra til å
