Abstract
Lungekreft er en ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis. Flere endringer i RNA-metabolismen har blitt funnet i lungekreftceller; dette tyder på at RNA metabolisme-relaterte molekyler er involvert i utviklingen av denne patologi. I denne studien har vi søkte etter RNA metabolisme relaterte gener som viser forskjellige uttrykk nivåer mellom normale og kreft lunge vev. Vi identifiserte åtte gener forskjellig uttrykt i lunge adenokarsinom microarray datasett. Av disse syv var oppregulert, mens en ble nedregulert. Interessant nok har de fleste av disse genene ikke tidligere blitt assosiert med lungecancer. Disse gener spiller forskjellige roller i mRNA metabolisme: tre er forbundet med spliceosome (ASCL3L1, SNRPB og SNRPE), mens andre del i RNA-relaterte prosesser som oversettelse (MARS og MRPL3), mRNA stabilitet (PCBPC1), mRNA transport (RAE ), eller mRNA redigering (ADAR2, også kjent som ADARB1). Videre fant vi en høy forekomst av tap av heterozygositet i kromosom 21q22.3, hvor ADAR2 locus ligger i NSCLC cellelinjer og primære vev, noe som tyder på at nedregulering av ADAR2 i lungekreft er assosiert med spesifikke genetiske tap. Til slutt, i en serie av adenokarsinom pasienter uttrykk for fem av de deregulerte gener (ADAR2, MARS, RAE, SNRPB og SNRPE) korrelert med prognose. Samlet utgjør disse resultatene støtter hypotesen om at endringer i RNA metabolisme er involvert i patogenesen av lungekreft, og identifisere nye potensielle mål for behandling av denne sykdommen
Citation. Valles I, Pajares MJ, Segura V , Guruceaga E, Gomez-romerske J, Blanco D, et al. (2012) Identifisering av Novel deregulert RNA Metabolism-relaterte gener i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 7 (8): e42086. doi: 10,1371 /journal.pone.0042086
Redaktør: Stefan Maas, Lehigh University, USA
mottatt: 8 mars 2012; Godkjent: 02.07.2012; Publisert: 02.08.2012
Copyright: © Valles et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet har vært støttet av «UTE prosjekt CIMA»; Spanske regjering (ISCIII452RTICC RD06 /0020/0066, PI02 /1116 og PI10 /00166), European Regional Development Fund (ERDF) «Una manera de hacer Europa». Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er en av de mest vanlige humane kreftformer og en ledende årsak til kreft død på verdensbasis [1], [2]. Det inkluderer to viktigste histologiske subtyper, småcellet lungekreft (SCLC) og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), og sistnevnte står for 80-85% av alle tilfeller. Lungekreft er ofte oppdages på et avansert stadium, noe som medførte at sykdommen er nesten uhelbredelig. Ytterligere karakterisering av de biologiske endringer forbundet med patogenesen potensielt kunne bidra til å identifisere nye biomarkører for tidlig diagnose og nye mål for mer effektiv behandling.
Alternativ spleising er en biologisk prosess essensiell for protein mangfold. Ved alternativ spleising, er multiple transkripter som genereres fra et enkelt mRNA forløper. Endringer i alternativ spleising er blitt demonstrert å være assosiert med forskjellige sykdommer, inkludert kreft. Flere alternativt spleisede genprodukter har vært knyttet til utviklingen av neoplastisk sykdom [3]. Kreft-assosiert spleisevarianter kan potensielt tjene som diagnostiske og prognostiske verktøy samt terapeutiske mål i kreft [4]. I lungekreft, har mange skjøte forandringer er tidligere beskrevet i kreft-relaterte prosesser, slik som cellevekst, cellesykluskontroll, apoptose, eller angiogenese [5] – [9]. For eksempel, har høye nivåer av anti-apoptotiske variant Bcl-xL blitt rapportert å bidra til tumorprogresjon hos både SCLC og NSCLC [10], [11]. Nylig ble spleise endringer som påvirket transkripsjoner av VEGFA, MACF1, APP, og nummen hos pasienter med lunge adenokarsinom [9]. Videre ble det uttrykk for en spesifikk isoform av nummen i tumorprøver vist seg å fremme celleproliferasjon [9]. I tillegg ble modulering av caspase 9 alternativ spleising demonstrert å påvirke følsomheten av NSCLC-celler til noen kjemoterapeutiske midler [12].
Mekanismene som ligger til grunn for avvikende alternativ spleising i lungekreft forblir dårlig forstått. I noen tilfeller, mutasjoner i skjøte regulatoriske elementer i nukleotidsekvensen av genet resultat i endringer i spleisesetet utvalg i sin tur fører til alternativt spleisede transkripter [13]. I andre tilfeller, endringer i proteiner knyttet til mRNA-metabolisme er ansvarlig for unormale skjøte mønstre. Noen studier har rapportert endringer i konsentrasjonen, lokalisering, sammensetning eller aktivitet av en rekke RNA-bindende proteiner i lungekreft [14] – [19], som tyder på at denne veien er hyppig forandres og er viktig for malign transformasjon. RNA bindende protein SF2 /ASF er overuttrykt i NSCLC tumorer og fremmer overlevelse ved å styrke survivin uttrykk [18]. Undersøkelser i dyremodeller som tyder på å endre balansen mellom ulike RNA-bindende proteiner bidrar til lunge karsinogenese [20], [21]. Men karakterisering av repertoaret av RNA metabolisme-relaterte molekyler involvert i lungekreft er for tiden ufullstendig, og videre studier er garantert.
I denne studien ønsket vi å identifisere nye RNA metabolisme relaterte gener med endret uttrykk i primære lungesvulster. Ved hjelp av lunge adenokarsinom microarray datasett, vi søkte etter gener som viste signifikant forskjellige uttrykk nivåer mellom normale og kreft lunge vev. Vi identifiserte syv mRNA stoffskifterelaterte proteiner oppregulert i tumorvev og en nedregulert. Noen av de over-uttrykte gener tilhører familien av spliceosomal proteiner, impliserer dette cellemaskineriet i utviklingen av NSCLC. Den downregulated genet ADAR2 ble plassert i et område med en høy frekvens av slettinger i NSCLC. I tillegg ble ekspresjon av fem av disse genene i forbindelse med prognosen for pasienter med lunge adenokarsinom, som støtter betydningen av RNA metabolisme i lungekreft biologi.
Resultatene
Gene Seleksjon av Bio-analyse
Gener som tilhører RNA metabolisme-relaterte kategorier ble valgt fra Gene ontologi database (www.godatabase.org). Tre store RNA metabolisme relaterte kategoriene ble valgt: «RNA bindende», «RNA spleising» og «spliceosome kompleks». Fold-endring (FC) av genuttrykk nivåer mellom normal og adenokarsinom lungevev ble beregnet ved hjelp av data fra tre microarray eksperimenter [22] – [24]. Et sett av gener med mRNA-ekspresjonsnivåer signifikant forskjellig mellom normale og kreft vev ble oppnådd fra hver av de tre microarray eksperimenter (tabell S1). Et representativt eksempel er vist i figur 1A, og overlappingen mellom de forskjellige lister er vist i figur 1B. I tillegg fant vi at disse genene ble uttrykt forskjellig i plateepitelkarsinom, småcellet lungekarsinom, og karsinoide tilfeller stede i datasettene (data ikke vist). For å underbygge gyldigheten av dette valget, ekstra
i silico
validering ble utført med en fjerde uavhengig kohort av lunge adenokarsinom pasienter [25], og resultatene bekrefter funnene i den innledende forsøket (tabell S2).
) RNA-relaterte gener med ekspresjonsnivåer signifikant forskjellige (p 0,01) mellom lunge adenokarsinom prøver og normal lungeprøver (10 siste kolonner) i en av de mikroarray databasene benyttet i studien [23]. Rød farge angir høyere uttrykk nivåer, mens grønn farge indikerer lavere uttrykk nivåer. B) Venn-diagram som tilsvarer gener med signifikante uttrykk forskjeller mellom normale og adenokarsinom prøver.
Expression of Valgte RNA Metabolism-relaterte gener i Lung Cancer Cell Lines og normal lunge primærkulturer
ekspresjonsnivåene av de utvalgte gener ble evaluert ved konvensjonell PCR i SCLC og NSCLC-cellelinjer og i primær NHBE celler. For de fleste gener, mRNA-nivåer i lungecancercellelinjer var høyere enn i NHBE celler (figur 2). Videre mRNA-nivåer var generelt høyere i SCLC-cellelinjer i forhold til NSCLC-cellelinjer. Dette resultatet er i overensstemmelse med tidligere observasjoner hvori uttrykket nivåer av andre RNA-bindende proteiner ble også bestemt til å være høyere i SCLC sammenlignet med NSCLC [15]. I ADAR2 flere lungekreft cellelinjer viste lavere mRNA nivåer i forhold til NHBE celler. Vi ekskluderte RNPS1 og SNRPC i senere analyser fordi uttrykk nivåer var homogene blant alle celletyper.
Expression nivåer ble bestemt i lungekreftcellelinjer og normale menneskelige bronkial epitel (NHBE) celler. GAPDH ble anvendt som kontroll genet. SCLC: småcellet lungekreft; ADC: adenokarsinom; SCC: plateepitelkarsinom; LCC: stor celle karsinom; CT: karsinoid svulst; NC.: Negativ kontroll (vann)
å kvantifisere forskjeller i ekspresjonsnivåer, sanntid PCR for hver av de åtte utvalgte gener ble utført i panelet av lungekreft cellelinjer, så vel som i NHBE celler og normale primære SAECs. Denne analysen bekreftet våre tidligere resultater: uttrykk for oppregulert gener var høyere i lungekreftceller sammenlignet med NHBE celler eller SAECs. I kontrast, ADAR2 uttrykk i lungekreftceller var lavere enn i NHBE celler eller SAECs (figur 3).
Expression nivåer ble bestemt i lungekreftcellelinjer og ikke-maligne lunge primærkulturer (NHBE og SAEC). HPRT ble anvendt som kontroll genet. Barer representerer normalisert uttrykk forholdstall i forhold til genet nivåer i NHBE celler. Nøkkeltall 1 indikerer høyere uttrykk nivåer enn i NHBE celler, mens forholdstall 1 betegne lavere uttrykk nivåer
genetiske endringer på ADAR2 Locus
Vi har karakterisert genetiske endringer forbundet. med ADAR2 nedregulering i lungekreft. Således, evaluerte vi nærvær av LOH ved 21q22.3, plasseringen av ADAR2 locus. Vi brukte et panel av åtte heterozygote mikro. Mikro ble amplifisert ved PCR og analysert ved anvendelse av kapillær elektroforese. Mikro heterozygositet ble først evaluert i panelet av lungekreft cellelinjer, og resultatene er vist i figur 4. I seks cellelinjer (H23, HCC827, A549, H322, H1385 og H1299), alle mikro var homozygot. Selv om tilstedeværelsen av tap av heterozygositet (LOH) ikke er definitivt avgjørende på grunn av mangel på sams normal genomisk DNA, er dette homozygositet ekstremt usannsynlig og antyder sterkt tap av genetisk materiale. I andre cellelinjer resultatene var variabel, og visse tilfelle foreslått lokaliserte områder i LOH (for eksempel den mest centromeric region i H157-celler). Neste, vi sammenlignet homozygosity på 21q22.3 og ADAR2 mRNA uttrykk nivåer (tidligere innhentet). Alle cellelinjer homozygote for mikro uttrykt lave ADAR2 mRNA nivåer. Faktisk, to av de tre cellelinjer med de laveste ADAR2 mRNA uttrykk nivåer (A549 og H1385) tilhører denne gruppen. I motsetning til de fem cellelinjer med de høyeste ADAR2 uttrykk nivåer (H82, H187, H157, H226 og H460) var for det meste heterozygote for mikro flankerer ADAR2 locus (D21S171 og D21S1574).
homozygosity (grønn) eller heterozygositet (rød) ble bestemt i hver cellelinje. Mikro er bestilt fra den mest centromeric til de mest telomeric. ADAR2 locus ligger innenfor D21S171 og D21S1574.
Vi studerte tilstedeværelse av homozygosity ved 21q22.3 i genomisk DNA fra 48 pasienter med lungekreft. Evalueringen av de åtte mikro i tumorvev og matchede normale vev tillater oss å bestemme nøyaktig frekvensen av LOH på dette kromosomale område. Figur 5A illustrerer de tre alternative elektro mønstre oppnådd: ikke-informativ case, oppbevaring av heterozygositet, og LOH. Etter mikroanalyse, ble LOH identifisert i ca 30-40% av tilfellene (figur 5B). LOH på 21q22.3 var signifikant høyere i plateepitelkarsinom enn i adenokarsinomer (25 ± 6% vs. 49 ± 7%, p = 0,003). Ingen forskjeller i frekvens av LOH ble funnet mellom faser (fase I: 37 ± 2% vs. trinn II-III: 34 ± 7%, p = 0,279). For å evaluere ADAR2 locus mer spesifikt ble en SNP som ligger innenfor den ADAR2 genet (rs1051367) analysert. Av de tyve informative tilfeller (dvs. tilfeller heterozygotisk for SNP rs1051367 i normalt vev), femten (75%) var homozygote i den tilsvarende avstemt tumorvevet. En sammenligning mellom resultatene oppnådd fra mikroanalyse og SNP-sekvensering viste samsvar mellom de respektive teknikker, selv om antallet pasienter med LOH på ADAR2 SNP var høyere (30-40% vs. 75%).
genomisk DNA fra primær lungekreft og deres tilsvarende normale lunge vev ble anvendt. A) Representative eksempler på de elektroforetiske mønstre erholdt ved mikroanalyse: et ikke-informative tilfelle, med bare en forsterkning topp; heterozygositet oppbevaring, med to topper i både normale og tumorprøver; og LOH, med to topper i den normale prøven, men bare en topp i det tilsvarende tumorprøve. Piler peker på mikro alleler. B) LOH av de angitte mikro ble analysert i 48 NSCLC pasienter. Mikro er bestilt fra den mest centromeric til de mest telomeric. LOH ved ADAR2 lokuset ble analysert ved direkte sekvensering av polymorfismen rs1051367 (A /G). Grønne bokser representerer LOH, røde bokser indikerer oppbevaring av heterozygositet, og gule boksene er ikke-informative loci.
Uttrykk for RNA Metabolism-relaterte gener og Lung Cancer Clinical Outcome
Vi undersøkte enten uttrykk for forskjellig uttrykt RNA metabolisme relaterte gener assosiert med kliniske resultater hos pasienter med lunge adenokarsinom bruker en offentlig tilgjengelig microarray data [26]. Pasientene ble delt i henhold til høye og lave mRNA uttrykk nivåer ved å bruke median som avskåret punkt (figur 6). I tilfelle av ASCC3L1, MRPL3, og PABPC1, ble det ikke funnet assosiasjon mellom mRNA-nivåer og pasientens kliniske resultatet (data ikke vist). Høy uttrykk for MARS, RAE1, SNRPB, og SNRPE var signifikant assosiert med redusert total overlevelse. Høye ADAR2 mRNA nivåer var signifikant assosiert med et bedre resultat. For en kombinert analyse av de fem prognostisk genene, ble pasientene delt inn i tre grupper: pasienter uten dereguleringen hendelser, pasienter med én til tre arrangementer, og pasienter med fire eller fem hendelser. Den kombinerte resultatet av de fem genene var en sterk prognostisk markør (figur 6). Dermed pasienter uten dereguleringen hendelser viste svært god overlevelse. I motsetning til pasienter med deregulering i fire eller fem av genene viste verste overlevelse. Den Cox modellen ble brukt til å vurdere effekten av den prognostiske score på total overlevelse, både univariat og multivariat analyse (tabell 1). RNA-metabolisme minutter ble en uavhengig prognostisk faktor for total overlevelse hos pasienter med lunge adenokarsinom.
Data ble hentet fra en microarray studie [26]. Tallene viser Kaplan-Meier-kurver og logge rang statistikk for total overlevelse hos pasienter fordelt på høy og lav mRNA uttrykk (ved hjelp av median som cut-off point). Siste tall tilsvarer pasienter delt på antall av dereguleringen hendelser (se Materiale og metode).
Diskusjoner
Vi identifiserte åtte RNA-relaterte gener forskjellig uttrykt i lungekreft , et funn som støtter den hypotese at RNA-metabolisme er viktig i patogenesen av lungekreft. Syv av de identifiserte gener ble oppregulert, mens bare én ble nedregulert. Interessant nok har de fleste av disse genene har ikke tidligere blitt rapportert å være assosiert med lungekreft. I tillegg er uttrykk for de fleste av disse genene viste en sammenheng med total overlevelse i lunge adenokarsinom pasienter, noe som tyder på en sammenheng mellom RNA metabolisme og lungekreft patogenesen.
Tidligere rapporter har vist at RNA-metabolisme gener er deregulert og implisert i maligne transformasjon av lungeceller [14], [16], [18]. Funnene i vår studie identifisere et nytt sett med forskjellig-uttrykte gener assosiert med RNA-metabolisme. Det er klart at ekspresjonen av mange andre RNA-relaterte gener som er endret i lungekreft. Gruppen av gener identifisert i vår studie var sterkt påvirket av den strenge strategi valg. Statistiske analyser ble restriktiv; Således ble bare de mest signifikante genene valgt. Videre har endringer i skjøting, som er blitt rapportert for noen RNA-relaterte gener [17], [27], [28], kan ikke påvises ved hjelp av denne analytiske metode.
De fleste av RNA-relaterte gener identifisert i vår studie ble oppregulert i svulstvev. Årsaken til dette er uklar; Det kan være på grunn av den økte metabolske rate assosiert med tumorcelle-proliferasjon. Men det store flertallet av RNA-relaterte gener viste ingen forskjell mellom tumor og normalt lungevev. Dessuten ble en relevant gen identifisert i vår undersøkelse nedregulert (ADAR2), og mRNA-ekspresjon av fem av de utvalgte gener var assosiert med klinisk resultat i en serie av adenokarsinom pasienter. Spesielt ble høyt uttrykk for up-regulerte gener (MARS, RAE1, SNRPB, og SNRPE) forbundet med dårligere prognose, mens høy uttrykk for downregulated genet (ADAR2) korrelert med bedret overlevelse. Interessant, gruppen av pasienter uten deregulering i noen av disse genene oppviste meget god overlevelse. På den annen side ble et høyt antall dereguleringen hendelser assosiert med dårlig overlevelse. Disse resultatene tyder på at aktiviteten av RNA-metabolske maskineri kan potensielt tjene som et prognostisk markør for lungekreft.
Proteiner oversatt fra tre av de åtte opp-regulerte gener som tilhører familien av spliceosomal små nukleære ribonucleoproteins ( snRNPer): ASCC3L1, SNRPB, og SNRPE. Den spliceosome er et kompleks av snRNPer pluss en rekke tilknyttede proteiner. Dette komplekset gjenkjenner spleiseseter og fjerner introner fra pre-mRNA molekyler. Lite er kjent om den rollen den spliceosome i kreft. Nylig, ved hjelp av hel-exome sekvensering analyse, har noen studier identifisert en høy frekvens av mutasjoner i forskjellige deler av spliceosome i kronisk lymfatisk leukemi og myelodysplasi [29] – [33], impliserer dette cellemaskineriet i utviklingen av kreft [34] . Således har enkelte spliceosomal inhibitorer blitt testet i kreftceller og spliceosome har blitt foreslått som et anti-kreft-target [35]. Identifiseringen av tre spliceosomal proteiner forskjellig uttrykt i lungekreft tyder på at en rolle spilles av spliceosome i denne malignitet. Dessverre er det lite publisert informasjon vedrørende rollen til disse spesielle proteiner i kreft. ASCC3L1 (SNRNP200) koder heli Brr2, en viktig komponent i spliceosomal snRNP U5. Så vidt vi vet, er denne studien den første til å demonstrere enn ASCC3L1 er assosiert med malignitet. Liten atom ribonukleotid assosiert protein B (SNRPB) er en del av snRNP U1. SNRPB har blitt rapportert å være en metastase suppressor i en musemodell av allograft prostatakreft [36]. En sjelden polymorfisme i SNRPB genet har blitt assosiert med redusert risiko for brystkreft i BRCA1 mutasjonsbærere [37]. Overekspresjon av små atom ribonukleotid assosiert protein E (SNRPE) har blitt rapportert i forbindelse med vekst arrest på G2 fase i både maligne og ikke-maligne celler [38]. Men i tråd med våre resultater, er SNRPE forsterket og overuttrykt i maligne gliomer og muntlig plateepitelkarsinom [39], [40]. SNRPE er også forsterket og oppregulert i leverkreft, og kan fungere som et onkogen ved å styrke celleproliferasjon [41].
De andre proteiner som var oppregulert i vår studie var MARS, MRPL3, PABPC1 og RAE . Metionin-tRNA syntetase (MARS eller metr) virker som en katalysator i bindingen av metionin til den tilsvarende tRNA. Øket aktivitet av dette enzymet har blitt rapportert i humane koloncancer [42]. Mer nylig ble en induksjon av ekspresjon MARS vist i brystkreftcellelinjer stimulert med insulin-lignende vekstfaktor [43]. Rammeskifte mutasjoner i MARS har blitt beskrevet i mage og tykktarmskreft med mikro ustabilitet [44]. Mitokondriell ribosomalt protein L3 (MRPL3) er en komponent av 39S subenhet av mitokondrie ribosomet. Høy ekspresjon av dette protein har blitt rapportert i hepatokarsinom, kolonkarsinom, og lymfom, noe som tyder på en sammenslutning av dette protein med høye celledelingsrate [45]. Poly-A bindende protein cytoplasma 1 (PABPC1) deltar i poly-A forkortelse på 3 «enden av eukaryote mRNA. Motstridende resultater når det gjelder rollen dette proteinet i kreft har blitt rapportert. En studie konkluderte med at lave nivåer av PABPC1 korrelert med mer invasive svulster og verre overlevelse hos pasienter med spiserørskreft [46]. Men i andre studier, PABPC1 over-uttrykk ble beskrevet i prostatakreft [47], leverkreft [48], overfladisk blærekreft [49], og lungekreft [50]; i det sistnevnte rapport forfatterne foreslo deltakelse av translasjons-initierings-kompleks i tumorgenese for lungekreft. PABPC1 regulerer også telomerase aktivitet, fører til en vekst fordel i keratinocytter som uttrykker humant papillomavirus type 16 E6 [51]. RNA eksport en homolog (RAE1) er en kjernefysisk eksport protein som er involvert i mRNA transport fra kjernen til cytoplasma. RAE1 spiller også en viktig rolle i opprettholdelsen av spindelen bipolaritet under celledeling [52], [53]. RAE1 mRNA og proteinnivået reduseres ved hemming av neuroblastom celle spredning, og dens overekspresjon hindrer retinsyre-indusert cellesyklus arrest og differensiering [54]; imidlertid en tidligere studie viste at RAE1 /NUP98 mutante mus er mer utsatt for DMBA-induserte lungesvulster, sammenlignet med villtype-mus, noe som indikerer at kombinert RAE1 /NUP98 haplogruppene-insuffisiens potensielt fremmer tumorigenesis [55].
den downregulated genet adenosindeaminase handler på RNA 2 (ADAR2 eller ADARB1) er en RNA editase som katalyserer adenosin til inosin deaminering i dobbelt strandet regioner. Feilregulering av adenosin til inosin redigering i humane kreftformer bidrar potensielt til endret transkripsjonen programmet er nødvendig for å opprettholde kreftutvikling [56]. ADAR2 er ubikvitært uttrykt i mange vev, særlig i sentralnervesystemet [57]. Tidlig debut epilepsi og for tidlig død er rapportert i ADAR2 knock out mus [58]. I kreft, en tidligere studie rapporterte overekspresjon av ADAR2 i
in vitro
forvandlet menneske voksne stamceller, transformerte fibroblaster, og noen cellelinjer fra andre vev [59]. Høyere nivåer av ADAR2 mRNA ble også observert i androgen-uavhengig prostatacancer-cellelinjer i forhold til androgen-responsiv cellelinjer [60]. Men de fleste rapporter knytte kreft med redusert ADAR2 uttrykk eller aktivitet. Således ble en reduksjon i enzymatisk aktivitet av ADAR2 hos pasienter med multiform glioblastom (MGB) assosiert med høyere Ca
2+ permeabilitet og aktivering av Akt vei, bidrar til tumorvekst og aggressivitet [61], [62]. Paz et al. har også funnet en reduksjon av ADAR2 mRNA-nivåer i hjernen tumorer og viste at dets overekspresjon i en MGB cellelinje resulterte i nedsatt celleformering [63]. En reduksjon i ADAR2 redigering aktivitet, som korrelert med grad av malignitet, ble også funnet hos barn astrocytomas [64]. Hvis redigerings status ble tilbakestilt astrocytom tre cellelinjer, ble en signifikant reduksjon i celle malign oppførsel funnet [64]. Flere nylig, Galeano et al. observert en generell nedgang i ADAR2-medierte redigering hendelser i blære og endetarmskreft [65]. I tilfelle av lungekreft, ble en reduksjon av ADAR2 uttrykk som tidligere er beskrevet i squamous cell lungekarsinom [66].
nedregulering av ADAR2 i lungekreft kan assosieres med genetiske forandringer ved 21q22, hvor ADAR2 genet er plassert. Tidligere studier har rapportert tap av genetisk materiale på den lange arm av kromosom 21 hos pasienter med flere solide tumorer [67] – [71], inkludert lungekreft [72] – [76]. Lee et al. analysert ni mikro markører som er lagt mellom 21q21.1 og 21q22.3 i NSCLC pasienter. LOH ble påvist i minst én av dem i over 55% av tumorer, med 26% -48% LOH forekomsten i de enkelte mikro [74]. Sato et al. beskrevet LOH på 21q22.3 i 28% av prøvene fra adenokarsinom og plateepitelkarsinom pasienter [72]. Vi fokuserte på analyse av 21q22.3 endringer i regionen ADAR2. Vi fant 30-40% insidens av LOH blant pasienter med NSCLC, med nesten halvparten av tumorer (23 av 48) oppviser LOH i det minste en av de mikro analysert. I samsvar med tidligere studier, plateepitelkarsinom viste høyere frekvenser av LOH på 21q22 enn adenokarsinomer. I tillegg ble en meget høy forekomst av LOH (75%) observert ved analyse av en SNP som ligger innenfor den ADAR2 genet. Disse resultater kan forklares ved eksistensen av vekslende områder med og uten LOH, og indikerer at den ADAR2 genetiske locus er en av de mest hyppig endrede områder i lunge carcinogenesis. Til sammen hyppige genetiske tap på ADAR2 locus og dens redusert uttrykk foreslå at ADAR2 potensielt fungerer som en tumor suppressor i lungekreft. Funksjonell data støtter også denne hypotesen, fordi overekspresjon av ADAR2 i kreftcellelinjer hemmer spredning og migrasjon [63], [64]. Videre har vi vist at lave ADAR2 mRNA nivåene er signifikant assosiert med total overlevelse i lunge adenokarsinom pasienter. En prognostisk poengsum basert på uttrykk for ADAR2 og fire ekstra RNA metabolisme relaterte gener (MARS, RAE1, SNRPB og SNRPE) kan stratify lungekreftpasienter i høy og lav risiko grupper for kreftdødsfall. Ytterligere forskning er warrant å undersøke om denne informasjonen kan være nyttig for å identifisere pasienter med resectable NSCLC som har høy risiko for tilbakefall og ville ha nytte av adjuvant behandling.
I konklusjonen i denne studien identifiserte vi ny RNA metabolisme -relaterte genene forskjellig uttrykt i lungekreft og assosiert med klinisk utfall. Disse resultatene støtter rollen til RNA-metabolisme i patogenesen av sykdommen. Ytterligere karakterisering av mekanismene som regulerer denne prosessen kan potensielt føre til utvikling av bedre strategier for diagnose, prognose og behandling av lungekreft.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble godkjent av etikkomiteer i Clínica Universidad de Navarra (Pamplona, Spania) og Hospital Marqués de Valdecilla (Santander, Spania). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient
microarray eksperimenter
Fire offentlig tilgjengelige microarray eksperimenter ble brukt til å identifisere RNA-metabolisme relaterte gener differensielt uttrykt mellom lunge adenokarsinom og normalt lungevev [22]. – [25]. Noen av disse forsøk omfattet data fra andre histologiske subtyper. En femte microarray eksperiment ble anvendt for å analysere forholdet mellom genekspresjon nivåer og prognosen hos pasienter med lunge adenokarsinom [26]. Tabell S3 inneholder informasjon om antall prøver og histologiske subtyper til stede i hver studie.
Lung Cancer Cell Lines og primærkulturer
Lungekreftcellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection ( ATCC, Manassas, VA). Celler ble dyrket i RPMI supplert med 2 mM glutamin, 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Liten luftveis epitelceller (SAEC) ble kjøpt fra Lonza (Walkers, MD) og dyrket i små luftveis epitelial vekstmedium (SAGM, Lonza) supplert med SAGM SingleQuots (Lonza). Normal menneskelig bronkial epitel (NHBE) celler (Clonetics, San Diego, CA) ble dyrket i bronkial epithelial cellevekst medium (BEGM, Clonetics) supplert med vekst tilskudd av BulletKit (Clonetics). Cellekulturer ble holdt ved 37 ° C og 5% CO
2 i en fuktet inkubator. Før RNA eller DNA-ekstraksjon, ble cellene testet for
Mycoplasma
forurensning, i henhold til produsentens instruksjoner (MycoAlert Mycoplasma Detection Kit, Cambrex, Rockland, ME).
kliniske prøver
primære svulster og tilhørende normale lungevev ble innhentet fra pasienter med NSCLC som behandles med kurativ resectional kirurgi ved Clínica Universidad de Navarra (Pamplona, Spania) eller på sykehuset Marqués de Valdecilla (Santander, Spania). Ingen av pasientene fikk kjemo- eller radioterapi før operasjonen. Kirurgisk fjernet prøver ble umiddelbart frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C inntil bruk. Kun prøvene som inneholdt mer enn 70% tumorceller ble anvendt. Histologier og stadier av svulstene som inngår i studien er listet opp i tabell S4. Svulster ble klassifisert i henhold til WHO 2004 klassifiseringen [77].
RNA Utvinning
RNA ekstraksjon ble utført ved hjelp av RNA Ultraspec (Biotecx Laboratories, Houston, Texas). For primær vev, ble RNA ekstraksjon utført etter mekanisk fragmentering av frosne prøver, ved hjelp av β-mercaptoethanol og RNeasy Micro (Qiagen, Hilden, Tyskland), i henhold til produsentens instruksjoner. Alle RNA-prøvene ble fortynnet i vann med DEPC og lagret ved -80 ° C inntil bruk. RNA-konsentrasjonen ble bestemt ved spektrofotometri (Nanodrop, Thermo Scientific, Wilmington, DE).
Reverse Transcription (RT)
To mikrogram RNA ble inkubert med 1 mm dNTP og 50 ng /mL oligo -dTs ved 65 ° C i 5 minutter. Etterpå ble 4 ul 5 x RT buffer, en ul 0,1 M DTT, 40 U av RNase Out og 200 U av Super Script III revers transkriptase (alle fra Invitrogen) ble tilsatt. Rørene ble inkubert i 50 minutter ved 50 ° C og 15 minutter ved 70 ° C, og deretter plassert på is. Til slutt ble to U RNase H (Invitrogen) tilsatt, og rørene ble inkubert i 20 minutter ved 37 ° C.
