Abstract
Bakgrunn
En av de viktigste mekanismene som kunne produsere motstand til antineoplastiske legemidler i kreftceller er ATP bindende kassett (ABC) transportører. ABC transportører kan betydelig redusere den intracellulære konsentrasjonen av antineoplastiske legemidler ved å øke sin utstrømning, og dermed redusere den cytotoksiske aktiviteten av antineoplastiske legemidler. En av disse transportører, har multiple motstandsdyktig protein 7 (MRP7, ABCC10), har nylig vist seg å gi resistens mot antineoplastiske medikamenter ved å øke utstrømningen av paclitaxel. I denne studien undersøkte vi effekten av BCR-Abl tyrosinkinasehemmere imatinib, nilotinib og dasatinib på aktivitet og uttrykk av MRP7 i HEK293 celler transfektert med MRP7, utpekt HEK-MRP7-2.
Metode og /eller Principal Funn
Vi rapporterer for første gang at imatinib og nilotinib reverseres MRP7-mediert multiresistens. Våre MTT analyseresultatene indikerte at MRP7 ekspresjon i HEK-MRP7-2-celler ikke ble vesentlig endret ved inkubasjon med 5 uM av imatinib eller nilotinib i opptil 72 timer. I tillegg imatinib og nilotinib (1-5 uM) ga en betydelig konsentrasjonsavhengig reversering av MRP7-mediert resistens mot flere legemidler ved å øke følsomheten av HEK-celler MRP7-2 til paclitaxel og vinkristin. Imatinib og nilotinib, 5 mikrometer, betydelig økt akkumulering av [
3H] -paclitaxel i HEK-MRP7-2 celler. Den inkubasjon av HEK-MRP7-2 celler med imatinib eller nilotinib (5 mm) også betydelig hemmet utstrømningen av paclitaxel.
Konklusjoner
Imatinib og nilotinib reversere MRP7-mediert paclitaxel motstand, mest sannsynligvis på grunn av deres hemming av utstrømningen av paclitaxel via MRP7. Disse funnene tyder på at imatinib eller nilotinib, i kombinasjon med andre antineoplastiske legemidler, kan være nyttig i behandling av visse resistente kreft
Citation. Shen T, Kuang YH, Ashby CR Jr, Lei Y, Chen A, Zhou Y, et al. (2009) Imatinib og Nilotinib Reverse multiresistens i kreftceller ved å hemme utstrømningen aktivitet av MRP7 (ABCC10). PLoS ONE 4 (10): E7520. doi: 10,1371 /journal.pone.0007520
Redaktør: Debbie Fox, The Research Institute for barn ved Children Hospital New Orleans, USA
mottatt: 11 juni 2009; Godkjent: 02.09.2009; Publisert: 20 oktober 2009
Copyright: © 2009 Shen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler fra St. Johns University Research Seed Grant No. 579-1110-7002 (Z.-S. Chen) og Primary Care Medicine Associates, PC (Flushing, NY) stipend No. 582-2082-7601 (Z. -S. Chen). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Selv om klinisk anvendelse av kirurgi, stråling og kjemoterapi har redusert gjentakelses forekomst av kreft, cellulær resistens overfor kjemoterapeutiske medikamenter er et vesentlig hinder for behandling av kreft [1], [2]. Effekten av kjemoterapi kan være begrenset på grunn av ervervet resistens fra tidligere behandling. Følgelig forskningsstrategier for å omgå en slik motstand i kreftceller har blitt en strøm fokus for utvikling av nye kombinatoriske kjemoterapeutiske strategier. Både indre og ervervet resistens kan produsere multiple endringer i ulike cellulære veier, som fører til en reduksjon i cytotoksisitet, og dermed effekten, av antineoplastiske medikamenter [3]. Derfor kan kreftpasienter som mottar flere behandlinger blitt stadig mer ufølsomme overfor kjemoterapeutiske midler.
En av de viktigste cellulære mekanismer som kan gi resistens overfor anti-neoplastisk terapi involverer utstrømning av legemidler fra kreftceller ved spesifikke transmembran-transportører eller pumper [4]. Disse transportørproteiner stammer fra superfamily av ATP-bindende kassett (ABC) transportører som deler felles strukturelle og funksjonelle egenskaper [5]. En rekke studier har vist at majoriteten av medlemmene av familien av C ABC-transportører er multiresistens proteiner (MRP), som karakteriseres ved kryss-resistens overfor mange strukturelt ubeslektede medikamenter [2], [4].
En rekke studier tyder på at kreftceller som uttrykker ABC C familien transporter MRP7 /ABCC10 kan utvikle resistens mot ulike cellegifter. For eksempel, human spyttkjertel adenokarsinom (SGA) celler som overuttrykker MRP7 mRNA og protein MRP7 skjermen betydelig motstand mot vincristin [6]. MRP7 ekspresjon er også blitt immunhistokjemisk identifisert i tumorbærende mus med human xenopodet SGA etter behandling med vincristin [6]. Videre E
217βG, en kompetitiv hemmer av MRP7 transport, betydelig redusert docetaxel akkumulering i menneske SGA celler [6]. Overall, forbindelser som er hemmere av MRP7 transportaktivitet dempe eller omvendt motstand i kreftceller som uttrykker MRP7 protein.
De MRP7-overekspresjon celler gir resistens mot flere kreft narkotika inkludert paclitaxel, vinkristin og vinblastin [7]. Nye papirer rapporterte også at MRP7-overexpresssing celler gir resistens mot nukleosidanaloger og epithilone B [8]. Tidligere, i vårt laboratorium, har vi vist at cepharanthine, en biscoclaurine-avledet alkaloid, reversert MRP7-mediert paclitaxel motstand [9].
tyrosinkinaseinhibitorer (TKI) kan reversere resistens av kreftceller til antineoplastiske medikamenter gjennom flere mekanismer. For eksempel, i menneskelige SGA celler, MRP7, P-gp, og MRP1 var alle oppdaget etter langvarig eksponering for vinkristin [6]. Nylig har vi og andre rapporterte at noen av TKI er potente modulatorer av ABC transportører, inkludert P-gp og BCRP /ABCG2 [10], [11]. Nyere resultater fra vårt laboratorium antydet at nilotinib betydelig reverserer P-GP- og BCRP-mediert MDR [12].
I denne studien, en av hovedmålene var å identifisere TKI forbindelser som ville reversere MRP7 formidlet medisin motstand. Følgelig er det mulig at TKI, i kombinasjon med andre antineoplastiske medikamenter, kan være anvendbare ved behandling av cancer som uttrykker MDR proteiner, inkludert ABC-transportører. En viktig oppdagelse om TKI var at visse såkalte «lite molekyl» narkotika kunne inhibere TK-aktivitet ved å konkurrere med ATP for binding til det intracellulære katalytiske domenet av reseptoren TKs, som produserte inhibering av ulike nedstrøms signalkaskader av autofosforylering [13]. Interessant, imatinib, nilotinib og dasatinib hemmer TK stoppunkt cluster region Abelson (BCR-ABL) og KIT, en klasse III reseptor TK [14] – [18]. BCR-abl-genet er assosiert med en feilregulering av TK funksjon og senere fører til malign transformasjon i kronisk myelogen leukemi (CML) [19], [20]. Anerkjennelsen av BCR-abl-gen og dets tilsvarende protein har ført til utvikling av små-molekyl medikamenter utformet for å blokkere aktiveringen av Bcr-Abl-TKI gjennom konkurrerende binding ved ATP-bindingssetet [19]. Totalt sett, det primære målet med denne studien var å finne ut om BCR-Abl TKI kunne reversere MRP7-mediert MDR.
Materialer og metoder
2,1. Cellelinjer
HEK293 celler og MRP7 cDNA ble sjenerøst gitt av Dr. Gary kruh (University of Illinois i Chicago, Chicago, IL). De transfekterte HEK-MRP7-2 celler og tom vektor transfekterte HEK293-pcDNA3.1 celler ble etablert fra HEK293 celler gjennom electroporation [9]. Foreldre narkotika-sensitive human epidermoid carcinoma cellelinje KB-3-1 og dens tilhørende P-gp-overekspresjon cellelinje KB-C2 ble vennlig levert av legene. Gottesman (NCI, Bethesda, MD) og Akiyama (Kagoshima University, Japan), henholdsvis. De KB-C2-celler ble etablert fra KB-3-1-celler ved å eksponere dem til økende konsentrasjoner av kolkisin i en gradvis trinnvis (opp til 2 ug /ml) og høsting av celler som var resistente [20]. Alle disse cellelinjer ble dyrket som adherente monosjikt i kolber med Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% bovint serum, 2 mM glutamin, 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin under standard celledyrkningsbetingelser i et fuktet inkubator med 5% CO
2 ved 37 ° C.
2,2. Materialer
DMEM, bovin serum og penicillin /streptomycin ble kjøpt fra Hyclone (Logan, UT). Nilotinib (Tasigna®) (Fig. 1B) ble oppnådd som en gave fra Novartis (Basel, Sveits). Imatinib (Fig. 1A) og dasatinib (Fig. 1C) ble kjøpt fra ChemieTeck Inc. (Indianapolis, IN). Paclitaxel, vincristin, doxorubicin, colchicin, p-aminophenylmethylsulfonyl fluorid, bovint serumalbumin, dimetylsulfoksid (DMSO) og 1- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -3,5-diphenylformazan (MTT), det polyklonale antistoff geit mot MRP7 (C-19), det monoklonale museantistoff mot P-gp (P7965), den sekundære pepperrot peroksidase-merket anti-geit eller anti-muse-IgG ble ervervet fra Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO) . En polyklonale antistoff mot humant MRP1 /ABCC1 ble vennlig levert av Dr. Akiyama (Kagoshima University, Japan) [21]. Et monoklonalt antistoff BXP-34 mot BCRP ble kjøpt fra Signet Laboratories Inc. (Dedham, MA). [
3H] -paclitaxel (45 pCi /mmol) ble kjøpt fra Moravek Biochemicals (Brea, California).
2,3. Fremstilling av cellelysatene
Sammenflytende monolag celler i T-25-kolbe ble høstet og skylt to ganger med kald PBS. Celleekstrakter ble fremstilt ved å bruke radioimmunopresipitasjonsanalyse analysebuffer [1 x PBS, 1% Nonidet P-40, 0,5% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS, 100 mM p-APMSF, 10 uM leupeptin, og 10 uM aprotinin] i 30 min videre is med tilfeldig rokking fulgt av sentrifugering ved 12.000 rpm ved 4 ° C i 15 min. Proteinkonsentrasjonene av cellelysater ble bestemt ved hjelp av Bradford-proteinanalysen [22]. Supernatanten inneholdende totale cellelysatene ble samlet og lagret ved -80 ° C inntil bruk.
2,4. Immunoblotting
lik mengde av totale cellelysater (40 ug) ble løst ved 4-12% natriumdodecylsulfat polycrylamide gel-elektroforese (SDS-PAGE) og elektroforetisk overført til nitrocellulosemembraner [23]. Cellelysatene ble denaturert i et 100 ° C vann begerglass i 5 min før lasting på en 4-12% SDS-PAGE. Gelen ble kjørt i SDS-elektroforese buffer (25 mM Tris-base, 0,192 M glycin, 1% SDS) ved 170 V i 2 timer. Overføringen ble utført i en overføringsbuffer (25 mM Tris-base, 0,192 M glycin, pH 8,3) ved 30 V i 2 timer. Nitrocellulosemembranen ble deretter neddykket i 5% skummet melk for å blokkere ikke-spesifikk binding i 1 time ved romtemperatur. Membranen ble så immunoblottet natten med primære antistoffer (polyklonale MRP7 eller monoklonalt P-gp og BCRP antistoffer på 1:500 og polyklonale MRP1 på 1:3,000) ved 4 ° C. Den følgende dag, ble membranen vasket tre ganger med TBST-buffer (0,3% Tris, 0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,05% Tween 20), etterfulgt av en tre-timers inkubering med sekundære antistoffer av polyklonale anti-MRP7 eller monoklonalt anti- P-gp på 1:1000. Protein-antistoff-komplekset ble målt ved bruk av et forbedret kjemiluminescens påvisningssystem (Amersham, NJ). Membranen ble deretter eksponert for film for fremkalling. Den konvensjonelt brukte lasting kontroll aktin ble brukt til å oppdage lik belastning i hvert kjørefelt i prøvene fremstilt av cellelysatene.
2,5. Analyse av narkotika følsomhet
Drug følsomhet ble analysert ved hjelp av en litt modifisert MTT kolo analyse [23]. Tom vektor transfektert HEK293-celler og pcDNA3.1 MRP7-transfekterte HEK293-MRP7-2 celler ble sådd i 96-brønns plater i triplikat ved 5000 celler /brønn. Etter inkubering i DMEM supplert med 10% bovint serum ved 37 ° C i 24 timer, ble de antineoplastiske medikamenter fortynnet til forskjellige konsentrasjoner og inkubert med cellene kontinuerlig i 72 timer. De potensielle inhibitorer ble tilsatt en time før tilsetningen av anticancer legemidler.
Etter medikament inkubering av 72 timer, 20 ul MTT (4 mg /ml) ble tilsatt til hver brønn og platen ble inkubert i ytterligere 4 t, slik at levedyktige celler til å utvikle seg fra den gule-farget MTT i mørk blå formazankrystaller. Deretter ble mediet forsiktig fjernet uten agitering av klebe monolag av celler, og 100 ul DMSO ble tilsatt i hver brønn for å oppløse de formazankrystaller. Platene ble godt ristet i 5 min, og en OPSYS mikroplateavleser lese absorbansen ved 570 nm fra DYNEX Technologies Inc. (Chantilly, VA). Graden av motstand ble beregnet ved å dividere IC
50 for MDR-celler ved at de foreldrecellene, mens graden av MDR reverse ble beregnet ved å dividere IC
50 av cellene med anticancer medikamentet i fravær av inhibitor ved det som ble oppnådd i nærvær av inhibitoren. Konsentrasjonene som er nødvendige for å inhibere vekst med 50% av kontrollcellene ble beregnet ut fra overlevelseskurver ved hjelp av Bliss metoden [23].
antineoplastiske medikamenter brukt omfattet paclitaxel, vincristin og doxorubicin ved varierende konsentrasjoner opp til en endelig konsentrasjon 10, 1, og 1 pM, henholdsvis. BCR-Abl TKI, slik som nilotinib og imatinib, ble senere brukt på giftfri konsentrasjoner på 1, 2,5 og 5 mikrometer for å skjerme mot vinkristin og doxorubicin. I denne studien har vi først valgt et enkelt giftfri dose (5 mm) for å undersøke effekten av TKI på MRP7-mediert resistens mot paclitaxel. Når vi bestemt hvilke TKI hadde mest betydnings reversering effekt, for eksempel imatinib og nilotinib, vi senere valgte tre konsentrasjoner (1, 2,5 eller 5 mm) for hver TKI å avgjøre om deres reverseringseffekter var konsentrasjonsavhengig til paclitaxel, vinkristin og doxorubicin .
2,6. Drug akkumulering og effluks
HEK293-pcDNA3.1 parentale celler og HEK-MRP7-2 transfekterte celler ble sådd i to T75 kolber og inkubert med DMEM supplert med 10% bovint serum ved 37 ° C. Etter at cellene var 60 til 95% konfluens, ble hver inhibitor tilsatt til separate kolber og cellene ble inkubert i 1 time. Cellene ble så trypsinert og to porsjoner (48 x 10
6 celler) fra hver cellelinje ble suspendert i mediet. Deretter ble cellene suspendert i medium inneholdende [
3H] -paclitaxel ved en konsentrasjon på 0,1 mM, med eller uten TKI nilotinib og imatinib (5 pM) i 1 time ved 37 ° C. En time senere ble inkubasjonsmediet erstattet med medium inneholdende det TKI uten paclitaxel. Alikvoter (1 x 10
6 celler) ble oppsamlet ved forskjellige tidspunkter (0, 20, 60 og 120 min). Cellene ble deretter vasket med iskald PBS, og hver prøve ble plassert i scintillasjonsvæske for å måle radioaktivitet i en Packard TRI-CARB 1900CA væskescintillasjonsteller fra Packard Instrument Inc. (Downers Grove, IL).
2,7. Statistisk analyse
Alle forsøk ble gjentatt minst tre ganger, og de forskjeller ble bestemt ved to-halet t-test. Den a priori statistisk signifikans ble satt til
P
. 0,05
Resultater
3,1. Uttrykk av MRP7 i HEK293-pcDNA3.1 og HEK-MRP7-2 celler
I denne studien, de to cellelinjene benyttet var HEK293 celler transfektert med enten MRP7 ekspresjonsvektoren eller tom vektor kontroll (pcDNA3.1 ). Immunoblot-analyse ble utført for å påvise ekspresjon nivået av MRP7 protein i de nevnte linjer. MRP7 protein (MW 171 kD) ble uttrykt i HEK-MRP7-2 celler, men ikke i HEK293-pcDNA3.1 celler (Fig. 2A). P-gp, med en molekylvekt på 170 kD ble påvist i de positive kontroll KB-C2-cellelinjer, men ikke i den negative kontroll KB-3-1, HEK293-pcDNA3.1 eller HEK-MRP7-2 cellelinjer ( fig. 2B). Vi har også gjennomført Western blot eksperimenter for å finne ut om MRP1 og BCRP ble uttrykt i HEK293-pcDNA3.1 og HEK-MRP7-2 celler. Nivåene av MRP1 og BCRP i begge HEK-MRP7-2 celler og HEK293-pcDNA3.1 cellene var umulig å oppdage. Disse funnene er viktige, så eventuelle effekter observert med hemmere er usannsynlig å være på grunn av deres interaksjon med P-gp, MRP1 og /eller BCRP.
(A) Uttrykk for MRP7 i HEK293-pcDNA3.1 ( kolonne 1) og MRP7-transfekterte celler (kolonne 2). (B) Ekspresjon av P-gp i HEK293-pcDNA3.1 (spor 1), HEK-MRP7-2 (spor 2), KB-3-1 (felt 3) og KB-C2-celler (spor 4). (C) Virkning av 5 uM av imatinib på ekspresjonsnivået av MRP7 (HEK-MRP7-2) i 36 og 72 timer henholdsvis. (D) Effekt av fem mikrometer av nilotinib på uttrykket nivået av MRP7 (HEK-MRP7-2) for 36 og 72 timer, henholdsvis. Like mengder (40 ug protein) av totalt cellelysat ble anvendt for hver prøve. Nitrocellulose-membranene ble immunoblottet med primært antistoff mot MRP7 eller aktin ved 1:500 fortynning, eller P-gp i 1:500 fortynning ved 4 ° C over natten, og deretter inkubert med HRP-konjugert sekundært antistoff ved 1:1000 fortynninger ved romtemperatur i 3 timer.
for å evaluere effekten av imatinib /nilotinib på uttrykk for MRP7 ble HEK-MRP7-2 celler inkubert med 5 mikrometer av imatinib eller nilotinib for 36 og 72 timer, henholdsvis . Inkubasjon av HEK-MRP7-2 celler med imatinib eller nilotinib ikke vesentlig endre uttrykket av proteinnivåer MRP7 ved ulike tidspunkt (Fig. 2C og D). Dette tyder på at effekten av hemmere på responsen av celler til kreftmedisiner er ikke på grunn av reguleringen av MRP7 uttrykk.
3,2. Analyse av medikamentsensitivitet av MRP7-transfekterte HEK293-celler
For å bestemme medikamentresistensprofilen av MRP7, følsomheten av HEK-MRP7-2 transfekterte celler til spesifikke antineoplastiske medikamenter ble sammenlignet med den i den vektor eneste styre celler, HEK293-pcDNA3.1. De HEK-MRP7-2 celler, viste en betydelig høyere grad av motstand mot paclitaxel og vinkristin (9.5- og 6.7 ganger resistens i forhold til kontrollcellene, henholdsvis) (tabell 1). Resultatene indikerte at HEK-MRP7-2 cellelinjen var i stand til å gi resistens mot ulike antineoplastiske medikamenter, noe som er i tråd med vår forrige rapport [9].
3,3. Effekten av TKI på følsomheten MRP7-transfektert HEK293 celler til kreftmedisiner
Vi testet flere BCR-Abl TKI å finne ut om de kunne snu motstanden HEK293 celler overekspresjon MRP7 til antineoplastiske narkotika paclitaxel og vinkristin. Størrelsen av reverseringen produsert av TKI til paclitaxel var variabel (tabell 1. Fig. 3). Den preinkubasjon av cellene med imatinib eller nilotinib, ved 2,5 uM, vesentlig tilbake motstanden av HEK-celler MRP7-2 til paclitaxel (tabell 1, Fig. 3A og 3B). Imatinib og nilotinib produsert en henholdsvis 6,9 og 13,0 ganger reversering, henholdsvis, av motstanden til paclitaxel. IC
50 av paclitaxel i HEK-MRP7-2-celler ko-dyrket med 2,5 uM av nilotinib ble signifikant redusert fra 207,0 ± 19,7 nM til 15,9 ± 0,9 nM, og dette var signifikant lavere enn den til paklitaxel i kontrollgruppen (21,9 ± 1,9 nM). Motstanden til paclitaxel ble fullstendig reversert når imatinib ble co-inkubert med paclitaxel i HEK-MRP7-2 celler. En signifikant større reversering ble oppnådd på 5 um (12,4-ganger) i forhold til en pM (4,7 ganger) konsentrasjon. Imatinib, ved 5 pM, øker også følsomheten av celler til paclitaxel i HEK293-celler ved pcDNA3.1 2,2-fold, men denne effekten i HEK293-pcDNA3.1 var signifikant lavere enn i de MRP7 transfekterte cellene (12,5 ganger) (tabell 1). Resultatene indikerte at BCR-ABL TKI imatinib og nilotinib betydelig svekket motstand mot paclitaxel mediert av MRP7. Selv om ko-inkubering av HEK293-pcDNA3.1 (kontrollceller) med nilotinib og paclitaxel også forbedret følsomhet for paclitaxel (en 2,5-gangers forskyvning i HEK293-celler pcDNA3.1), denne forbedrede følsomhet var signifikant lavere enn bestemt for de MRP7 transfekterte celler (Tabell 1, fig. 3C). I kontrast, fant en annen BCR-Abl TKI, dasatinib på 2,5 mikrometer, ikke signifikant forbedre paclitaxel følsomhet i enten HEK293-pcDNA3.1 eller HEK-MRP7-2 celler (tabell 1, fig. 3C).
To cellelinjer, HEK293-pcDNA3.1 og HEK-MRP7-2, er representert som HEK293 og MRP7 hhv. Etter utsåing og dyrking celler i 24 timer, like mengder av PBS eller reverseringsmidler ble tilsatt inn i HEK293-celler pcDNA3.1 (vist som og, henholdsvis) og HEK-celler MRP7-2 (vist som og, henholdsvis) en time før tilsetningen av paclitaxel. De forskjellige konsentrasjoner av paclitaxel ble antydet i figuren. Den endelige konsentrasjonen for imatinib, nilotinib eller dasatinib var 2,5 mikrometer. Figuren over viser et representativt resultat for imatinib, nilotinib eller dasatinib.
I tillegg til paclitaxel, vi også undersøkt effekten av den valgte TKI å bevisstgjøre celler til en annen kreft narkotika, vinkristin. I likhet med funnene med paclitaxel, nilotinib og imatinib (1, 2,5 og 5 mm) vesentlig tilbake MRP7-mediert vinkristin motstand (2.1-, 6.8- og 9.0-fold, henholdsvis for nilotinib, 2.4-, henholdsvis 6,9 og 8,2 ganger henholdsvis for imatinib) på en konsentrasjonsavhengig måte (tabell 1). Vi har også undersøkt responsen til MRP7-transfekterte celler til en annen anticancer-medikament, doxorubicin, i nærvær av imatinib, som doksorubicin er ikke et substrat av MRP7 [23]. Våre resultater viste at imatinib (1, 2,5 og 5 uM) ikke signifikant sensitivisere responsen til styreforeldre HEK293-celler pcDNA3.1, eller reversere resistens i HEK-MRP7-2 transfekterte celler, (tabell 1) for doxorubicin. Dette indikerer at responsen på disse TKI var bestemt for MRP7, som doxorubicin er ikke et substrat for MRP7 og dermed ville ikke megle doxorubicin utstrømming. Doksorubicin er et substrat for P-gp, MRP1 og BCRP, men verken imatinib eller nilotinib betydelig økt doxorubicin følsomheten HEK-MRP7-2 celler, noe som tyder på at P-gp, MRP og BCRP ikke bidra vesentlig til stoffet motstanden HEK- MRP7-2.
Totalt imatinib og nilotinib vesentlig tilbake MRP7-mediert resistens mot paclitaxel og vinkristin, men ikke doxorubicin. Videre er denne reverseringen var konsentrasjonsavhengig (tabell 1. Fig. 3). Selv om en økning i sensibilisering av HEK293-pcDNA3.1 kontrollceller oppstått ved eksponering for nilotinib eller imatinib, var denne effekt signifikant lavere enn bestemt for de HEK-MRP7-2 transfekterte celler (Tabell 1, Fig. 3).
3,4. Effekten av imatinib og nilotinib på intracellulær akkumulering og utstrømming av [
3H] -paclitaxel
For å bestemme den mekanismen som imatinib og nilotinib vinne eller omvendt MRP7-mediert paclitaxel motstand, deres effekt på akkumulering av [
3H] -paclitaxel i MRP7-transfekterte celler ble undersøkt. Den intracellulære konsentrasjonen av [
3H] -paclitaxel i HEK-MRP7-2 celler var 30% av den som akkumuleres av HEK293-celler pcDNA3.1 (fig. 4). Oppbyggingen av paclitaxel ble betydelig forbedret (1,9 ganger) i HEK-MRP7-2 celler (P 0,05) etter inkubasjon av celler med enten imatinib eller nilotinib ved en konsentrasjon på 5 uM. I HEK293-pcDNA3.1 celler, imatinib, men ikke nilotinibs, hadde resultert i en svak økning i den intracellulære konsentrasjonen av [
3H] -paclitaxel, men dette allergi var beskjeden i forhold til effekten av imatinib i HEK-MRP7- 2 celler.
de intracellulære paclitaxel ansamlinger i HEK293-pcDNA3.1 og HEK-MRP7-2 celler ble målt etter inkubasjon med 0,1 mikrometer paclitaxel. Intracellulær akkumulering av paclitaxel i HEK293-pcDNA3.1 celler i fravær av imatinib og nilotinib ble vist i venstre barer (▪). Intracellulær akkumulering av paclitaxel i nærvær av 5 uM av imatinib i HEK293-pcDNA3.1-celler ble vist til høyre (□). Intracellulær akkumulering av paclitaxel i HEK-MRP7-2 celler i nærvær av fem mikrometer av nilotinib ble vist til høyre (). Hver kolonne representerer midler (± SD). Alle forsøk ble utført in triplo. * P 0,05, Students t test
Basert på de ovenfor angitte resultater, er det mulig at økningen i intracellulær paclitaxel produsert av imatinib og nilotinib kan skyldes: (1) en reduksjon i den. effluks av paclitaxel og /eller, (2) en økning i opptak av paclitaxel. Derfor er det neste eksperiment ble utført for å bestemme om økningen i paclitaxel opphopning produsert av imatinib og nilotinib var på grunn av en inhibering av paclitaxel effluks. HEK-celler og MRP7-2 HEK293-pcDNA3.1-celler ble inkubert med paklitaxel og et tidsforløp for intracellulær akkumulering av legemidlet ble bestemt (Fig. 5). Som forventet, HEK-celler MRP7-2 frigjøres en betydelig høyere prosentandel av samlet paclitaxel i forhold til HEK293-celler pcDNA3.1, og mengden av paclitaxel som var effluxed øket med tiden. Paclitaxel akkumulering ved 0 min på legemiddelavgivelsen ble satt til 1. Etter 60 min, i celler inkubert i medikamentfritt medium, ble -60% av den akkumulerte paclitaxel eksportert fra HEK-MRP7-2-celler i fravær av imatinib eller nilotinib . I motsetning til nesten alle av paclitaxel var til stede inne i HEK-MRP7-2 celler inkubert med imatinib eller nilotinib ved en sluttkonsentrasjon på 5 pM over ulike tidsperioder. For kontrollcellene, konsentrasjonen av paclitaxel utsatt for utstrømning økte også med tiden, men graden av effluks var bare litt mindre enn den som ble observert i celler transfektert med MRP7. I motsetning til dette, i HE293-pcDNA3.1-celler, ble ~ 30% av den paclitaxel frigitt etter 60 minutter i fravær av testforbindelsene. Den inkubasjon av HEK293-pcDNA3.1 celler med imatinib eller nilotinib (5 pM) hemmet også utstrømningen av paclitaxel, selv om størrelsen av effekten var betydelig lavere enn det som ble observert for de HEK-MRP7-2 celler.
prosent~~POS=TRUNC av paclitaxel frigjort ble plottet som en funksjon av tid. Etter en time av inkubasjon av TKI, [
3H] -paclitaxel var co-inkubert i HEK293-pcDNA3.1 med TKI () eller uten TKI (), og i mellomtiden i HEK-MRP7-2 celler med TKI () eller uten TKI (). Cellene ble vasket og på nytt inkubert i paclitaxel-fritt medium. Ved tidspunktene for 0 min, 20 min, 60 min og 120 min ble cellene samlet og nivåene av [
3H] -paclitaxel ble bestemt ved scintillasjonstelling. Verdiene ved 0 min på legemiddelavgivelsen ble angitt som en for sammenligning med verdier målt fra andre tidspunkter. Hvert punkt representerer midler (± SD) av tre adskilte eksperimenter gjort ved hjelp triplikatprøvene.
Diskusjoner
Denne studien var den første til å identifisere at BCR-ABL TKI imatinib og nilotinib , men ikke dasatinib, vil kunne snu MRP7-mediert MDR i en konsentrasjonsavhengig måte.
HEK293 celler transfektert med den rekombinante genet MRP7 HEK-MRP7-2, og HEK293-pcDNA3.1-celler transfektert med tom vektor, ble brukt til testing av MRP7 utstrømming funksjon. Disse transfekterte cellelinjer tidligere er blitt brukt i studier utviklet for å bestemme effektene av cepharanthine for reversering av MRP7-mediert resistens overfor paclitaxel [9]. I denne studien ble bekreftet Western blot-analyse at transfeksjon av celler med MRP7 var vellykket, som MRP7 proteiner ble uttrykt bare i HEK-MRP7-2 celler, og ikke i HEK293-celler pcDNA3.1 (fig. 2). Cellelinjene ble utsatt for de samme forsøksbetingelser og fremgangsmåter, og ble dyrket med de samme antineoplastiske medikamenter for samme inkubasjonstid. Det kan argumenteres for at MRP7-transfekterte celler uttrykte andre proteiner, i tillegg til MRP7, slik som P-gp, som kan ha bidratt til MDR. Imidlertid Western blot-analyse indikerte at hverken HEK293-pcDNA3.1 kontrollcellelinje, og heller ikke den HEK-MRP7-2 transfektert cellelinje som uttrykte detekterbare nivåer av P-gp (fig. 2), som også kan formidle MDR. I tillegg MRP1 og BCRP var umulig å oppdage både kontroll HEK293-pcDNA3.1 og transfekterte HEK-celler MRP7-2 gjennom Western blot-analyse (data ikke vist). Derfor er disse resultatene indikerer at HEK-MRP7-2 transfektert cellelinje spesifikt uttrykt MRP7, men ikke P-gp, MRP eller BCRP.
Tidligere er det blitt rapportert at cepharanthine og nilotinib vesentlig tilbake P- gp-mediert MDR i HEK-MRP7-2 celler [9] og BCRP-overekspresjon cellelinjer [24], henholdsvis. Siden MRP7 og P-gp er like i struktur og funksjonell aktivitet, har vi designet eksperimenter for å finne ut om nilotinib kunne reversere MRP7-mediert legemiddelresistens til paclitaxel. På grunn av den strukturelle likheten mellom MRP7 og P-gp, en tidligere studie indikerte at enkelte P-gp-hemmere var i stand til å betydelig reversere paclitaxel motstand i HEK-MRP7-2 celler overekspresjon MRP7 [9]. Vi fant ut at nilotinib (2,5 mm) betydelig sensibilisert MRP7-transfektert HEK293 celler til paclitaxel som det markant redusert IC
50 av paclitaxel i MRP7-trasnfected celler, sammenlignet med kontrollceller. Selv om nilotinib er en inhibitor av P-gp [24], er dette ikke en problemfaktor i våre eksperimenter som P-gp-protein ikke uttrykkes i enten HEK293-pcDNA3.1 eller HEK-MRP7-2 celler (Fig. 2) .
i denne studien fant vi at spesifikke TKI: 1) betydelig redusert motstand mot paclitaxel i MRP7-overekspresjon celler (tabell 1, fig 3), 2) hadde signifikant bevisst responsen til paclitaxel i den tomme. vektor transfekterte celler, men effekten var signifikant lavere enn i de MRP7 transfekterte celler (fig. 3), og 3) ikke signifikant hemmer eller induserer MRP7 ekspresjon (fig. 2C og D). Samlet disse funnene tyder på at forsøksvis av TKI brukt i denne studien, imatinib og nilotinib er i stand til å reversere MRP7-mediert resistens ved å inhibere funksjonen av MRP7. Blant TKI som ble testet mot paclitaxel, BCR-ABL TKI imatinib og nilotinib på 5 mikrometer helt snudd MRP7-mediert paclitaxel motstand av en størrelsesorden av 12.5- og 21,0 ganger i henholdsvis (tabell 1). I motsetning til dette, en annen BCR-Abl TKI, dasatinib, ga ingen signifikant reversering av MRP7-mediert paclitaxel motstand (tabell 1. Fig. 3C). Foreløpig gjenstår forklaringen på forskjellen mellom dasatinib sammenlignet med nilotinib eller imatinib skal fastsettes. En mulig tilnærming som kan gi innsikt i dette problemet ville være at strukturelle-aktivitetsforhold (SAR). Basert på deres kjemiske strukturer (fig. 1), mangler dasatinib en to-phenylaminopyrimidine ring som er til stede i strukturene til nilotinib og imatinib. Det er mulig at fravær av denne ringen i dasatinib kan være en viktig faktor som skiller dasatinib aktivitet fra den enten nilotinib eller imatinib. Detaljert struktur-funksjon studier vil være nødvendig å avgrense SAR for samspillet mellom disse TKI med MRP7-overekspresjon celler. I tillegg ble det foreslått at de HEK293-pcDNA3.1 celler ble også sensibilisert ved samtidig bruk av nilotinib eller imatinib (tabell 1, Fig. 5).
