Abstract
Evasion av apoptose er involvert i nesten alle aspekter av kreft progresjon, samt som behandling motstand. I denne studien ble resistens mot apoptose i tumorigen identifisert lunge epitel (A549) celler som følge av defekter i mitokondrie og autophagic funksjon. Mitokondrienes funksjon bestemmes delvis av mitokondrie morfologi, en prosess regulert av mitokondrie dynamikk der sammenføyning av to mitokondriene, fusion, hemmer apoptose mens fisjon, deling av en mitokondrie, starter apoptose. Mitokondrie morfologi av A549 celler vises en langstrakt fenotype-ligne celler mangelfull i mitokondrie fisjon protein, dynamin relaterte protein 1 (Drp1). A549 cellene hadde svekket Drp1 mitokondrie rekruttering og redusert Drp1 avhengig fisjon. Cytokrom c release og caspase-3 og PARP cleavage ble svekket både basalt og med apoptotiske stimuli i A549 celler. Økt mitokondrie massen ble observert i A549 celler, noe som tyder på feil i mitophagy (mitokondrie selektiv autofagi). A549 cellene hadde gått ned LC3-II lipidering og lysosomal hemming tyder defekter i autofagi skje oppstrøms lysosomal degradering. Immunfarging angitt mitokondrielle lokalisert LC3 punctae i A549-celler økte etter mitokondriell frakopling eller med en kombinasjon av mitokondriell depolarisering og ektopisk Drp1 uttrykk. Økt inhibering av apoptose i A549 celler er korrelert med hindret mitokondrie fisjon og mitophagy. Vi foreslår mitokondrie fisjons defekter bidra til apoptotisk motstand i A549 celler
Citation. Thomas KJ, Jacobson MR (2012) Defekter i Mitokondrie Fisjon Protein dynamin-Related Protein 1 er knyttet til apoptotisk Resistance og Autophagy i en Lung Cancer Modell. PLoS ONE 7 (9): e45319. doi: 10,1371 /journal.pone.0045319
Redaktør: Janine Santos, medisinske og odontologiske av New Jersey, USA
mottatt: 10 april 2012; Godkjent: 20 august 2012; Publisert: 20.09.2012
Copyright: © Thomas, Jacobson. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. St. Marys Hospital og Regional Medical Center, St. Marys Hospital Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er et stort folkehelseproblem over hele verden. Nåværende strategier for behandling av kreft (kjemo- og stråleterapi), er basert på å drepe tumorceller ved hjelp av mekanismer i stor grad som medieres ved aktivering av apoptose. Apoptose er en fredet cellulære prosessen som styrer normal utvikling og vev homeostase ved å eliminere skadede celler. Inhibering av apoptose bidrar til tumorigen omdannelsen av normale celler ved å utvide deres levedyktighet, favoriserer akkumulering av transformerende mutasjoner [1]. Motstand mot apoptose er knyttet til økt invasiv og metastatisk potensial i kreftceller [2].
En klassisk kreft kjennetegn er apoptotisk motstand [3]. Hvordan kreftceller unndra apoptotisk celledød er foreløpig ukjent, men økende svulst følsomhet for apoptose er en terapeutisk mål. Fraværet av spontan apoptose og behandling-indusert apoptose i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) antyder at mangler ved den apoptotiske prosess kan være ansvarlig for deres resistens mot anticancerterapi [4]. Genmutasjoner og endret uttrykk for apoptose regulatorer oppdages i lungekreft. Forskjeller i følsomhet for terapeutiske midler som induserer apoptose kan være relatert til ekspresjon av apoptose regulatorer i lungekreft. Anti-apoptotiske modulerende terapi blir grundig undersøkt [3].
Intrinsik apoptose er karakterisert ved permeabiliseringen av mitokondrier, frigjøring av cytokrom c, og aktiveringen av caspase kaskade [5]. Mitokondriell kontroll av apoptose oppstår oppstrøms for kaspase-aktivering og er mediert av Bcl-2-familien av proteiner [5]. BCL-2 proteiner påvirker også mitokondrielle dynamikk, en prosess som balanserer mitokondrielle fisjon og fusjon arrangementer for å regulere form, struktur og funksjon av mitokondrie [5]. Mitokondriene er dynamiske organeller hvorved sin form svarer til den metabolske status [6], er nødvendig for helsen til cellen [7] og balansen mellom fusjon og fisjon for homeostase. Normalt mitokondrie fisjon mekler Drp1 fragmenter mitokondriene [5]. Drp1 er en stor GTPase som styrer membranen tubulation og fisjon i pattedyrceller [5]. Celler gjennomgår mitokondrielle fisjon vil ha kortere mitokondriell lengde sammenlignet med celler som gjennomgår mitokondrie-fusjons [8]. Selv om disse hendelsene er forbigående, vil celler som mangler en mitokondriell dynamikk protein eller under stimuli opprettholde tilstandsavhengig mitokondriell morfologi [6]. Overdreven mitokondriell fisjon (fragmentering) er avgjørende for å oppnå egen apoptose-det er nødvendig for cytokrom c frigjøring og etterfølgende caspaseaktivering [5].
Inhibering av Drp1-avhengige mitokondrie fisjons- svekker og delvis inhiberer apoptose indre [7]. Samtidig med mitokondriemembranen permeabilization i løpet av apoptose, danner Drp1 oligomerer og er rekruttert til det ytre mitokondriemembranen til å mediere fisjon i en GTP-avhengig måte [5]. Fisjons hendelser megle apoptose ved å regulere utslipp av pro-apoptotiske faktorer til cytosol. Hemming av Drp1 hindrer mitokondriemembranen potensial kollaps og cytokrom c utgivelsen, og fremmer langstrakte mitokondrie morfologiske fenotyper [5]. Inhibering av mitokondrie fisjons forbyr cytokrom c translokasjon og forsinkelser celledød, og dermed tilveiebringe en kobling mellom mitokondrielle dynamikk og induksjon av apoptose.
Mitochondrial dynamikk ikke bare innvirkning indre apoptose, men også omdirigere autophagic degradering. Omfattende krysstale eksisterer mellom mitophagy og apoptose [9]. Inhibering av fisjonsmediatorer slik som dynamin-relaterte protein 1 (Drp1), noe som svekker indre apoptose [10], har vist seg å redusere mitophagy [11]. Nedregulering av autofagi under tumorprogresjon har blitt bemerket i mange studier [12]. Økt tumorgenisitet har vist seg å redusere proteindegradering i lunge epitelceller [13]. Den negative regulator av autophagy, mTOR (mammalian target rapamycin), er hyppig aktiveres [14] og mTOR-inhibitorer har blitt vist å begrense tumor proliferasjon i NSCLC-modeller [15].
Motstand mot apoptose er knyttet til mitokondriene og proteiner som er involvert i mitokondrie dynamikk. Imidlertid er det ikke kjent om tumorceller oppnå resistens mot apoptose ved å endre mitokondrielle dynamikk. I denne studien, karakterisert vi mitokondrielle dynamikk og nedstrømsprosessen av apoptose i lungekreftceller. Forskjeller i mitokondrie morfologi og funksjon ble observert i A549 celler. Vi gir bevis i lungekreftceller som tyder på en ubalanse i mitokondrie dynamikk eksisterer, hvor defekter i Drp1 avhengige mitokondrie fisjon hemme nedstrømsprosessen autofagi og bidra til apoptotisk motstand.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC og Plasmider
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP som er kjøpt fra ATCC (tabell I) ble dyrket som beskrevet tidligere [16]. Live-celle bildebehandling ble utført i fenol rødt gratis (PRF) OptiMem (Invitrogen). Plasmider [16] for mitokondrie YFP (mito-YFP, Clontech), Drp1-YFP [17], Drp1-myc [18], Drp1 K38A-myc [18], og Drp1 RNAi [19] var gaver fra Dr. Richard Youle (ninds, Bethesda, MD) og ble transfektert inn i cellene ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) som anvist av produsenten. Pletterte celler (10
4 celler /brønn) ble sådd ut og dyrket i fullstendig OptiMem i 24 timer ved 37 ° C, før behandlingen og fluorescerende intensitet lesing. Celler behandling følger: Inkubering med 1 uM staurosporin (STS, Sigma) og /eller 50 uM zVAD-FMK (Sigma) i 3 timer i PRF OptiMem uten serum i apoptotiske analyser. Cellene ble sultet hjelp EBSS (Invitrogen) og /eller behandlet med 10 nM bafilomycin A1 (Sigma) i 24 timer i autofagi analyser.
Analyse av mitokondrie morfologi og Tilkobling
Mitokondriell morfologi ble analysert som tidligere beskrevet [16] med levende celle bildebehandling med en invertert confocal mikroskop (hu roterende disk, DMI 6000B, Leica) og MetaMorph programvare. Mitokondrie lengde analyse ble utført på bilder ved hjelp ImageJ etter behandlingen for å finne kanter. Den gjennomsnittlige mitokondrie lengde ble fastsatt etter bruk av frihåndslinjevalg verktøy for å måle lengde (mikrometer) av individuelle mitokondrier oppnådd i en tilfeldig valgt felt på 100 x 100 piksler og 10-15 celler per cellelinje ble undersøkt. Tilhørende metadata ble vist og bildeskalaen (Avstand i piksler: 1, kjent Avstand: Verdi fra Metadata; Pixel Aspect Ratio: 1; Enhet Lengde: mikrometer; Global: merket) ble satt for bildeanalyse konsistens. Forbigående transfeksjon celle og Drp1 RNAi knockdown eksperimenter ble utført som beskrevet [16]. Mitokondrie bildebehandling med 0,5 mikrogram transfektert mito-YFP eller mito-DsRed, mitokondrielle lengde estimater og mitokondrielle FRAP analyser har blitt beskrevet [16], [20].
Cellular Imaging og fluorimetri
mitokondrie masse ble beregnet ved bruk av en fluorescerende plateavleseren etter farging celler med 200 nM Mitotracker Grønn i 30 minutter ved 37 ° C, og vasking én gang med PRF-OptiMem [21]. Fluorescens intensitetsmålinger som er rapportert er bakgrunn subtrahert (495/515 nm).
Mitokondriell membranpotensialet ble bestemt i en 96-brønns plate ved anvendelse av en fluorescerende plateleser (Tecan). Celler (10
4 per brønn) ble lastet med 10 nM TMRE i 30 minutter ved 37 ° C i normal vekstmedier. Den TMRE lasting Mediet ble fjernet og kulturene ble plassert i fenol rød fri, serumfritt medium og inkubert i ytterligere 15 minutter for å tillate den TMRE fluorescerende signal for å nå stabil tilstand. Fluorescensintensitet ble deretter tatt 1 /min i 5 minutter for å etablere en grunnlinje. Etter 5 minutter ble 6 mikrometer oligomycin (Cell Signaling) tilsettes for å indusere hyperpolarisering av Δψ
m. I nærvær av oligomycin, ble 10 uM CCCP tilsatt i 18 minutter til cellene for å bevirke depolarisering av den ΔΨ
m. TMRE uttrykk er plottet som en relativ forholdet AF /F
0 viser bety og SEM, hvor F betyr fluorescens-intensiteten og F
0 angir basislinjeverdier før stimulering. Alle cellelinjer analysert vises oligomycin-indusert hyperpolarisering av mitokondriell membranpotensiale. Fluorescensstyrkene er bakgrunnen trekkes (554/576 nm).
Mitophagy ble målt ved hjelp av konfokalmikroskopi å oppdage colocalization av mito-YFP transfekterte positive celler med farging mot mus monoklonalt anti-LC3B (Novus Biologicals) med AlexaFluor® 594 sekundær anti-mus-IgG-antistoff (Invitrogen). Celler (5 × 10
4 per brønn) ble transfektert i oppløsning med 0,5 mikrogram mito-YFP hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) og sådd på LabTekII borsilikatglass kamre (Nunc) i 24 timer. Etter fiksering med 4% paraformaldehyd ble cellene immunfarget med kanin polyklonalt anti-LC3B antistoff (Novus Biologicals) og visualisert med AlexaFluor® 594 geit-anti-kanin-IgG (590/617 nm). Antallet forskjellige mitokondrier lokaliserte LC3 positiv punctae per celle ble tellet. Autophagosome formasjonen ble bemerket av LC3 punctae.
Alle fluorescens målinger har relative fluorescens enheter (RFU).
ELISA, fosfoproteinet Rensing og Western blotting
Generelle metoder for western blotting og subcellulære fraksjonering er blitt beskrevet [20]. Antistoffer brukt: Sigma (β-actin, GAPDH), cellesignalisering (caspase-3, hsp60 HTRA2, PARP), BD Translabs (Drp1, p53, TIM23), Calbiochem (VDAC), Novus (LC3-II), Abcam ( vimentin, fibronektin) og MitoSciences (Mitobiogenesis analysen, kompleks IV subenhet jeg, frataxin). Antistoff mot Drp1 pS637 var en generøs gave fra Dr. Craig Blackstone (ninds, Bethesda, MD). Fosfoproteinet rensing ble utført som tidligere beskrevet [16]
statistikker
Tester for analyse er angitt i figuren legenden og betydning betegnes som følger:. Ns, ikke signifikant
P
0,05; *
P
0,05; **
P
0,01; ***
P
. 0,001
Resultater
Mitokondrie Forlengelse i A549-celler
Mitokondriell dysfunksjon har blitt observert i mange typer kreft cellelinjer [22]. En viktig determinant av mitokondriefunksjon er mitokondrie morfologi. Mitokondrie morfologi ble undersøkt i hver av våre normale og lungekreft cellelinjer (tabell I) ved hjelp av en mito-YFP til fluorescerende merke mitokondrie matrise av celler (figur 1A). Mitokondriell lengde ble også bestemt for hver cellelinje (figur 1B). Det ble ikke observert distinkte forskjeller i morfologi, herunder lengden av mitokondrier, mellom lunge epiteliale cellelinjer som varierer i karsinogent potensial (tabell I) og relativ karsinogent potensial av hver cellelinje ble validert etter å ha utført cellemigreringsforsøk (figur S1) [23] . Den ikke- og svakt tumorigent NL20 og NL20TA cellene hadde en heterogen fenotype men tumorigene Calu1 og A549 celler vises hovedsakelig langstrakte form av mitokondrier. En trend ble observert, hvorved de ikke-tumorigene celler (NL20) hadde den korteste midlere mitokondrielle lengde (gjennomsnitt ± SEM; 5,2 ± 0,4 um) og den lengste midlere mitokondrielle lengde ble observert i A549-celler (gjennomsnitt ± SEM; 8,0 ± 0,8 um) (Figur 1).
(A) representant mito-YFP uttrykk i celler. Nummererte boksene (1-4) er forstørrelsene (10 ×) av de tilsvarende nummererte eske regionene i de originale bildene av NL20, NL20TA, Calu1 og A549. Scale bar er 2 mikrometer. (B) Mean mitokondrie lengde (y-aksen, ± SEM) målinger (n = 35-50) fra tre uavhengige eksperimenter for NL20, NL20TA, Calu1, og A549 celler. En-veis ANOVA analyse med Tukey post-tester (
P
0,0001).
Økt Mitokondrie messe i A549-celler
Mitokondrie massen ble estimert i levende celler ved hjelp av Mitotracker grønne FM, som akkumuleres i mitokondriene uavhengig av mitokondriemembranpotensialet [24]. Etter normalisering av cellevolum, ble det observert at A549-celler hadde økt mitokondriell masse i forhold til de andre lunge epiteliale cellelinjer (figur 2A). For ytterligere å bekrefte dette forholdet, ekspresjon av en mitokondriell kodet protein, mitokondriell kompleks IV subenheten I (terminalen enzym av respiratoriske kjeden) ble sammenlignet med atom kodede mitokondrie-assosierte proteiner, TIM23 (translokase av den indre mitokondrie-membran 23) og frataxin ved to uavhengige metoder, immunoblot og ELISA (figur 2B, D, henholdsvis). A549-celler hadde økt nivå av komplekset IV-underenhet I-protein i forhold til NL20 celler (figur 2B-E). Den selektive akkumulering av mitokondrier i A549-celler ble ikke etterlignet av andre organeller ved analyse av protein uttrykket (ER, calnexin; Golgi, syntaxin 6; cytosol, GAPDH) ved western blot (data ikke vist). I tillegg ble mitokondriell BIOGENESIS markører TFAM (mitokondrie transkripsjonsfaktor A) og PGC1α (peroksisom proliferator-aktivert reseptor gamma coactivator-1 alfa) undersøkt for å undersøke ytterligere mitokondrielle masse i de cellelinjer. Undersøkelse av disse markørene på genuttrykk nivå betyr ikke at økninger i mitokondrie masse observert i A549 cellene er knyttet til økt mitokondrie biogenesis. Genuttrykk ganger endring forskjellene var ikke signifikante i begge gen evalueringene (
TFAM
,
P
0,142;
PGC1α
,
P
0,119 ) (data ikke vist). Disse dataene viser A549 cellene har økt mitokondriell masse
(A) Mitotracker grønn fluorescens relative fluorescens enheter (y-akse, RFU) representerer mitokondriell masse (gjennomsnitt og SEM).; målinger (n = 8 brønner) fra tre uavhengige eksperimenter. En-veis ANOVA analyse med Tukey post-tester (
P
0,0001). (B) Representative immunoblot som viser ekspresjon av endogene proteiner sammensatt IV-underenhet I, TIM23, frataxin, og VDAC i NL20 (spor 1), NL20TA (spor 2), Calu1 (spor 3), og A549 (spor 4) celler. β-aktin er vist for lasting. Markører i kD (KDA). (C) immunoblot fra to uavhengige eksperimenter ble kvantifisert for å vise relativ kompleks IV-underenhet I proteinekspresjon normalisert til TIM23. Mean og SEM vist. En-veis ANOVA analyse med Tukey post-tester i forhold til NL20. (D) Representant mitokondrielle biogenesis peilepinnen ELISA-analysen viser frataxin og kompleks IV uttrykk. (E) Tre uavhengige mitokondrie BIOGENESIS ELISA-analyser ble kvantifisert vise relative mitokondrie-kodet kompleks IV protein uttrykk normalisert til den atom kodet frataxin protein. Mean og SEM vist. En-veis ANOVA analyse med Tukey post-tester i forhold til NL20.
Motstand mot CCCP-indusert mitokondrie depolarisering i A549-celler
Mitokondrie frakopling av CCCP (karbonyl cyanid m-klor fenyl hydrazone) forstyrrer mitokondriemembranen potensial (Δψ
m) og mitokondrielle pH gradient (ΔpH
m) [20]. TMRE uttrykk er plottet som en relativ forhold, AF /F
0, hvor F betyr fluorescens-intensiteten og F
0 angir basislinjeverdier før stimulering. Alle cellelinjer analysert vises oligomycin-indusert hyperpolarisering av mitokondriell membranpotensiale. I nærvær av oligomycin, ble 10 uM CCCP deretter tilsatt til cellene for å bevirke depolarisering av den Δψ
m.
Våre data antyder at A549 cellelinjer ikke depolarisere til nivået av de andre cellelinjer følgende CCCP behandling. Signifikante forskjeller (P 0,001; 2-veis ANOVA) i AF /F
0 er observert fra 23-30 minutter (mer enn 4 minutter etter tilsetning CCCP) mellom A549 og de andre cellelinjer. Dette tyder på at meget tumorigene A549-celler viser en motstandsevne mot mitokondriemembranen depolarisering (figur 3).
TMRE flekker fra to uavhengige eksperimenter (n = 8). TMRE uttrykk er plottet som en relativ forholdet AF /F
0 viser bety og SEM, hvor F betyr fluorescens-intensiteten og F
0 angir utgangsverdier før stimulering følgende bakgrunn subtraksjon. Cellelinjer NL20 (blå), NL20 (oransje), Calu1 (Nature1) og A549 (grønn) ble behandlet med oligomycin (6 mikrometer, 0 minutter) og CCCP (10 mikrometer, 18 minutter) for å indusere hyperpolarisering og depolarisering, henholdsvis. 2-veis ANOVA-analyse med Bonferroni post-tester.
som tumorcellelinjer tidligere er blitt vist å være påvirket av multiresistens (MDR) transportører, cellene ble forbehandlet med 50 uM verapamil for å blokkere MDR aktivitet under TMRE lasting for å avgjøre om MDR proteiner i plasmamembranen hadde en effekt på TMRE tilstrømningen. Etter oligomycin /CCCP behandling av verapamil behandlede celler, gjorde MDR ikke påvirker den intracellulære akkumuleringen av TMRE når sammenlignet med ikke-verapamil behandlede celler (data ikke vist); da dette fluorescerende rhodamine underlaget ikke akkumuleres i resistente celler. I denne studien ble A549-cellene hadde mindre endring i Δψ
m målt ved TMRE fluorescens følgende CCCP behandling og MDR-aktivitet ikke påvirker denne aktiviteten. Disse dataene er i samsvar med andre rapporter som tyder kreftceller demonstrere motstand mot mitokondrie membran depolarisering [25].
Redusert Drp1 avhengig Fisjon i A549-celler
mitokondrie depolarisering og fisjon er en forutsetning for å oppnå egen apoptose [5]. Med økt mitokondrie lengde, hypotese vi at A549 cellene ville ha redusert mitokondrie fisjon, noe som ville redusere både apoptotisk initiering og nedstrøms katabolsk prosess av autofagi.
Drp1 og dets mitokondrie fusion antagonister Opa1 (optisk atrofi 1), Bax /Bak og Mfn1 /2 (Mitofusin 1/2), delvis regulere form, struktur og funksjon av mitokondria ved mitokondrielle dynamikk [8]. Undersøkelse av mitokondriell morfologi (Figur 1A, 4A, basal) viser hovedsakelig langstrakt mitokondriene i A549 celler (Figur 4A2: mitokondrie lengde, gjennomsnitt ± SEM, 8,3 ± 0,8 mikrometer). Dette fenotype tyder defekter i fisjon eller en oppregulering av fusjon. Steady state Drp1 proteinnivåer ble analysert ved immunoblot (figur 4B, C). Kvantitativ analyse viser at basal Drp1 protein uttrykk i A549 celler var høyst 44% som ble observert i NL20 celler (figur 4D).
(A) Mitokondrie morfologi NL20 (til venstre) og A549 (høyre) celler følgende mito -DsRED transfeksjon. Representative bilder som vises: basal (øverst) og følgende Drp1 RNAi (midten) eller Drp1-YFP transfeksjon (lavere). Skalaen linjen viser 2 mikrometer. Nummererte boksene (1-6) er forstørrelsene (10 ×) av de tilsvarende nummererte eske regionene i de originale bildene. (B) Immun av endogen Drp1 uttrykk før (baner 1,3) og etter (baner 2,4) Drp1 RNAi transfeksjonsteknologier i NL20 og A549 celler. (C) Immunoblotanalyse av endogen (sporene 1,2; pil) og ektopisk (sporene 3,4; pilspiss) Drp1 uttrykk før og etter Drp1-YFP transfeksjon i NL20 og A549 celler. (B, C) β-actin reprobe vise lasting; markører i kDa. (D) Relativ Drp1 protein uttrykk normalisert p-aktin før og etter Drp1 RNAi transfeksjon i NL20 (hvit strek) og A549 (sort strek) celler (to uavhengige eksperimenter). 2-veis ANOVA analyse med Bonferroni post-tester. (E) Representative bilder fra FRAP analyse av NL20 (til venstre) og A549 (høyre) celler transfektert med mito-YFP. Celler fotografert i henhold basal (øverst), Drp1 K38A-myc nedregulering av Drp1 (midten) og Drp1-myc overekspresjon (nederst) forhold. Nummererte boksene (1-6) er forstørrelsene (10 ×) av de tilsvarende nummererte eske regionene i de originale bildene. Scale bar er en mikrometer. (F-H) Mobile brøkdel av mito-YFP verdier forekommer innenfor en enkelt subcellulære region av interesse (n = 60 celler). Mean og SEM vist fra to uavhengige forsøk. En-veis ANOVA analyse med Tukey post-tester. Andre FRAP statistikk er vist i figur S2.
For ytterligere å manipulere mitokondrie morfologi, Drp1 ble slått ned ved hjelp av RNAi [16], [19] (figur 4A, B + Drp1 RNAi), som er forventet for å forlenge mitokondrier. Etter Drp1 RNAi mediert slå ned på NL20 og A549 celler, var det en robust nedgang i Drp1 protein nivåer (figur 4B, D). Mitokondrie lengde øket, som forventet, i NL20 celler etter Drp1 RNAi behandling (Figur 4A: middelverdi ± SEM; basal (A1), 4,9 ± 0,5 pm; Drp1 RNAi (A3), 7,8 ± 0,6 um, en-veis ANOVA, Tukey post -test,
P
0,001). Den mitokondrielle fenotype etter Drp1 RNAi behandling i A549 celler var hoven og oppsvulmede (figur 4A4); en morfologi som skyldes hyperfusion av mitokondriene på grunn av en manglende balanse som normalt leveres av fisjons [26]. For å bestemme om redusert Drp1 proteinekspresjon bidrar til den langstrakte mitokondrielle fenotypen som normalt observeres i A549-celler, ble cellelinjer transfektert med Drp1-YFP plasmid for å overuttrykke Drp1-YFP fusjonsprotein, som er funksjonelt i stand til å indusere fisjons [16]. Som vist i figur 4A (+ Drp1-YFP), Drp1 overekspresjon reddet mitokondrie fenotype i A549 celler, redusere mitokondrielle lengder til de som ble observert i basal NL20 celler (figur 4A: gjennomsnitt ± SEM; + Drp1-YFP (A6), 5,1 ± 0,7 mikrometer, en-veis ANOVA, Tukey post-test,
P
0,05). Den mitokondrielle morfologi av A549 celler Følgende Drp1 overekspresjon tilsvar lignet som basal NL20 celler (figur 4A1). Mitokondrie lengde i NL20 celler (figur 4A: gjennomsnitt ± SEM, basal (A1), 4,9 ± 0,5 mikrometer) også redusert etter Drp1 overekspresjon (Figur 4A: gjennomsnitt ± SEM; + Drp1-YFP (A5), 2,1 ± 0,3 mikrometer; en veis ANOVA, Tukey post-test,
P
. 0,001)
Disse dataene antyder at en mangel på Drp1 protein nivåer bidrar til redusert mitokondriefisjons hendelser i A549 celler. FRAP (fluorescens gjenoppretting etter fotobleking) ble brukt til å kvantifisere mitokondrie-tilkobling, som utleder mitokondrielle fisjons hendelser [16], i levende NL20 og A549 celler (Figur 4E-H). FRAP kurvene ble oppsummert ved å beregne den mobile brøkdel av mitokondrie-rettet gul fluoriserende protein (mito-YFP), som anslår mitokondrie-tilkobling [16]. FRAP eksperimenter bekrefter at A549 celler har redusert mitokondrie fisjon (figur 4F-H). Mobilfraksjonsverdier viser at mitokondrier i NL20 celler har betydelig lavere funksjonell kommunikasjon (mer fisjon) sammenlignet med A549-celler basalt (figur 4F). Nedregulering av Drp1 ved overekspresjon av en dominant negativ versjon av Drp1 (Drp1 K38A) likevekt mitokondrie tilkobling mellom de to cellelinjer (figur 4H). Etter Drp1 overekspresjon (+ Drp1-myc), er mitokondrie fisjon forbedret i A549 celler slik at mobile brøk verdier er mer sammenlignbare med basale NL20 celler (Figur S2). Disse FRAP resultatene etterligne mitokondrie morfologiske observasjoner som viser redusert Drp1 avhengig fisjon i A549 celler i forhold til NL20 celler og at downregulated fisjon i A549 celler kan bli reddet av overekspresjon av Drp1.
Drp1 Lokalisering i A549-celler
For ytterligere å undersøke redusert Drp1 avhengig fisjon i A549 celler, vi så på Drp1 lokalisering følgende subcellulære fraksjonering via immunoblot. Mitokondrie og cytosoliske fraksjonene ble undersøkt for endogene Drp1 protein nivåer (figur 5A, B). Drp1 protein ble ikke observert i mitokondrie fraksjonen av A549-celler tyder på at Drp1 ikke er aktivt rekruttert til mitokondriene for fisjon. I motsetning til dette, NL20 celler viste rekruttering av Drp1 til mitokondrie fraksjonen, som utleder mitokondriell spalting skjer i NL20 celler som foreslått av den mitokondriale morfologiske analysen (figur 1A, 4A) og bekreftet ved FRAP data (figur 4F-H). I pattedyrceller, er Drp1 rekruttert til det ytre mitokondriemembranen følgende apoptotisk induksjons [5]. For å undersøke denne trans ble Drp1 lokalisering visualisert ved immunoblot følgende subcellulære fraksjonen etter staurosporin (STS) behandling. STS er en proteinkinase inhibitor er kjent for å indusere apoptose [27]. Ved apoptotisk induksjon av STS, ble Drp1 protein rekruttering fra cytosoliske til mitokondrie fraksjonen observert i både NL20 og A549 celler (figur 5B). Fra denne observasjonen, inferred vi at A549 celler har redusert Drp1 mitokondrie rekruttering som kan bli styrket ved apoptotisk stimulering. Dette tyder på at Drp1 kan rekrutteres til mitokondriene i A549-celler, men prosessen med mitokondriell spalting hindres i denne cellelinje.
(A, B, E) Representative immunoblot av tre uavhengige eksperimenter av (A) ubehandlet , (B) 1 uM STS behandling i 3 timer for å indusere apoptose, og (E) 1 uM STS behandling i 3 timer etter Drp1-myc transfeksjon i NL20 og A549-celler. Endogene Drp1 og cytokrom c protein uttrykk ble evaluert i totalt (baner 1,2), mitokondrie (kolonnene 3,4) og cytosolic (banene 5,6) fraksjoner. Mitokondrie (VDAC), er cytosol (GAPDH) og β-aktin (totalt) inkludert som fraksjone og lasting kontroller. Myc ekspresjonen etter Drp1-myc transfeksjon er vist i (E). Markører i kDa. (C, D, F), Cytokrom c proteinekspresjon normalisert til p-aktin i NL20 (hvite streker) og A549 (svarte søyler) cellefraksjoner i henhold til ubehandlede forhold (C), 1 uM STS behandling i 3 timer (D) eller 1 uM STS behandling i 3 timer med ektopisk ekspresjon av Drp1-myc (F). Mean og SEM vist fra to uavhengige forsøk. 2-veis ANOVA analyse med Bonferroni post-tester. Mitokondrie morfologi under disse forholdene er vist i figur S3C og S5.
Nedsatt Cytokrom C utløsning i A549-celler
Hemme mitokondrie fisjon forsinker utgivelsen av cytokrom c inn i cytoplasma [28] ; Derfor, undersøkte vi cytokrom c translokasjon i A549-celler (Figur 5, Figur S3). Mitokondrie og cytosoliske fraksjonene ble undersøkt for cytokrom c utgivelse i NL20, NL20TA, Calu1 og A549 celler med og uten CCCP-indusert frakopling (figur S3A, B). Spesielt A549, den mest tumorigent cellelinje i dette panelet (figur S1), vises svekkelse i cytokrom c meldingen etter CCCP behandling (figur S3b, C). STS-behandlede A549 celler viste en tilsvarende mangel på cytokrom c utslipp sammenlignet med NL20 celler (figur 5B, figur S3C). Immunoblot ble kvantifisert for å vise cytokrom c proteinnivåer i fraksjoneringsforsøk uten og med STS-behandling (figur 5C, D). Under basale og STS betingelser, hadde A549-celler øket cytokrom c proteinnivåer i mitokondrie fraksjonen sammenlignet med NL20 celler. Disse dataene antyder A549 celler har redusert Drp1 avhengig mitokondrie fisjon og nedstrøms prosessen med cytokrom c utgivelsen er svekket. For ytterligere å understøtte denne ideen, overekspresjon av DRP1 i A549-celler reddet STS-behandling indusert frigjøring cytokrom c i denne cellelinjen (figur 5E, F, figur S3C) som viser at svekket cytokrom c frigivelse observert i A549-celler skyldes en mangel i Drp1 . Forventet mitokondrie morfologiske fenotyper ble observert etter STS-behandling og i kombinasjon med Drp1-myc overekspresjon (figur S5), som støtter cytokrom c utslipp Immunoblotanalyse data i NL20 og A549 celler.
apoptotiske Resistance i A549-celler
Siden mitokondrie fisjons defekter forsinke cytokrom c meldingen [28] og caspaseaktivering [5], undersøkte vi nedstrøms pro-apoptotiske hendelser følgende cytokrom c utgivelse. Kløyving av caspase-3, en viktig formidler av pattedyr apoptose [29], ble observert etter STS- og doxorubicin-behandling (Figur 6A, Figur S4A, C) i NL20, NL20TA, og Calu1 celler. I motsetning til dette, caspase-3-spalting var fraværende i apoptose stimulerte A549-celler (figur 6A, figur S4A). PARP-spaltning, en nedstrøms komponent av apoptose som er forårsaket delvis av aktiveringen av caspase-3 [30], ble også undersøkt følgende apoptotisk induksjon (figur 6B, fig S4B, D). PARP-spaltning ble observert i NL20 celler etter apoptotiske stimuli, men var fraværende i A549-celler. Inhibering av STS-indusert PARP-spaltning i NL20-celler ble observert ved samtidig behandling med zVAD-FMK (figur 6C), en kjent kaspaseinhibitor, noe som viser at dette er et caspase-mediert prosess i NL20 celler. Komplett PARP cleavage ble observert i STS-behandlede NL20 celler som overuttrykker Drp1 protein (figur 6C). STS-behandling indusert PARP cleavage ble restaurert i A549 celler som overuttrykker Drp1 (figur 6C).
