Abstract
Kreft kakeksi er en ødeleggende tilstand karakterisert ved en kombinasjon av anoreksi, muskelsvinn, vekttap, og underernæring. Denne tilstanden påvirker en overveldende flertall av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen, og er en primær årsak til kreft-relaterte dødsfall. Men få, om noen, effektive behandlinger finnes for både behandling og forebygging av dette syndromet. For å utvikle nye terapeutiske strategier for kreft i bukspyttkjertelen kakeksi, egnede dyremodeller er nødvendig. I denne studien har vi utviklet og validert en syngene, metastatisk, murine modell av kreft i bukspyttkjertelen kakeksi. Ved å bruke vår modell, undersøkte vi muligheten for transformerende vekstfaktor beta (TGF-β) blokade for å dempe de metabolske endringer knyttet til kakeksi. Vi fant ut at TGF-β hemming hjelp av anti-TGF-β antistoff 1D11.16.8 betydelig forbedret total dødelighet, vekttap, fettmasse, lean body mass, bentetthet, og skjelettmuskel proteolyse hos mus skjuler avansert kreft i bukspyttkjertelen. Andre immunterapeutiske strategier vi ansatt var ikke effektive. Kollektivt, vi validert en forenklet, men nyttig modell for kreft i bukspyttkjertelen kakeksi å undersøke immunologiske behandlingsstrategier. I tillegg viste vi at TGF-β hemming kan redusere de metabolske endringer knyttet til kreft kakeksi og bedre total overlevelse
Citation. Greco SH, Tomkötter L, Vahle AK, Rokosh R, Avanzi A, Mahmood SK, et al. (2015) TGF-β-blokkaden reduserer dødeligheten og metabolske forandringer i en validert Murine modell av kreft i bukspyttkjertelen kakeksi. PLoS ONE 10 (7): e0132786. doi: 10,1371 /journal.pone.0132786
Redaktør: Ajay Pratap Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, USA
mottatt: 21 november 2014; Godkjent: 18 juni 2015; Publisert: 14.07.2015
Copyright: © 2015 Greco et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet i deler av tilskudd fra Amerika i lever og galle bukspyttkjertelen Association (SHG), den tyske Research Foundation (LT), Nasjonalt institutt for Helse Awards CA155649 (GM), og CA168611 (GM), og tyske Cancer Aid (AKV)
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDA) er en aggressiv gastrointestinal kreft, med en fem-års overlevelse på mindre enn 5% [1]. Flertallet av pasienter med PDA til stede med avansert metastatisk sykdom og har en median overlevelse på bare 3-6 måneder [2, 3]. Dødelighet og dårlig livskvalitet hos disse pasientene er knyttet til de betydelige metabolske og ernærings derangements forbundet med kreft kakeksi syndrom. Dette syndromet er tilstede i opptil 80% av PDA pasienter og utgjør opptil 22% av alle kreftrelaterte dødsfall [4-6].
Et fremtredende trekk ved kakeksi er utvikling av utilsiktet vekttap på minst 5% av kroppsvekt [7]. Den samtidige tap av både lean body mass og fettmasse skiller kakeksi fra sult, der muskelmasse er i utgangspunktet bevart. Kreft kakeksi omfatter en rekke metabolske derangements inkludert øket stoffskifte-inklusive endringer i protein, fett og glukose metabolisme og-immunsuppresjon med økt frigjøring av proinflammatoriske cytokiner og akuttfaseproteiner [6]. I tillegg nevropsykologiske effekter av kakeksi er tretthet, svekket hukommelse og kognisjon, og redusert fysisk aktivitet sekundært til økt hvile energiforbruk [8, 9]. Sammen er disse derangements redusere livskvaliteten i cachectic pasienter og kan selv bidra til en redusert terapeutisk respons på kjemoterapi [10].
Dessverre er det få evidensbaserte effektive behandlingsstrategier for kreft kakeksi. Fordi denne sykdommen prosessen omfatter en rekke verts ubalanser, bør effektive behandlinger ideelt målrette flere metabolske veier. Kakeksi er blitt behandlet med bruk av progestiner som megestrolacetat og medroksyprogesteronacetat for å øke appetitt og vektøkning sammen med kortikosteroider for å forbedre humøret og redusere inflammasjon [11, 12]. Imidlertid har de kliniske nytten av disse behandlingene vært marginal [11, 13]. Andre potensielle terapeutiske midler som har blitt studert omfatte cyklooksygenase (COX-2) inhibitorer og investigational legemidler inkludert ghrelin og ghrelin-mimetika, kombinerte tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) og interleukin 6 (IL-6) inhibitorer, så vel som β- adrenoceptor-agonister og myostatininhibitorer [6]. Imidlertid har effektive kliniske resultater i kreftkakeksi pasienter vært unnvikende.
Godkjente dyremodeller av kreft i bukspyttkjertelen kakeksi er nødvendig for å utvikle effektive immunterapi baserte behandlingsstrategier. Kakeksi-induserende cellelinjer så som Lewis lungekarsinom (LLC) og kolorektale tumorer har blitt brukt mye i dyremodeller for kreft kakeksi [4, 14]. Disse tumorlinjer ble implantert subkutant i forsøksdyr og får lov til å vokse inntil symptomene på kakeksi er oppnådd. Slike Heterotop modeller har også blitt benyttet for å studere kakeksi i PDA [15, 16]. Imidlertid er en hovedbegrensning av disse modellene er deres manglende evne til å metastasere [17]. Xenograft-modeller av human PDA PDA hvori humane cellelinjer er implantert i atymiske mus eller immunsuppresjon er også blitt anvendt [17]. Men selv om xenograft modeller effektivt ligne svulst /verts epigenetikk og kan metastasere, de markert endre immunologiske miljøet og dermed hindre muligheten til å studere immunologiske endringer knyttet til kakeksi samt og eventuelle immunterapeutiske strategier [17, 18].
Potensielle immunologiske mål for kakeksi behandling i PDA, inkluderer Toll-lignende reseptorer (TLR) og transformerende vekstfaktor beta (TGF-β). Toll-lignende reseptorer er en familie på mønstergjenkjenning reseptorer på medfødte immunceller som kobles direkte miljømessige stimuli til medfødte inflammatoriske responser [19]. TLR’ene kan aktiveres ved ligering av ikke-patogene «fare» molekyler, kjent som demper, inkludert biprodukter av inflammatorisk skade cellulær nekrose og [20, 21]. TLRs har vært innblandet å spille en betydelig rolle i PDA, som vår lab har nylig vist at TLR7 ligation akselererer bukspyttkjertelen kreftutvikling, og at TLR7 blokaden beskyttet mot tumorprogresjon [22]. I tillegg har TLR9 stimulering blitt korrelert med invasive og metastatiske potensiale av human PDA, hvilket peker på denne reseptoren som potensielt mål ved behandling av denne sykdom [23]. Imidlertid, så vidt vi vet hverken TLR7 eller TLR9 er blitt studert i behandling av kreft i bukspyttkjertelen kakeksi.
transformerende vekstfaktor beta (TGF-β) reaksjonsvei spiller en viktig rolle i celledifferensiering og inflammasjon [24]. TGF-β reseptoraktivering fører til fosforylering av proteiner, inkludert Smad Smad2, Smad3, og Smad4, som i sin tur regulerer transkripsjon av cellesyklus inhibitorer, inkludert p21 [25]. I PDA, har TGF-β paradoksalt blitt vist å virke både som en tumor suppressor og tumor-promotoren [26]. TGF-β kan hemme spredning, undertrykke transformasjon, og redusere PDA progresjon [27]. Men på samme tid TGF-β blokade kan redusere invasivitet av PDA [28]. Ikke desto mindre, mutasjoner i nedstrømsmediatorer av TGF-β signalering, inkludert Smad4 har vist seg å fremme PDA progresjon [29]. Videre, selv om TGF-β har vært implisert å fremme kreft kakeksi [30, 31], så vidt vi vet, TGF-β blokade har ikke blitt undersøkt som et terapeutisk strategi ved behandling av kreft i bukspyttkjertelen cachexia. Hensikten med denne studien var å utvikle en syngene metastatisk modell av kreft i bukspyttkjertelen kakeksi og å undersøke immunterapeutiske behandlingsstrategier, inkludert TLR 7/9 blokade og TGF-β-blokade.
Materialer og metoder
dyr, cellelinjer, og in vivo eksperimenter
Mann C57BL /6 (H-2k
b) og Toll-like receptor 9 knockout (TLR9
– /-) mus ble kjøpt fra Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Pdx1
Cre; Kras
LSL-G12D; TP53
R172H (KPC) mus var en gave fra Mark Phillips (New York University) [32]. Dyrene ble avlet i huset og tilsvarende alder 6-8 uker gamle mus ble benyttet for alle eksperimentene. Den Pan02 murine PDA cellelinje (gave fra Daniel Meruelo, New York University), som er syngeniske til C57BL /6, ble dyrket i komplett RPMI-dyrkningsmedium supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin. FC1242 PDA tumor celler avledet fra KPC mus var en gave fra David Tuveson (Cold Spring Harbor Laboratory). Mus ble injisert i.p. med enten 10 millioner Pan02 eller 5 millioner FC1242 celler for å indusere kreft kakeksi syndrom. Valgte kullene i tillegg ble administrert 2,6 mg /kg av de Toll-lignende reseptor 7 og 9 (TLR7 /9) inhibitor IRS 954 (Dynavax, Berkeley, CA), tre ganger ukentlig, eller 200 ug transformerende vekstfaktor beta (TGF-β) inhibitor (klone 1D11.16.8 hemmer TGF β
1, β
2, og β
3) (Bioxcell, West Lebanon, NH) to ganger ukentlig, og begynner umiddelbart etter inokulering med Pan02 og fortsetter for varigheten av forsøket. Dyrene ble overvåket daglig to ganger. Mus ble avlivet med CO2-narkose, etterfulgt av cervikal dislokasjon ved slutten av den 60-dagers studieperioden, eller tidligere hvis de først døende eller oppviste større enn 20% vekttap. For å indusere subkutan tumor vekst, ble musene injisert i den høyre flanke med 10 millioner Pan02 celler. Tumorveksten ble målt ved anvendelse av en skyvelære to ganger per uke. Nivåer av cytokiner i serum ble bestemt ved hjelp av en cytometrisk perle array (BD Biosciences). The New York University School of Medicine IACUC godkjent alle prosedyrer
Måling av vekt og kroppssammensetning
Vekt og kroppssammensetning inkludert. Fettmasse, fettfri masse,% kroppsfett, bone mineral innhold, og beinmineraltetthet ble målt ukentlig ved hjelp av dual-energy x-ray absorpsjonsmetri (DEXA) med Lunar PIXImus (PIXImus, Fitchburg, WI) enhet for små dyr. Alle mus ble bedøvet før DEXA innsamling av data ved bruk av 0,1 mg /g Ketamin og 0,01 mg /g xylazin ved i.p. injeksjon. Data ble analysert ved hjelp av Lunar PIXImus programvareversjon 1.45. Arm omkrets ble beregnet som 3,14 ganger den øvre arm diameter, som målt ved hjelp av en skyvelære med nøyaktighet ± 0,1 mm. Subscapular skinfold tykkelse ble også målt ved hjelp av en caliper.
Western blotting og immunhistokjemi
For Western blotting, ble total protein isolert fra mus quadriceps eller fettvev ved homogenisering i RIPA buffer med komplett proteasehemmer cocktail og fosfatase inhibitor cocktail (Roche, Pleasanton, CA) [33]. Protein kvantifisering ble bestemt ved Bradford proteinanalyse, og prøver ble likt lastet på 10% polyakrylamidgeler (NuPage, Grand Island, NY), elektroforese ved 200V, elektrooverført til PVDF-membraner, og probet med antistoffer mot Atrogin-en (1: 500 ; ECM Biosciences, Versailles, KY), myostatin (1: 200; Abcam, Cambridge, MA), MuRF1, ZAG (1: 500, som begge Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas), p21 (1: 200, Santa Cruz), β-aktin, Smad2, p-Smad2 /3 (1: 1000; alle cellesignalisering, Danvers, MA), TGF-β (1: 1000; Abcam), og ezrin (1: 1000; BD Transduction Laboratories, San Jose, CA). Kvantifisering ble utført ved å måle integrert tetthet og normalisering til lasting kontroller. For immunhistokjemisk analyse, ble parafininnstøpte vevssnitt farvet ved anvendelse av polyklonale anti-TGF-β (1: 100; Abcam, Cambridge, MA), anti-P21 (1: 100, Santa Cruz), eller anti p-Smad 2/3 (01:50, Santa Cruz) og de tilsvarende isotype kontroller [33].
qPCR og cellulær proliferasjon analysen
For PCR-analyse, total RNA ble isolert ved hjelp av RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD) og cDNA ble gjort ved hjelp av High Capacity Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Grand Island, New York). RT-PCR ble utført på en Stratagene Mx3005P QPCR system (Agilent Technologies) ved hjelp av pre-designet primere for mus MuRF1 og Atrogin-en (begge Qiagen, Germantown, MD) [34]. In vitro tumor celleproliferasjon ble vurdert ved hjelp av XTT II-analyse i henhold til produsentens protokoll (Cell Proliferation Kit II, Roche, Pleasanton, CA) og uttrykt som% spredning i forhold til kontroll (100%).
nevrokognitiv Analyser
for rotarod testen, dyrene ble plassert på en stang (diameter 3,6 cm) apparat for å vurdere forskjeller i motorisk koordinasjon og balanse ved å måle forbena og bakbena motorisk koordinasjon og balanse (Rotarod 7650 akselererende modell, Ugo Basile, Varese , Italia) som vi har tidligere beskrevet [35]. Hvert dyr ble testet i tre sesjoner, og hver sesjon adskilt av 15 min, og tiltak ble tatt for rotarod hastighet når dyrene falt ned fra toppen av den roterende sylinderen.
spontan gjenstand gjenkjennelse test (ORT) var gjennomført i et firkantet åpent felt boks, hevet 50 cm fra gulvet som vi har beskrevet tidligere [35]. To nye gjenstander ble plassert på diagonale hjørner i det åpne feltet og dyret fikk lov til å lete etter 15 min. For enhver rettssak, objektene i et par var 10 cm høy og består av samme materiale, slik at de ikke kunne lett bli preget av olfactory signaler. Tidsbruk utforske hvert objekt ble registrert av et sporingssystem (San Diego Instruments, San Diego, CA), og på slutten av treningsfasen musen ble fjernet fra boksen for varigheten av oppbevaring forsinkelse (3 timer). Under oppbevaring tester ble dyrene plassert tilbake i samme eske, i hvilken en av de tidligere kjente gjenstander som anvendes under trening ble erstattet av en ny gjenstand, og fikk anledning til å utforske fritt i 6 min. En annen gjenstand par ble brukt for hvert forsøk for et gitt dyr, og rekkefølgen av eksponering til objekt parene samt utpekt prøven og nye objekter for hvert par ble motvekts innenfor og på tvers av grupper. Tidsbruk utforske nye og kjente gjenstander ble registrert for 6 min. Objektet anerkjennelse test indeksen ble beregnet som forholdet mellom tidsbruk utforske romanen objektet til tidsbruk utforske både romanen og kjent gjenstand.
statistikker
Data presentert som gjennomsnitt ± standardfeil . Overlevelse ble målt ifølge Kaplan-Meier-metoden. Statistisk signifikans ble bestemt av Student
t
test og log-rank test med GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, CA). P-verdier. 0,05 ble vurdert som signifikante
Resultater
Utvikling av en syngene modell av avansert kreft i bukspyttkjertelen
Mus administreres Pan02 PDA celler ved ip injeksjon utviklet overt peritoneal karsinomatose (fig 1 A) med implantater på peritoneale overflater, inkludert tynntarmen mesenteriet samt mikroskopiske levermetastaser (fig 1B) i løpet av tre uker etter behandling. Disse resultatene korrelerer med avansert PDA hos mennesker, som er forbundet med lever og /eller peritoneale metastaser i nesten alle tilfeller [36]. Omtrent 75% av Pan02-behandlede dyr døde innen 45 dager etter behandling (figur 1C). Videre, i samsvar med PDA kakeksi syndrom, Pan02-behandlede mus oppviste progressivt vekttap som begynner omtrent 2 uker etter tumor-utfordring (Fig 1 D).
(A) Mus tilført Pan02 oppviste grovt og (B) mikroskop bevis for peritoneal karsinomatose samt mikroskopiske lever implantater. Representative bilder og sammendragsdata vises. (C) Kaplan-Meier analyse av overlevelse ble utført i PBS og Pan02 behandlet dyr (n = 20 /gruppe, p 0,05). (D) De gjennomsnittlige kroppsvekt av mus kullene behandlet med PBS eller Pan02 ble beregnet ved forskjellige tidspunkter som var den totale vektendring i løpet av studien (n = 20, * p 0,05, *** p 0,001) .
Bevis av endret kroppssammensetning
klinisk kreft i bukspyttkjertelen kakeksi er assosiert ikke bare med vekttap, men også med tap av fett, muskler og bein innhold [6, 37] . Følgelig har vi funnet at Pan02-behandlede mus tapte nesten 1 g i fettmasse etter 24 dager (figur 2A), og hadde betydelig redusert kroppsfett prosent sammenlignet med kontrollmus (Figur 2B). Tumor-bærende mus viste også lavere mager kroppsmasse (figur 2C), og reduserte økninger i begge beinmineralinnhold (figur 2D) og benmineraltetthet sammenlignet med kontrollmus (figur 2E). For ytterligere å kvantifisere kroppssammensetningsendringer, målte vi overarmen omkrets (Fig 2F) og subscapular skinfold tykkelse (figur 2G), og fant både for å bli markert redusert i Pan02-behandlede mus. Samlet utgjør disse funnene korrelerer med de metabolske endringer knyttet til klinisk kreft i bukspyttkjertelen kakeksi syndrom.
(A) Gjennomsnittlig fettmasse B) og gjennomsnittlig prosent kroppsfett muse kohorter behandlet med PBS eller Pan02 ble beregnet på ulike tidspunkt påpeker samt total forandring i løpet av studien. (C) Endringer i lean mass, (D) bone mineral innhold, (E) bone mineral density, (F) arm omkrets, og (G) skinfold tykkelse ble også beregnet (n = 20; * p 0,05, ** p 0,001)
Bevis på muskelatrofi og inflammatoriske forandringer
Siden proteolyse og muskelatrofi er kjennetegnene ved menneskelig kreft i bukspyttkjertelen kakeksi [38], vi målt markører for muskelatrofi i begge Pan02-behandlede mus og kontroll mus. Både atrogin-en og Murf-en er E3 ubiquitin ligaser uttrykt i skjelettmuskulatur som målrette proteiner for proteolyse [39, 40] .Vi fant økt intramuskulære nivåer av atrogin-en (figur 3A) og Murf-en (figur 3B) i tumorbærende mus ved qPCR. Western blotting bekreftet disse resultatene og i tillegg viste forhøyet muskulær uttrykk for myostatin i behandlede dyr (Fig 3C), som tyder på intramuskulær proteolyse [41]. Tilsvarende, sink alfa glykoprotein (ZAG), en markør for lipolyse, ble også markert forhøyet i fettvev av Pan02-behandlede mus (figur 3D). I samsvar med et proteolytisk tilstand, quadriceps vekt var lavere i tumorbærende mus (Fig 3E). Pasienter med fremskreden kreft i bukspyttkjertelen-kakeksi som vanligvis oppviser forhøyede pro-inflammatoriske cytokiner, som er forbundet med dårlig overlevelse [42, 43]. Følgelig, ble nivåene av MCP-1 og IL-6 forhøyet i serum fra tumorbærende verter (figur 3F).
(A) mRNA-nivåene av Atrogin-1 og (B) MuRF1 i quadriceps musklene mus behandlet med PBS eller Pan02 ble beregnet ved qPCR. (C) På tilsvarende måte nivåer av Atrogin-1, myostatin, MuRF1, og β-aktin i quadriceps muskelen ble beregnet ved Western blotting. (D) ZAG uttrykk ble testet i visceral fettvev fra årskull av mus behandlet med enten PBS eller Pan02. (E) Vekt av quadriceps muskler fra mus kullene som ble behandlet med PBS eller Pan02 ble beregnet. (F) Serumnivåer av MCP-1 og IL-6 ble sammenlignet i PBS og Pan02-behandlede mus (n = 5; * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001)
.
Kombinert TLR7 /9 hemming ikke redusere bukspyttkjertelkreft kakeksi
Vi har tidligere rapportert at Toll-like receptor (TLR) ligation akselererer bukspyttkjertelkreft progresjon mens blokade av utvalgte TLR signalveier kan være beskyttende [ ,,,0],22, 44]. Derfor postulerte vi at TLR-inhibering kan være beskyttende mot kreft i bukspyttkjertelen kakeksi. For å teste dette, ble musene behandlet med IRS 954, en kombinasjon TLR7 /9 oligonucliotide hemmer [45]. Som forventet, valgte serumcytokinene var lavere i IRS 954 behandlede mus (figur 4A). Imidlertid dyr behandlet med Pan02 + IRS 954 hadde et lignende samlet overlevelse sammenlignet med mus behandlet med Pan02 alene (figur 4B). Dessuten var det ingen signifikante forskjeller i kumulativ vekttap (fig 4C), endringer i lean body mass (Fig 4D), fettmasse (figur 4E), arm omkrets og skinfold tykkelse (figur 4F), eller beinmineraltetthet (fig 4G ) mellom de behandlede og kontrollgruppene. Men IRS 954-behandlede tumor-bærende mus har høyere beinmineralinnhold enn ubehandlede tumorbærende mus (Fig 4H). Genetisk sletting av TLR9 var tilsvarende ineffektivt på å lindre kreft i bukspyttkjertelen kakeksi i Pan02-challanged dyr (S1 Fig). Til sammen våre eksperimenter som anvender selektiv eller kombinert TLR hemming ikke substansielt bedre eksperimentell kreft i bukspyttkjertelen kakeksi
(A) Mus ble behandlet med Pan02 eller Pan02 + IRS 954 og testet for serumcytokinene (n = 20;. * p 0,05) og (B) overlevelse ved hjelp av Kaplan-Meier-metoden (n = 20, p = ns). (C) På tilsvarende måte ble mus behandlet med PBS, IRS 954, Pan02, eller Pan02 + IRS 954 og testet med hensyn til total vektendring, og forandringer i (D) mager masse, (E) fettmassen, (F) arm omkrets og skinfold tykkelse, (G) benmineraltetthet, (H) og benmineralinnhold (n = 20 /gruppe, * p 0,05).
Behandling med TGF-β inhibitor beskytter mot kreft i bukspyttkjertelen kakeksi
TGF-β superfamilien spiller en viktig rolle i immunresponser tumor [46]. TGF-β har også vært innblandet i kakeksi ved å stimulere muskel sammenbrudd og proteolyse [47]. Imidlertid har rettet mot TGF-β i kreft i bukspyttkjertelen kakeksi ikke testet. Vi har derfor bestemmes først om TGF-β blokade var relevant i vår bukspyttkjertelkreft kakeksimodell. TGF-β og nedstrøms transkripsjoner faktor p21 og p-Smad 2/3 ble sterkt uttrykt ved Pan02 tumorer, så vel som i modeller av endogene avansert murine bukspyttkjertelkreft (S2 Fig). Vi har bekreftet at mus som bærer Pan02 tumorer behandlet med en nøytraliserende TGF-β mAb (1D11.16.8) oppviste lavere serumnivåer av TGF-β (figur 5A), så vel som lavere nivåer av TGF-β og nedstrøms signalisering markør p-SMAD2 /3 i skjelettmuskel (figur 5B). Videre behandling av Pan02 tumorceller med 1D11.16.8 endret ikke deres celleformering in vitro (figur 5C) eller subkutan tumorvekst in vivo (figur 5D). Til slutt fant vi at behandling av mus med 1D11.16.8 alene i ikke-tumorbærende verter endret ikke vektendring, lean body mass, fettmasse, arm omkrets, eller beinmineraltetthet (S3 figur).
(A) Serum-nivåer av TGF-β ble målt hos mus behandlet med Pan02, Pan02 + 1D11.16.8, eller PBS + ID11.16.8 (n = 10 /gruppe, * p 0,05). (B) Intramuskulære nivåer av Smad2, p-Smad2 /3, TGF-β, og ezrin (en laste kontroll) ble beregnet ved Western blotting. Tetthet analyse ble gjort basert på tre paralleller (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001). (C) Pan02 celleproliferasjon ble målt etter behandling med økende doser av 1D11.16.8. (D) 10
7 Pan02 celler ble implantert subkutant i høyre flanke av mus behandlet med enten PBS eller 1D11.16.8. Svulster ble målt to ganger ukentlig med caliper og eksplanterte svulster ble sammenlignet for tumorstørrelse (n = 5 /gruppe).
Deretter undersøkte vi om farmakologisk blokade av TGF-β kan redusere kreft i bukspyttkjertelen kakeksi. Mus behandlet med Pan02 + 1D11.16.8 vist forbedret overlevelse (figur 6A) og betydelig mindre vekttap (figur 6B) sammenlignet med kontrollmus. Tumorbærende mus behandlet med 1D11.16.8 hadde også høyere fettmasse (figur 6C), skinfold tykkelse (figur 6D), og benmineraltetthet (figur 6E) sammenlignet med kontroller. Videre har vi funnet signifikant redusert bevis for proteolyse hos mus behandlet med 1D11.16.8, noe som gjenspeiles ved en merkbar forskjell i kropps kontur sammenlignet med kontrollmus (Figur 6F). Følgelig er det var markert svekket reduksjon i mager kroppsmasse hos mus behandlet med 1D11.16.8 (figur 6G). I tillegg også bekreftet vi at 1D11.16.8 demper effektivt bukspyttkjertelkreft kakeksi hjelp KPC-avledet FC1242 celler. Vi fant spesielt at FC1242 mus behandlet med 1D11.16.8 også hadde forbedret total overlevelse, redusert fettmasse tap, høyere bentetthet og redusert tap av fettprosent i forhold til å styre mus (S4 figur).
(A) Mus ble behandlet med Pan02 eller Pan02 + 11D1.16.8 og testet for å overleve ved hjelp av Kaplan-Meier analyse. (B) årskull av mus ble også testet for vektendring, og endringer i (C) fettmasse, (D) skinfold tykkelse, eller (E) benmineraltetthet (n = 10 /gruppe; * p 0,05, ** p * p 0,05).
kakeksi kan assosieres med motorisk og kognitiv dysfunksjon [48]. På vurdering av motor verdifall bemerket vi forbedret funksjon i tumorbærende mus behandlet med TGF-β inhibitor målt ved høyere rotarod løpehastigheten sammenlignet med mus administrert Pan02 alene. Motsatt, gjorde liten forbedring i objektet anerkjennelse test i Pan02 bærende mus som ble behandlet med 1D11.16.8 ikke statistisk signifikant (S5 fig). Sammen er disse data tyder på at målgruppe TGF-β er en attraktiv strategi for å målrette kreft i bukspyttkjertelen kakeksi.
Diskusjoner
Vi validert en syngene murine modell av metastatisk PDA kakeksi gjennom peritoneal injeksjon av Pan02 cellen linje. Mus utviklet tegn på metastaser og peritoneal lever implantater, som korresponderer med klinisk PDA [1]. I tillegg suksessrate på denne modellen er nær 100% med nesten alle Pan02-behandlede mus utvikle kreft kakeksi syndrom som dokumentert av betydelig vekttap, redusert fett og lean body mass, proteolyse og lipolyse.
I denne studien, viser vi at verken genetisk sletting av TLR9 eller blokade av TLR7 /9 bruker IRS 954 vesentlig endret de metabolske endringer knyttet til kreft i bukspyttkjertelen kakeksi. Så vidt vi vet er dette den første studien som spesifikt undersøke effekten av TLR blokade for behandling av kakeksi i PDA, selv om vi og andre har tidligere vist at TLR’ene spiller en viktig rolle i patogenesen av kreft i bukspyttkjertelen [49]. For eksempel, Schwartz et al. viste at TLR3 ble konstitutivt uttrykt i humane bukspyttkjertelen kreft cellelinjer, og TLR blokade med phenylmethimazole hemmet kreft i bukspyttkjertelen tumorvekst in vivo [26]. I tillegg har LPS-aktivering av TLR4 /MyD88 signale vist seg å spille en viktig rolle i bukspyttkjertelkreft tumorvekst og migrasjon, og blokkering av denne reaksjonsvei reduseres tumor invasive egenskaper [29]. Videre har vår lab tidligere vist at aktivering av TLR4 og TLR7 akselererer bukspyttkjertelkreftutvikling [22, 50]. Andre har vist at TLR9 korrelerer med invasiv og metastatisk potensial av menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer [23].
Basert på de nevnte data og det faktum at TLRs er sentrale formidlere av pro-inflammatoriske cytokin produksjon, inkludert TNF -α og IL-6, som spiller en viktig rolle i patogenesen av kreft kakeksi [43, 51], hypotese vi at TLR blokade kan være terapeutisk i bukspyttkjertelkreft kakeksi. Cytokinene utgitt etter TLR aktivering kan teoretisk bidra til kreft kakeksi syndrom ved å fremkalle proteolyse, lipolyse, og andre metabolske forandringer gjennom NF-κβ transkripsjon [52]. Ved avansert kreft i bukspyttkjertelen, er pro-inflammatoriske cytokiner produsert fra kreftcellene selv, så vel som i leveren som en del av den akutte fase respons. Interessant, økte cytokinnivåer antatt å være dårlige prognostiske faktorer i kakeksi, som undersøkelser har vist at IL-6 polymorfismer og forhøyede nivåer av IL-6 er assosiert med økt kakeksi og minsket overlevelse i bukspyttkjertelcancerpasienter [53]. Vår modell for kreft i bukspyttkjertelen kakeksi var forbundet med markert økning i serum nivåer av IL-6. Imidlertid, IL-6 forble forhøyet etter TLR7 /9 blokade. Enda viktigere, verken TLR7 /9 blokade eller genetisk sletting av TLR9 forbedret total dødelighet eller metabolske forandringer i bukspyttkjertelen kakeksi i vår validert musemodell. Disse negative funnene kan tyde på at ytterligere nedstrøms målretting av Toll-like receptor trasé, som NF-κβ signalering, er pålagt å påvirke effekten av kakeksi.
De fleste kritisk, har vi funnet ut at mus behandlet med TGF-β inhibitor hadde forbedret total overlevelse og var beskyttet mot kreft kakeksi målt ved vekttap, lean body mass, fettmasse, skinfold tykkelse, og bentetthet. Vi viste også at behandling med 1D11.16.8 redusert proteolyse og indusert begrenset forbedring i nevrokognitiv forstyrrelse i vår Pan02 musemodell, som dokumentert av redusert muskelmasse og bedre score i rotarod løpehastigheten. Faktisk nevrokognitive svekkelser er godt beskrevet i cachectic pasienter [48, 54, 55]. Videre viste vi at effekten av TGF-β blokade på kakeksi er ikke spesifikke for tumor Pan02 verter, siden vi bekreftet våre resultater i et KPC-avledet PDA dyremodell.
TGF-β superfamilien, inkludert TGF -β
1, TGF-β
2, og TGF-β
3, er involvert i diverse cellulære prosesser, inkludert cellevekst og differensiering, angiogenese, immunsuppresjon, apoptose, og cellulær homeostase [25]. I tillegg spiller TGF-β en viktig rolle i tumor suppresjon gjennom hemming av celleveksten ved å indusere cellesyklus-inhibitor, p21 [56]. De Smad proteiner, er den største familien av transkripsjonsfaktorer som forplanter TGF-β signalering. Den Smad familien består av R-Smads, Smad 2 og Smad 3 som etter fosforylering, forbinder med Co-Smad, Smad 4, og inn i kjernen for å aktivere transkripsjon [26]. Interessant, vi viste at både p21 og Smad 2/3 var svært oppregulert i begge våre Pan02 og KPC transgen musemodeller av kreft i bukspyttkjertelen. Men vi fant at effekten av TGF-β-hemming på kakeksi ikke var relatert til hemming av tumorvekst, som dokumentert av ingen forskjell in vitro Pan02 celleproliferasjon eller subkutan tumorvekst.
Vår studie legger til et vell av forskning som undersøker rollen til TGF-β i PDA. På grunn av sin effekt på mange cellulære prosesser, har endringer i TGF-β signale blitt implisert å ha en viktig rolle i patogenesen og progresjon av mange kreftformer [26, 57, 58]. Det er allment akseptert, har imidlertid på at TGF-β roller som både en tumor suppressor og tumor promoter i PDA, avhengig av tumorstadium og cellulære miljø [24, 59]. For eksempel, nesten 100% av pankreatiske tumorer har en mutasjon i minst ett av de TGF-β pathway gener, og over 50% har genet delesjon i SMAD4 (DPC4) [26]. Men på samme tid, høye serumnivåer av TGF-β
1 har vært forbundet med en økt risiko for PDA utvikling, og PDA pasienter med lav nukleær farging av TGF-βR2 og høy TGF-β
1-nivå kan ha lavere total overlevelse [58, 60]. Videre synes SMAD4 å spille en nøkkelrolle i utviklingen av PDA tumorogenesis gjennom virkninger på svulsten mikromiljøet.
