Abstract
Type 2 diabetes er assosiert med redusert risiko for prostatakreft i observasjonsstudier, og dette inverse foreningen har nylig blitt bekreftet i flere store kohortstudier. Men mekanismene som er involvert i denne beskyttende effekten er fortsatt ikke klarlagt. Hensikten med denne studien var å undersøke om ulike funksjoner i type 2 diabetes (hyperinsulinemi, hyperglykemi og tumornekrosefaktor alfa [TNF-α]) beskytte mot utvikling av prostatakreft. For dette formålet LNCaP celler ble brukt til
in vitro
eksperimenter og hårløse mus der PAC120 (hormonavhengig menneskelige prostata kreft) xenografter hadde blitt implantert ble brukt til
in vivo
eksamen. Vi gir bevis for at økende glukosekonsentrasjoner downregulate androgen reseptor (AR) mRNA og proteinnivåer gjennom NF-kB aktivering i LNCaP celler. Dessuten var det en synergisk effekt av glukose og TNFa i downregulating AR i LNCaP-celler. I motsetning til insulin hadde ingen virkning på AR regulering.
In vivo
Forsøkene viste at streptozotocin-indusert diabetes (STZ-DM) frembringer tumorveksthemming og en betydelig reduksjon i AR-ekspresjon i PAC120 prostatakreft mus. Som konklusjon, våre resultater tyder på at hyperglykemi og TNF-a spiller en viktig rolle i å beskytte mot prostata kreft ved å redusere androgen-reseptor-nivåer via NF-kB
relasjon:. Barbosa-Desongles A, Hernández C, De Torres jeg , Munell F, Poupon MF Simo R, et al. (2013) Diabetes Beskytter mot prostatakreft ved Downregulating androgen Receptor: Nye Innsikt fra LNCaP celler og PAC120 Mouse Model. PLoS ONE 8 (9): e74179. doi: 10,1371 /journal.pone.0074179
Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia
mottatt: 16 april 2013; Godkjent: 29 juli 2013; Publisert: 10.09.2013
Copyright: © 2013 Barbosa-Desongles et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra Instituto de Salud Carlos III (DMS) og Centro de INVESTIGACION BIOMEDICA en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERDEM), et initiativ fra Instituto de Salud Carlos III (RF, ABD, CH og DMS) . DMS er mottaker av en Miguel Servet kontrakt. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
type 2 diabetes (T2D) og prostatakreft (PCA) er to store, voksende helseproblemer som påvirker millioner av mennesker over hele verden. PCa er et androgen-avhengige malignitet som utgjør den vanligste organ kreft hos menn i USA, Canada og Australia, og den nest vanligste kreftformen hos menn globalt [1].
T2D har blitt anerkjent som en viktig faktor som bidrar til utvikling av faste organ maligniteter, inkludert leveren, bukspyttkjertelen, kolorektal, bryst, endometrial, livmor, og blære [2], [3] det er imidlertid flere store kohort studier har vist en betydelig redusert risiko for PCa i T2D [4 ] – [7]. I tillegg har det blitt observert at størrelsen av denne inverse krets er høyere med økende varighet av diabetes [4], [8]. Selv om langvarig diabetes beskytter mot PCa utvikling, er det bevis på at diabetikere kan ha et dårligere utfall fordi de har hystologically mer aggressiv PCa sammenlignet med ikke-diabetikere [9] – [11]. En av årsakene til denne funksjonen kan være lavere serumnivået av prostataspesifikt antigen (PSA) som type 2-diabetikere som finnes i forhold til nondiabetic fagene [5], [12], [13]. Siden Ptil er gjeldende screening metode for PCA kunne lavere PSA nivåer som finnes hos diabetespasienter føre til diagnose forsinkelse, og dermed øke forekomsten av høyverdig /avansert PCa. Imidlertid bør det bemerkes at den beskyttende virkning av diabetes på PCa er ikke bare en følge av forspenningen fra deteksjons forsinket diagnose på grunn av lavere PSA-nivå [5], [14], [15].
nøyaktige mekanismer som er involvert i den beskyttende effekten av T2D på PCa utvikling gjenstår å bli belyst. Det har blitt rapportert at personer med øket genetisk disposisjon for T2D ha en redusert risiko for PCa [16] – [18]. I denne forbindelse har det vist seg at den samme variasjon i HNF1B (også kjent som TCF2) genet, som er forbundet med økt risiko PCa, overfører beskyttelse mot T2D [19]. Andre forklaringer er foreslått har tatt med den gradvise utviklingen av betacelle utmattelse med insulin utarming og foreningen av diabetes med lavere testosteron og insulin vekstfaktor 1 (IGF1) nivåer [15]. I tillegg bør det bemerkes at lav grad betennelse er en vesentlig komponent av T2D, og at høyere serumnivåer av tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) sammenlignet med kontroller nondiabetic er blitt rapportert [20]. Nylig har vi gitt bevis for at TNFa kan spille en viktig rolle i downregulating SHBG og serumnivåer av testosteron [21], [22]. Derfor kan et krysstale mellom betennelse og androgen nivåer være en underliggende mekanisme regnskap for lav risiko for PCa observert i T2D. Videre har det nylig blitt vist at flere inflammasjonsrelaterte gener assosiert med serum androgen nivåer hos menn [23].
Siden PCa er androgen-avhengige, det første målet med denne studien var å undersøke om insulin eller glukosenivåer hadde noen effekt på androgenreseptoren (AR) på PCa LNCaP-celler (en udødeliggjort androgen-følsomme PCa kreftcellelinje) [24]. I tillegg, gitt at TNF-α er oppregulert i T2D og en negativ regulering av AR uttrykk av TNF-α har tidligere blitt rapportert [25], ønsket vi å undersøke om TNF-α hatt noen effekt på AR regulering i vår
in vitro
system. Dessuten, siden hyperglykemi er i stand til å aktivere NF-kB i endotelceller, pericytes og vaskulære glatte muskelceller [26] – [30], og NF-kB-aktivering kan være involvert i AR nedregulering [25], [31], undersøkte vi om hyperglykemi kan redusere AR nivåer gjennom NF-kB aktivering i LNCaP celler. Til slutt ble en PAC120 prostatakreft musemodell [32] ble behandlet med streptozotocin (STZ) som brukes til å evaluere
in vivo
effekter av hyperglykemi på AR regulering og tumorvekst.
Materialer og Metoder
Cell Kultur
menneskelige prostata kreft cellelinjer LNCaP ble hentet fra American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) og ble belagt i 75 cm2 kolber og dyrket i RPMI 1640 (PAA Laboratories , Pasching, Østerrike) inneholdende 10% FBS, 1% penicillin /streptomycin, 1% Hepes og forskjellige insulinkonsentrasjoner (20, 100 eller 200 μIU /ml) eller glukosekonsentrasjon (5, 10 eller 30 mM D-glukose og 5 eller 30 mM L-glukose) i 4 dager. LNCaP-celler ble også behandlet med økende mengder av D-glukose (5 mM, 10 mM og 30 mM) i nærvær eller fravær av TNFa (50 ng /ml) eller QNZ (Enzo og Life Sciences International, Inc., PA, USA). Celler ble opprettholdt i en fuktig inkubator med 5% CO
2 ved 37 ° C. Alle
in vitro
forsøk ble gjort minst to uavhengige eksperimenter med tre eksemplarer.
Animal Model
For
in vivo
studerer en PAC120 PCa musemodell var brukt. De Pinieux
et al product: [33] laget denne modellen av menneskelig PCa å bruke vev oppnås ved transuretral reseksjon av et lokalt residiverende PCa. Dette PCa vev ble etablert som transplant xenograft i nakne mus, der det vokste lokalt og viste det samme immunfenotypen som den opprinnelige svulsten.
Fem ukers gamle atymiske sveitsiske mus (Charles River Laboratories, Inc) ble plassert i ett patogen fri sone av Animal Facility Laboratories av Institut de Recerca de Vall d’Hebron, og de var utstyrt med mat og vann
ad libitum
. Prostatakreft ble skiver i 5 × 5 mm biter og podet subkutant som tidligere beskrevet [33]. De kirurgiske inngrep ble utført under isofluorane anestesi og meloksikam analgesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. Protokollen ble godkjent av CEEA (Comité Etic Experimentació Animal) av Research Institute Hospital Vall d’Hebron (Permit nummer 14/05 CEEA). Alle eksperimentelle prosedyrer ble gjennomført i henhold til institusjonelle standarder, som oppfylte kravene fastsatt av den spanske regjeringen og Det europeiske fellesskap (Real Decreto 223/1988 og BOE 256, 10/25/90). Tumorvekst ble vurdert ved å måle to vinkelrette diametre med en caliper. Volumet (V) av hver tumor ble målt en gang i uken og ble beregnet som tidligere beskrevet [33]. Medianen av tumorvolumene ble beregnet for hver gruppe av mus
DYR
Mus ble delt inn i fire grupper: a.) Mus injisert med 6 mg av streptozotocin (STZ) (Sigma-Aldrich , Madrid, Spania) intraperitonealt (IP), en uke før svulsten ble podet; b) mus behandlet med STZ IP etter tumorimplantering; c) mus behandlet med bærer (sitrat-buffer 50 mM pH 4,5) IP og d) ikke-behandlede mus. Blodprøver ble tatt to ganger per uke ved saphena-vene for målinger av sin glykemi som en kontroll av vedlikehold av diabetisk status. På slutten av forsøkene, behandlede og kontrolldyr ble bedøvet med CO
2, og umiddelbart avlivet ved cervikal dislokasjon. Tissue ble samlet og frosset ved -80 ° eller i formalin
Histologi
tumorprøver ble fiksert med formalin og parafin-embedded.; deretter fem um tykt tumor prøveseksjoner ble hydratisert med xylen (3 x 10 min) og etanol ved minkende konsentrasjoner (100%, 90%, 70%, 30%, 2 x 5 minutter) og farget med hematoksylin (30 sekunder) (Surgipath Medical Industries, Inc., IL, USA) og eosin (20 sekunder) (Sigma-Aldrich). Til slutt prøver var dehydrert med gradert etanolløsninger (som beskrevet ovenfor) og ryddet i xylen før de blir montert med DPX (Panreac SA, Barcelona, Spania).
Immunohistochemistry
Etter de-vokset og hydrering prosesser, lysbildene ble forbehandlet ved hjelp av en mikrobølgeovn antigen hentemetode (Dako Diagnostics SA, Barcelona, Spania). Endogen peroksidase ble stoppet før inkubering over natten ved 4 ° C med anti androgenreseptoren (AR kanin polyklonalt C-19, Santa Cruz Biotechnology Inc., Heidelberg, Tyskland) ble brukt ved 1:50 og med monoklonalt mus anti-human cytokeratin, (kloner AE1 /AE3, Dako, Danmark). Etter flere vaskinger ble snittene inkubert i 30 minutter ved romtemperatur med sekundære antistoffer konjugert med HRP (Dako Diagnostics SA), og reaksjonene ble utviklet i 1 minutt med diaminobenzidin og H
2o
2-systemet. Passende negative kontroller ble utført Ruge seksjoner uten primære antistoff.
RNA analyse
Total RNA ble ekstrahert fra LNCaP D-glukose og L-glukose behandlede celler ved hjelp RNeasy Mini kit, (QIAGEN SL, Madrid, Spania) Revers transkripsjon (RT) ble utført ved 42 ° C, i 50 minutter ved anvendelse av 2 mikrogram av total RNA og 200 enheter av Superscript II sammen med en oligo-dT primer og reagensene levert av Invitrogen. En aliquot av RT-produktet ble amplifisert i en 25 pl reaksjon ved hjelp av SYBRGreen (Invitrogen SA, Barcelona, Spania) med hensiktsmessige oligonukleotid primerpar som tilsvarer human androgen receptor (forover primer 5′-TGAAAGCCATGCTACTCTTCAG-3 «og reversprimeren 5»- GCTCA CCATGTGTGACTTGAT-3 «), humane 18S (forover primer 5′-TAACGAACG AGACTCTGGCAT-3′ og revers primer 5»-CGGACATCTAAGGGCATCACAG-3 «). Resultatene ble analysert ved anvendelse av SDS-program 7000 og kvantifisert ved den komparative C
T-metoden (2
-ΔΔC
T-metoden).
Western Blot analyse
Etter behandlingene ble LNCaP cellene vasket to ganger med kald PBS, skrapt av kolben og homogenisert i RIPA buffer supplert med Complete ™ proteasehemmer cocktail (Roche Diagnostics, Barcelona, Spania). Proteinekstrakter ble anvendt for Western blotting med antistoffer mot AR kanin-polyklonalt antistoff AR N-20 (Santa Cruz Biotechnology Inc.), human fosfo-NF-kB (SC-33039, Santa Cruz Biotechnology Inc.) og PPIA kanin polyklonalt antistoff (SA- 296,. BIOMOL Int, Madrid, Spania) ved 4 ° C. Etter flere vaskinger ble immunoreaktive bånd visualisert ved pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Dako Diagnostics SA), etterfulgt av peroksidase-avhengige kjemiluminescerende reagens (Pierce Bioteknologi Inc, Barcelona, Spania) ved eksponering for røntgenfilm. Densitometrisk analyse ble utført ved hjelp av ImageJ programmet.
Statistical Analysis
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Data ble utsatt for ANOVA test og signifikans (p 0,05; p 0,01) ble oppnådd
Resultater
Insulin Behandlingen har ingen effekt på androgen reseptor (AR) Nivåer i LNCaP celler
Siden PCa er androgen avhengige, vi først ønsket å undersøke om insulin hadde noen effekt på AR nivåer. Vi behandlet LNCaP-celler med forskjellige insulinkonsentrasjoner (20, 100 eller 200 μUI /ml) i fire dager. Resultatene viste at insulin behandlinger ikke endrer AR mRNA-nivåer sammenlignet med ubehandlede LNCaP-celler (Figur 1a). Videre AR protein nivåer var også uendret ved insulinbehandling sammenlignet med kontroller (Figur 1b). Effektiviteten av insulinbehandling ble bestemt ved å måle fosforyleringen av IRS-1 og PS6 proteiner. Resultatene viste at insulinbehandling øket fosforylering av begge proteiner i forhold til kontroll LNCaP-celler (figur 1C).
(A) Relative AR mRNA-nivåer i nærvær av forskjellige insulinkonsentrasjoner er vist. Humant 18 S mRNA ble amplifisert som en kontroll. Datapunkter er vist som gjennomsnitt ± SD av triplikater. (B) Analyse av AR-proteinnivåer i nærvær av forskjellige insulinkonsentrasjoner i LNCaP-celler ved western blot. PPIA har vært brukt som en rengjøring referanseprotein. (C) fosforylering nivåer av IRS-1 og PS6 i LNCaP-celler ble behandlet i løpet av 4 dager med forskjellige konsentrasjoner av insulin målt ved Western blotting. PPIA har blitt brukt som en rengjøring referanseprotein.
Økende glukosekonsentrasjoner downregulate AR i LNCaP celler
siden ønsket å studere effekter av hyperglykemi på AR nivåer ved hjelp LNCaP celler. LNCaP-celler ble dyrket med økende konsentrasjoner av glukose (5 mM, 10 mM og 30 mM) i løpet av fire dager. Mediene ble skiftet hver dag for å opprettholde konstant glukosekonsentrasjoner. AR mRNA-nivåer ble betydelig redusert i LNCaP-celler dyrket i 10 eller 30 mM glukose sammenlignet med LNCaP-celler dyrket i 5 mM glukose (figur 2A). Videre AR proteinnivåer ble også signifikant redusert i LNCaP-celler dyrket i 10 eller 30 mM glukose sammenlignet med LNCaP-celler dyrket i 5 mM glukose (figur 2B). For å utelukke noen osmotisk effekt av glukose, vi gjentok eksperimentene ved hjelp av L-glukose og vi fant ikke noen reduksjon i AR protein nivåer (data ikke vist).
(A) Relative AR mRNA nivåer i nærvær forskjellige D-glukosekonsentrasjoner er vist. Humant 18S mRNA ble amplifisert som en kontroll. Datapunkter er vist som gjennomsnitt ± SD av triplikater. (B) Analyse av AR-proteinnivåer i nærvær av forskjellige D-glukosekonsentrasjoner i LNCaP-celler ved western blot. PPIA har blitt brukt som en rengjøring referanseprotein.
Den synergistisk effekt av høye glukosekonsentrasjoner og TNFa i nedregulering av AR i LNCaP celler
Diabetikere er preget av en viss tilstand av lav grad av betennelse og viser høye nivåer av sirkulerende TNF-α i sammenligning med kontrollpersoner. Derfor ønsket vi å studere effekten av tilsetning av TNF-α i vår
in vitro
system. For dette formål vi gjentatt glukose behandlinger i nærvær eller fravær av TNF-α (50 ng /ml). Resultatene viste igjen at AR mRNA og proteinnivåer ble redusert betydelig når cellene ble dyrket i 10 eller 30 mM glukose sammenlignet med LNCaP-celler dyrket i 5 mM glukose. Spesielt, er en potent synergistisk effekt som fører til en betydelig ytterligere reduksjon av både AR mRNA og proteinnivåene erholdt når TNFa ble tilsatt til forskjellige D-glukosekonsentrasjoner i LNCaP-celler (figur 3A og B).
(A) relative AR mRNA-nivåer i LNCaP behandlet med en økende konsentrasjon av D-glukose med eller uten TNFa. Humant 18 S mRNA ble amplifisert som en kontroll. Datapunkter er vist som gjennomsnitt ± SD av triplikater. * P 0,05 og ** P 0,01, sammenlignet med 5 mM D-glukose. (B) Analyse av AR protein nivåer i LNCaP celler behandlet som i A målt ved Western blotting ved anvendelse PPIA som en rengjøring referanseprotein.
Hyperglykemi nedregulerer AR gjennom NF-kB aktivering i LNCaP celler
for å undersøke om hyperglykemi var i stand til å nedregulere AR gjennom NF-kB aktivering i vår
in vitro
systemet vi gjort følgende eksperimenter.
Vi behandlet først LNCaP celler med 5 mm og 30 mM glukose og mRNA-nivåer av AR ble analysert ved start og etter 4 dagers dyrking. Resultatene viste at 30 mM glukose var i stand til å redusere AR mRNA-nivåer sammenlignet med LNCaP-celler dyrket i 5 mM glukose (figur 4A). De AR proteinnivåer ble også redusert i LNCaP-celler dyrket i 30 mM glukose sammenlignet med 5 mM glukose. Enda viktigere, en økning i p65 fosforylering, en NF-kB-subenheten, ble også påvist i celler dyrket i 30 mM glukose sammenlignet med celler dyrket i 5 mM glukose (figur 4B).
(A) Relativ AR mRNA-nivåer i LNCaP behandlet med 5 mM eller 30 mM glukose. Humant 18 S mRNA ble amplifisert som en kontroll. Datapunkter er vist som gjennomsnitt ± SD av triplikater. * P 0,05 og ** P 0,01, sammenlignet med 5 mM glukose. (B) Analyse av AR og fosfo-p-65 proteinnivåer i LNCaP-celler behandlet som i A målt ved Western blotting ved anvendelse PPIA som en rengjøring referanseprotein. (C) i forhold AR mRNA-nivåer i LNCaP behandlet med 5 mM eller 30 mM glukose i fravær eller nærvær av QNZ (25 nM). Humant 18 S mRNA ble amplifisert som en kontroll. Datapunkter er vist som gjennomsnitt ± SD av triplikater. * P 0,05 og ** P 0,01, sammenlignet med 5 mM glukose. (D) Analyse av AR protein nivåer i LNCaP celler behandlet som i C målt ved Western blotting ved anvendelse PPIA som en rengjøring referanseprotein.
siden besluttet å behandle LNCaP celler med 5 mm eller 30 mM glukose i nærvær eller fravær av QNZ (25 nM), en NF-kB-inhibitor. Resultatene viste at QNZ co-behandling var i stand til å blokkere hyperglykemi-indusert nedregulering av AR mRNA og proteinnivåer (figur 4C og D).
Streptozotocin-indusert diabetes (STZ-DM) Produserer Prostate Cancer (PCA ) veksthemming hos et PAC120 Mouse Model
siden ønsket å undersøke om hyperglykemi av seg selv kunne beskytte mot utvikling av prostata kreft
in vivo
. For å gjøre dette, vi brukte en PAC120 PCa musemodell med STZ-DM. For dette formål intraperitoneal injeksjon av STZ ble administrert til sveitsiske nakne mus før (n = 7) og etter (n = 7) subkutant PAC120 tumorimplantering. Ubehandlet (n = 5) og citrat-behandlet (n = 5) mus ble benyttet som kontroller. Ubehandlet og citrate behandlet mus viste en lignende tumorvekst (figur 5Ai) mens STZ-DM mus viste redusert tumorvekst (figur 5Aii) eller ingen tumorvekst (figur 5Aiii).
(A) Bilder av svulster utviklet i bærerbehandlede mus (n = 5) (i), STZ behandles før eller etter tumorimplantasjon (n = 7 for begge) med redusert (ii) eller ingen tumorvekst (iii). (B) Sammenligning av tumorvolumet for ikke-behandlede (n = 5) og citrat-behandlet (n = 5) mus. (C) Tumor volum av STZ-behandlede dyr etter tumor-implantering, sammenlignet med tumorvolum av citrat-behandlede mus. (D) Tumor volum av STZ-behandlede dyr før tumorimplantering sammenlignet med tumorvolum av citrat-behandlede mus. Dataene er gjennomsnitt ± SD. * P 0,05 og ** P . 0,01 sammenlignet med kontrollgruppen
Tumorvekst ble fulgt ved å måle tumorvolum gang i uken. Ubehandlet og citrate behandlet mus viste tilsvarende vekst i løpet av 40-dagers eksperiment (figur 5B). Begge grupper av diabetiske mus viste redusert tumorvekst sammenlignet med kontrollmusene (Figur 5C og D). Mus som var diabetiker før svulsten implantasjon (figur 5D) viste en større reduksjon i tumorvekst sammenlignet med mus som var diabetiker etter svulst implantasjon (figur 5C).
Streptozotocin-indusert diabetes (STZ-DM) Reduserer AR Expression i Svulster og endogene prostates av PAC120 Mouse Model
Histologisk undersøkelse av hematoksylin /eosin (HE) fargede seksjoner fra begge grupper av diabetiske mus (figur 6G og J) viste ingen morfologiske endringer i svulsten i respekt til kontrollene eller citrat-behandlede mus (figur 6A og D). De viste sjelden glandular differensiering, høy mitotisk indeks og ble klassifisert som Gleason 9 (4 + 5) av patologen.
(A) HE farging av prostata tumorxenotransplantater fra kontroll mus, (D) citrate behandlet mus, (G) STZ-behandlede før tumorimplantering og (J) STZ-behandlede etter tumor-implantasjon. (B) AR farging av prostata tumor xenografter fra ikke-behandlede mus, (E) citrat-behandlede mus, (H) STZ-behandlede mus før tumorimplantering og (K) STZ-behandlede mus etter tumor-implantasjon. (C) Cytokeratine farging av prostata tumor-xenotransplantater fra kontrollmus, (F) citrat-behandlede mus, (I) STZ-behandlede mus før tumor-implantasjon og (L) STZ-behandlede mus etter tumorimplantering.
Siden våre
in vitro
eksperimenter viste at hyperglykemi redusert AR nivåer vi bestemte oss for å utforske muligheten for at STZ-DM var påvirker AR nivåer
in vivo
. Vi utførte immunhistokjemi mot androgen reseptor, i tumorene for kontroll og diabetiske mus. Kontrolldyrene viste positiv og sterk nukleær farging for androgen reseptoren i alle epitel-celler (figur 6B og E). Diabetiske mus viste epitelceller uten flekker eller noen få celler med nukleær eller cytoplasma AR flekker, men de fleste av cellene ble AR negativ (figur 6 H og K). Vi bekreftet at negative AR celler var epitel ved å utføre en immunhistokjemi mot pan-cytokeratin i svulster kontroll, citrat og STZ-DM mus (figur 6C, F, I og L).
neste målt AR mRNA nivåer i xenotransplantater fra kontroll og STZ-DM mus og vi har funnet at hyperglykemi reduserer AR mRNA-nivåer i tumorer i STZ-DM mus sammenlignet med kontrollmus (Figur 7A). I tillegg, som forekommer i LNCaP-celler en nedregulering av AR-nivåer ble fulgt av en økning i p65 fosforylering, en NF-kB-subenhet, i xenotransplantater fra STZ-DM mus (Figure7B).
(A) Relativ AR mRNA nivåer for citrate og STZ-behandlede mus. Humant 18 S mRNA ble amplifisert som en kontroll. Datapunkter er vist som gjennomsnitt ± SD av triplikater. (B) Analyse av AR (venstre panel) og fosfor-p-65 (høyre panel) protein nivåer fra citrate og STZ-behandlede mus målt ved Western blotting ved anvendelse PPIA som en rengjøring referanseprotein.
til slutt, farget vi de endogene prostata kontroll og begge grupper av diabetiske mus for å undersøke om hyperglykemi nedregulerer også endogene AR nivåer. Faktisk ble AR farging redusert i prostata av STZ-DM mus sammenlignet med kontrollmusene (figur 8).
AR farging er vist i xenograft prostatatumorer (i) og i endogene prostata (ii) kontroll mus. AR farging er vist i xenograft prostatakreft (iii) og endogene prostata (iv) fra STZ- behandlet mus.
Diskusjoner
PCa er den vanligste organ kreft hos menn i USA, Canada og Australia, og den nest vanligste kreftformen hos menn globalt. Amerikanske menn har en gjeldende estimert levetid risiko for en i seks og PCa representerer, etter lungekreft, den nest største årsaken til kreft-relaterte dødelighet [1]. Etablerte risikofaktorer for PCa er eldre alder, afrikansk-amerikansk etnisitet og en historie av sykdommen i en første-graders slektning. T2D har vært forbundet med en lav risiko for å utvikle PCa og dette har nylig blitt bekreftet i en meta-analyse som inkluderte 29-kullet og 16 case-control studier med 8,1 millioner deltakere og 132,331 PCA tilfeller [34]. Våre funn gir den første eksperimentell støtte til dette konseptet.
AR pathway spiller en nøkkelrolle i den strukturelle og funksjonelle integritet av prostata, samt for PCa vekst og progresjon [15]. I denne forbindelse er det blitt rapportert at knockdown av AR fører til veksthemming og apoptose av både androgen-avhengige og androgen-uavhengig PCA-celler [35] – [37]. Effekten av diabetes på AR og tumorvekst var aldri blitt utforsket. I den foreliggende undersøkelse gir vi første bevis på at hyperglykemi nedregulerer AR via NF-kB-aktivering, og at denne inhiberende virkning økes ytterligere ved TNFa. I tillegg fant vi at denne nedregulering av AR indusert av diabetes er assosiert med betydelig tumorveksthemming hos en
in vivo
modell av PCa. Vi ønsker å påpeke at i
in vitro
eksperimenter har vi alltid fått konsistente resultater i form av glukose-indusert reduksjon av AR nivåer. Vi har imidlertid oppdaget en betydelig variasjon i graden av reduksjon av AR nivåer forårsaket av glukose behandling.
genetisk disposisjon, og lave nivåer av insulin, IGF-1 og testosteron er blant de foreslåtte faktorene overdragelse beskyttelse for PCa i T2D. I motsetning til den mulige rollen til to vesentlige hendelser som oppstår i T2D: hyperglykemi og økningen av proinflammatoriske cytokiner (. F.eks TNFa) har ikke tidligere blitt undersøkt
PCa har en av de sterkeste forholdet mellom alder for enhver. kreft hos mennesker, og genetiske faktorer er estimert til å utgjøre 42% av risikoen [15]. Det er mulig at nærværet av genetiske faktorer som TCF2 varianter, som er forbundet med både T2D og lav risiko for PCa delta i den lave risiko for PCa observert T2D [20]. Imidlertid sterkt hevder det tidsmessige forhold mellom DM diagnose og PCa risiko (som tiden siden DM-diagnose øker, øker risikoen for PCa minker) mot dette konseptet [4]. Til støtte for dette har vi funnet en lavere vekst av PCa xenofraft i gruppen av mus med lengre varighet diabetes.
Insulin er en vekstfaktor for prostata epitel og det også stimulerer veksten av en rotte PCa cellelinje in vitro [38]. Flere nylig, en eksperimentell studie rapporterte intracellulær
de novo
steroidogenesis fremmet av insulin ved PCA [39], men effekten på AR ble ikke analysert. Disse resultatene antyder at insulin kan direkte fremme proliferasjon av prostata kreftceller. Imidlertid er disse observasjonene basert på en eksperimentell modell for kastrering-motstandsdyktig prostatakreft, og effekten av insulin på prostata tumordannelse i løpet av den tidlige fase eller i hormon-naive kreft (for eksempel LNCaP) gjenstår å bli belyst. I tillegg er de doser av insulin som ble brukt var suprafysiologiske og videre studier ved bruk av doser av insulin i picomolar (så som ble anvendt i denne studien) er nødvendig. I klinisk setting, mens noen prospektive studier viser at det kan være en sammenheng mellom hyperinsulinemi og PCa risiko, er det også flere studier som ikke støtter en rolle for insulin ved PCA risiko og dermed fortsetter å være et område med etterforskningen [4 ], [15]. Likevel, insulinmangel oppstår med økende varighet av diabetes kan begrense insulin action og dermed beskytte mot PCa. I denne forbindelse, menn med lave insulinnivåer på grunn av diabetes ser ut til å ha en redusert risiko for utvikling PCa [40], [41]. Faktisk kan den lave nivåer av insulin være en medvirkende faktor som er involvert i den nedre tumorvekst observert i PAC120 PCA mus behandlet med STZ anvendt i denne studien.
En foreslått hypotese for hvordan hypoinsulinemia kan redusere prostata karsinogenese er ved å begrense biotilgjengeligheten av insulin-lignende vekstfaktor i (IGF-i) [15]. Men nyere studier tyder på at IGF-1 nivåene er ikke signifikant forskjellig mellom diabetikere og kontroller [41], [42]. I tillegg er en nylig stor prospektiv studie konkluderte fravær av korrelasjon mellom plasma IGF-1-nivå og insulinresistens [42]. Derfor IGF-1-PCA foreningen i type 2 diabetes befolkningen fortsatt spekulative.
Siden PCa er androgen-avhengige er det mulig at de lavere nivåene av testosteron som er rapportert i langsiktig diabetes (spesielt overvektige menn) kan nå nivåer under en terskel til en lavere risiko for PCa [4], [15]. Det er imidlertid vel anerkjent at en forbindelse serumtestosteronnivået til en kliniske fenotype er en overforenkling, gitt at sirkulerende testosteronnivåer, enten fri eller total, er neppe til å gjenspeile androgen virkning på vev-nivå. Likevel antyder noen bevis for at lave sirkulerende testosteronnivå kan være en risikofaktor for PCa aggressivitet [43], [44] og dette kan være en grunn til at når PCa vises i T2D den har et verre utfall [15], [44]. I denne forbindelse, er det mulig at de lave AR nivåer på grunn av hyperglykemi, høye TNFa-nivåer og lavt testosteronnivå, kan bortsett fra å konferere beskyttelse mot utvikling PCa også fungere som en mekanisme for drift av prostataceller mot en viss grad av androgen uavhengighet. Faktisk har NF-kB-aktivering er involvert i den androgen-uavhengig vekst av PCa [45]. Når PCA utvikler seg i type 2 diabetikere dette ville forklare sin aggressivitet og dårlig utfall [9] – [11]. Til en viss grad kan dette også skje hos overvektige pasienter, siden fedme kan redusere risikoen for ikke-aggressiv PCA mens på samme tid fremme risikoen for aggressiv PCa [46], [47].
mekanismene bak hyperglykemi på AR regulering er ikke tidligere blitt rapportert. I den foreliggende undersøkelse har vi funnet at hyperglykemi nedregulerer AR via NF-kB-aktivering, og at denne inhiberende virkning økes ytterligere ved TNFa. I tillegg ble nedregulering av AR indusert ved diabetes assosiert med en tumor vekst reduksjon eller til og med ikke tumorvekst i den PAC120 PCa musemodellen behandlet med STZ. Videre ble en signifikant reduksjon av AR-ekspresjon i de endogene prostata av denne
in vivo modell
detektert. Total, tyder våre resultater at to essensielle komponenter av T2D: hyperglykemi og proinflammatorisk cytokin TNFa deltar i å redusere risikoen for PCa i diabetes mellitus type 2.
