Abstract
Bakgrunn
Mutasjon av Wnt signal antagonister Apc eller Axin aktiverer β-catenin signalisering i mange kreftformer, inkludert de fleste av menneskelige kolorektal adenokarsinomer. Fenotypen til
apc
eller
Axin
mutasjon i bananflue
Drosophila melanogaster
er slående lik som forårsaket av mutasjon i segmentet-polaritet genet,
naken cuticle (NKD)
. NKD hemmer Wnt signal ved binding til Dishevelled (Dsh /Dvl) familie av stillasproteiner som lenker Wnt reseptor aktivering p-catenin akkumulering og TCF-avhengig transkripsjon, men menneskelig
NKD
gener er ennå ikke direkte innblandet i kreft
metodikk /hovedfunnene
Vi identifiserer for første gang mutasjoner i
NKD1.
– en av to menneskelige
NKD
homologer – i en undergruppe av DNA mismatch repair-mangel kolorektal tumorer som ikke er kjent for å huse mutasjoner i andre Wnt-sti gener. De mutante Nkd1 proteiner er defekt ved å hemme Wnt signal; i tillegg, de mutante Nkd1 proteiner stabil β-catenin og fremme celleproliferasjon, delvis på grunn av en redusert evne til hver mutant Nkd1 protein til å binde og destabilisere DVL proteiner.
Konklusjon /Betydning
våre data heve hypotesen om at bestemte
NKD1
mutasjoner fremme Wnt-avhengige tumorigenesis i en undergruppe av DNA mismatch-reparasjon-mangel colorectal adenokarsinomer og muligens andre Wnt-signal drevet kreft hos mennesker
Citation.: Guo J, Cagatay T, Zhou G, Chan CC, Blythe S, Suyama K, et al. (2009) Mutasjoner i Human
naken hårstråene
homolog
NKD1
Funnet i tykktarmskreft Alter Wnt /Dvl /β-catenin signale. PLoS ONE 4 (11): e7982. doi: 10,1371 /journal.pone.0007982
Redaktør: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, Storbritannia
mottatt: 05.08.2009; Godkjent: 19 oktober 2009; Publisert: 24.11.2009
Copyright: © 2009 Guo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en American Cancer Society Institutional stipend (til KW); National Institutes of Health (R01-GM65404 å K.W .; R01-CA60117 til S.N.T.); og Mayo Clinic /Foundation (til W.L.). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Aktivering av «kanoniske» Wnt /β-catenin signalering i nesten alle menneskelige kolorektal adenokarsinomer (CRC) gjør Wnt veien en lovende ennå uutnyttet terapeutisk mål [1]. Den rådende paradigmet for kanonisk Wnt signal ble trukket delvis gjennom elegante utviklingsstudier av frukten fly
Drosophila melanogaster Hotell og amfibier
Xenopus laevis
: Fraværende Wnt signal, en «ødeleggelse kompleks» komponert av proteinene APC, Axin, GSK3P, og CK1 fosforylerer β-catenin, noe som fører til p-catenin ubiquitinering og proteasomal degradering [2]. Binding av Wnt ligander til frizzled /LRP ko-reseptorene aktiverer scaffoldprotein Dishevelled (Dsh; Dvl1, Dvl2, Dvl3 hos pattedyr), som fører til lagring og nedbrytning av Axin, noe som gir β-catenin å akkumulere, inn i kjernen, og bind TCF transkripsjon faktorer for å regulere målgener [2].
Et flertall (60-85%) av menneskelig CRC utstillings aktivert kanoniske Wnt signal grunn avkorting mutasjoner i
APC Hotell som stabiliserer β-catenin [3 ]. Alternativt kan mutasjoner i β-catenin
(CTNNB1) Hotell som blokk fosforylering og nedbrytning funnet i noen CRC som mangler
APC
mutasjon [4]. CRC-skjerm i det minste to typer av genomiske ustabilitet: kromosomal ustabilitet (CIN) forbundet med mutant APC og p53, og gir opphav til Aneuploidy, og mikro-ustabilitet (MSI) forårsaket av defekt DNA-mismatch reparasjon (MMR) og som resulterer i mutasjoner i enkel sekvens gjentagelser (SSR) i hele genomet [5], [6]. Mutasjon av SSR i kodingen eller spleise regioner av viktige regulatoriske gener kan opprette punkt mutant eller avkortede proteiner som fremmer kreft progresjon; ja, MMR-mangel og MSI er karakteristisk for svulster hos pasienter med arvelig nonpolyposis tykktarmskreft syndrom {HNPCC; a.k.a. Lynch syndrom (OMIM 120435)} og av 13-17% av sporadisk CRC [7].
APC
mutasjoner er utbredt i CIN-CRC [3], men Wnt veien genmutasjon spektrum i MSI-CRC er mindre preget, med mutasjoner i Axin homolog
AXIN2 Hotell og TCF -familie transkripsjonsfaktor
TCF7L2
identifisert i -25% og ~35% av MSI-CRC, henholdsvis [8], [9].
APC
mutasjonen er sjeldnere i MSI-CRC enn i CIN-CRC [10], [11], mens aktive mutasjoner i
CTNNB1
, men utbredt over hele spekteret av menneskelig kreft, er sjelden i MSI-CRC [11]. Disse dataene tyder på at flere mekanismer aktivere Wnt /β-catenin signalisering i MSI-CRC
The Naked skjellaget (NKD) protein familie demper kanoniske Wnt signal ved å binde og muligens destabiliserende DSH /DVL proteiner [12] -. [ ,,,0],17].
Drosophila NKD
mutanter utvikle dødelige segmenteringsfeil svært lik dem man ser i
apc
eller
Axin
mutanter [12], [18], [19] (Fig. 1A ). Vi antok derfor at endring av
NKD
genaktivitet i pattedyr kan aktivere Wnt signal og forårsake kreft. Her identifiserer vi nye mutasjoner i menneske
NKD1
genet i MSI-CRC som endrer Wnt signal og redusere NKD /DSH interaksjoner. Våre data tyder på at bestemte
NKD1
mutasjoner endre Wnt /β-catenin signalisering i et mindretall av MSI-CRC samt muligens i andre β-catenin signalavhengige tumorer hvor mutasjoner i de kjente Wnt regulatorer er sjeldne .
(A) Wild-type,
Axin, APC
, og
NKD Drosophila
neglebåndene. Villtype har veks denticle band (pil) og naken skjellaget (pilspiss), med hver mutant mangler denticle band. (B)
NKD1
locus har 10 eksoner. Nkd1 skjematisk (oransje) inkluderer N-terminal myristoylation, EFX, 30aa (blå), og karboksyterminal Hans-rike motiver. Exon 10 sekvenser rundt poly- (C) traktater (rød) over native (svart) og mutante (blå) rester vises. (C)
NKD1
electropherograms viser villtype (WT) poly- (C)
7, cellelinje TC7 med C-sletting (C6), cellelinje RKO med C-innsetting (C8), og cellelinje HCT15 med G En mutasjon (pil) 3 «av poly- (C)
7. (D, E) α-Nkd1 blots av fullcelle-ekstrakter (D) og Triton X-100 oppløselige og uoppløselige fraksjoner (E) fra cellelinjer med indikerte
NKD1
mutasjon. Piler utpeke Nkd1 proteiner. β-aktin laster kontroll i D. CCD841 har full lengde Nkd1, med en mindre nedbrytningsprodukt på ~35 kDa også sett med transfektert
NKD1 plakater (f.eks Fig. 1E, 5C), mens SW480 med mer rikelig men villtype Nkd1 har flere nedbrytningsprodukter.
Resultater
NKD1
mutasjoner i kolorektal adenokarsinom
Vi identifiserte tre forskjellige
NKD1
ekson 10 kodende region mutasjoner i 5/11 CRC cellelinjer og 2/40 sporadiske CRC svulster med MSI (tabell 1), men ingen
NKD1
kodende region eller spleise mutasjoner i 5/5 CRC celle linjer og 50/50 svulster uten MSI. To mutasjoner, enten et deoksycytidin (C) delesjon eller innskudd på grunn av polymerase glidning innenfor et exon-10 poly (C)
7 røret, resulterer i syntese av avkortede proteiner med 345 eller 298 aminosyrer (aa) (Fig . 1B, C). A (C)
7-tilstøtende missense mutasjon (G A) konverterer Arg-288, bevart i Nkd2, Hans (fig 1B, C.).
NKD1
mutasjoner ble ikke oppdaget i 32/40 MSI-CRC svulster som havn mutasjoner i andre Wnt-pathway gener inkludert
APC
,
CTNNB1
,
AXIN2
og
TCF7L2
, men ble funnet i to av de resterende 8/40 svulster uten lesjoner i disse kjente Wnt-pathway gener (p = 0,036, ensidige Fishers eksakte test) (tabell 1, se Materialer og metoder). Disse dataene indikerer en gjensidig eksklusivitet mellom mutasjoner i
NKD1 Hotell og andre Wnt-pathway gener i vår kohort av MSI-CRC tumorprøver, noe som tyder på at
NKD1
mutasjoner er av patologisk betydning.
Både colonic epithelial cellelinje CCD841 og CRC-cellelinjen SW480, den sistnevnte med et C T mutasjon i
APC
kodon # 1338 [20], koder for en villtype Nkd1 (470 aa) på 53,2 kDa som vandrer på -50 kDa på western blot (fig. 1D, E). Cellelinjer Co115 og TC7, hver med (C)
6 mutasjon, har en ~39 kDa båndet som korresponderer med 38,1 kDa Nkd1
C6, mens cellelinje RKO, og (C)
8 mutasjon, har en ~33 kDa båndet som korresponderer med 33,4 kDa Nkd1
C8; Alle tre cellelinjer med avkortet Nkd1 har også mindre rikelig full-lengde Nkd1, noe som tyder på at villtype-
NKD1
locus gjennomgår ingen tap-av-heterozygositet (Fig. 1D). Ved western blot med Nkd1 antistoffer kan vi ikke skille villtype fra mutant Nkd1 i cellelinje HCT15, som havner
NKD1
R288H plakater (Fig. 1 D).
NKD proteiner er membran-assosiert, pattedyr Nkds i kraft av N-terminal myristoylation [14], [21], [22]. De avkortede Nkd1 proteiner har en redusert affinitet for membraner sammenlignet med full-lengde Nkd1 som utledes av Triton X-100 Oppløselighet: 95% av NKD
C6 eller NKD
C8 fra mutante cellelinjer som er TX-100 oppløselig, mens 0-26% av full-lengde Nkd1 fra alle cellelinjer er TX-100 oppløselig (fig. 1E).
Mutant Nkd1 proteiner er defekt ved å hemme Wnt /Dvl signaliserer
mus Nkd1 kan hemme aksen duplisering indusert av ektopisk Wnt signal i
Xenopus
embryoer [16]. Som vist på fig. 2A, 90% av
Xenopus
embryoer injisert med
XWnt8
mRNA utviklet delvis til fullstendig aksen duplisering; i samsvar med Nkd1 aktivitet som en Wnt antagonist, vill-type human
NKD1
mRNA ko-injeksjon reduserte aksen duplisering frekvens til 42%, med bare 3% fullført duplikasjoner. I kontrast, co-injeksjon av hver mutant human
NKD1
resulterte i akse duplisering frekvenser tilsvarende den som ble observert med
XWnt8
injeksjon alene (Fig 2A.). Som i cellelinjer, feilekspriraert Nkd1
C6 og Nkd1
C8 ble mer rikelig enn villtype Nkd1 eller Nkd1
R288H ved western blot (ikke vist). Etter avtale med
Xenopus
resultater, vill-type Nkd1, men ingen av de tre mutanter, undertrykt Dvl-indusert aktivering av TCF-reporter TOPflash i HEK-293 celler (Fig. 2B). Uttrykk av mutant Nkd1 alene litt økt basal TOPflash aktivitet og hadde ingen effekt på endogen
Xenopus
aksen dannelse (ikke vist), noe som indikerer at effekten av Nkd1, som det av
NKD
i fly , avhengig av Wnt signal [23].
(A)%
Xenopus
embryoer med angitte aksen fenotype etter injeksjon av
XWnt8
+/- villtype eller mutant
NKD1
. (N) = # embryoer injisert. Paneler på høyre viser representative lateral (L) og rygg (D) visninger av embryoer scoret så enkelt akse (hvit), kort A /P aksen (lys grå), delvis aksen duplisering (mørk grå), og full aksen duplisering (svart) i henhold til de materialer og metoder. I embryoer med enkelt akse i venstre paneler, merk trunk (hvit pil) og sement kjertel (svart pil). Pilspisser utpeke hver akse i embryoer med akse duplikasjoner (høyre panel). Embryoer med delvis aksen duplisering har duplisert stammen vev, men en enkelt sement kjertel, mens embryoer med fullt aksen duplisering har duplisert trunk vev og sement kjertler. (B) Normalisert TOPflash luciferase aktivitet (RLU) i HEK-293 celler transfektert med reporteren +/- Dvl2 +/- indikert Nkd1 konstruere.
NKD1
mutasjoner stabil β-catenin og fremme celleproliferasjon
i samsvar med
NKD1
mutasjoner aktive Wnt signal i CRC, cytoplasmatiske og kjernefysiske nivåer av β-catenin er høyere i Co115 celler enn i CCD841 celler (fig. 3A). Følgelig atom β-catenin var fremtredende i Co115 celler, men ikke i CCD841-celler (fig. 3B, C). HEK-293T-celler transfektert med Nkd1
C6, Nkd1
C8, eller Nkd1
R288H hadde høyere nivåer av cytosoliske β-catenin enn celler transfektert med vill-type Nkd1 eller en kontroll (Fig. 3D), noe som indikerer at hver mutant Nkd1 protein kan stabilisere β-catenin.
(A) Western blot av cytosoliske og kjernefysiske ekstrakter av celler med vill-type (CCD841) eller mutant (Co115)
NKD1
. GAPDH og HDAC2 ble undersøkt som lasting kontroller. (B-B «, C-C») β-catenin (rød) og DNA (blå) fordeling i CCD841-celler (B-B «) og Co115 (C-C») celler. Piler utpeke kjerner. Sammenslåtte bilder i B «og C». (D) Western blot av cytosoliske ekstrakter av HEK-293-celler transfektert med
lacZ
kontroll (-), villtype Nkd1 (WT), eller indikert mutant Nkd1 konstruere, og probet for β-catenin, Nkd1, og lasting kontroll GAPDH. Merk at hver mutant Nkd1 men ikke vill type Nkd1 øker β-catenin nivåer. (E) Relativt celleantall som funksjon av dager etter retroviral infeksjon av CCD841 celler med tom vektorkontroll, villtype Nkd1, eller indikert Nkd1 mutant (p = 0,016, 0,012 og 0,0091 til C6, C8, og R288H mutanter sammenlignet kontroll) (F) Relativt celleantall som funksjon av dager etter retroviral infeksjon av Co115 celler med kontroll eller vill-type Nkd1 (p = 0,022). α-Nkd1 vestlige blotter av celleekstrakter, med GAPDH eller β-aktin lasting kontroll, er vist nedenfor hver tomt i E og F.
Siden kanoniske Wnt signal fremmer celledeling [2], vi analysert akkumulering av celler som uttrykker jevnt sammenlignbare nivåer av enten villtype eller mutant Nkd1. Retroviral ekspresjon av hver mutant Nkd1 protein i CCD841 celler øket celleantall sammenlignet med villtype Nkd1 eller tom vektorkontroll (fig. 3E). Omvendt, ekspresjon av vill-type Nkd1 i Co115 celler reduserte celleantallet (fig. 3F). Disse dataene indikerer at
NKD1
mutasjoner kan fremme β-catenin stabilisering og colonic celleproliferasjon.
Altered subcellulære lokalisering og Dvl colocalization av avkortet Nkd1
Vi klarte ikke å påvise endogen Nkd1 i cellelinjer ved immunocytochemistry, så å videre undersøke forholdet mellom Nkd1 lokalisering og aktivitet vi undersøkt lokalisering av merket proteiner i HEK-293 celler. Nkd1 lokaliserer i en punktformet, overveiende cytoplasmatiske fordeling lik
Drosophila
NKD
GFP når det uttrykkes i fly spyttkjertel (Fig. 4A, F). I motsetning til dette, Nkd1
C6 og Nkd1
C8 fordele diffust i cytoplasma (fig. 4B og ikke vist), i samsvar med deres forbedrede oppløselighet vaskemiddel i forhold til Nkd1 (fig. 1E), mens Nkd1
R288H aggregater som villtype Nkd1 (ikke vist).
(A, B) HEK-293 celler som uttrykker HA /Flag-merket Nkd1 (A) eller Nkd1
C8 (B) farget med α-HA (grønn ). Nkd1 akkumuleres i puncta (piler), mens Nkd1
C8 er diffust utbredt i cytoplasma. Nkd1
C6 fordelt i et mønster som ligner på Nkd1
C8 (ikke vist). (C, D) Celler ko-uttrykker Dvl3 og villtype (C) eller C8 (D) Nkd1
GFP konstruksjoner. Nkd1-GFP (grønt, C) viser nær komplett colocalization (piler) med Dvl3 (rød, C «), mens Nkd1
C8-GFP (D) akkumuleres i cytoplasmatiske aggregater omgitt av Dvl3 (piler). Sammenslåtte bildene er i C «, D», er DNA blå i A-D. Lignende resultater ble observert i celler coexpressing Nkd1
C8-GFP og Dvl1 eller Dvl2, og i celler som uttrykker Nkd1
C6-GFP og Dvl1, Dvl2, eller Dvl3 (ikke vist). (E) Spyttkjertel fra villtype tredje stadium
Drosophila
larve farget med α-Dsh (rød) viser diffus og punctate farging. (F-F «)
A8-Gal4 /UAS-NKD
GFP
spyttkjertel farget med α-Dsh og avbildes for GFP (F) og Dsh (F «; fusjonerte i F»). Fly NKD
GFP relocalizes Dsh å perinukleær aggregater (piler) lik de som ble observert med Nkd1
GFP /Dvl3 i C.
DVL proteiner lokalisere dynamisk, cytoplasma og plasma membran-assosiert aggregater som er blitt foreslått å forsterke Wnt /β-catenin signalering [24]. I samsvar med
in vitro
NKD /Dsh forening, uttrykk for Nkd1
GFP i HEK-293 celler eller fly NKD
GFP i spyttkjertel ga opphav til intracellulære aggregater med colocalized NKD og Dsh /Dvl ( fig. 4C-C «, F-F», og som ikke er vist). I kontrast, hver Dvl co-syntetisert med hverandre avkortet Nkd1
GFP (C6 eller C8) dannet aggregater, men colocalization ble i stedet observert ved aggregerte grensesnitt, med DVL aggregater vanligvis rundt avkortede Nkd1 aggregater (fig. 4D-D «og ikke vist). Selv om betydningen av disse lokaliseringer vis-à-vis Wnt signal er uklart, den avkortede Nkd1 proteiner identifisert i CRC viste en redusert evne til å colocalize med DVL proteiner i forhold til full-lengde Nkd1.
Mutant Nkd1 proteiner er defekt på bindende DVL proteiner
Neste vi undersøkte den biokjemiske mekanismen av defekt Wnt signal hemming av mutante Nkd1 proteiner. Den NKD EFX motiv binder grunn /PDZ regionen DSH /DVL proteiner [14]. Overraskende, hver Nkd1 mutant, til tross for at en intakt EFX motiv, bundet hvert Dvl protein mindre enn villtype-Nkd1 av gjær-to-hybrid (Y2H) analyse (Fig. 5A). Nkd1 trunkering på (C)
7-tarmkanalen (Nkd1
1-286) også redusert Dvl binding (Fig. 5A), noe som indikerer at redusert Dvl binding var ikke på grunn av rammeskifte-indusert unike C-termini i to avkortede mutanter. Hver avkortet Nkd1 protein beholder nær sin C-terminale en 30aa amfipatiske α-heliks motiv som er svært konservert (28/30 aa) i Nkd2 [14]. I fly NKD, er en tilsvarende plassert 30aa motiv kritisk for funksjonen og nukleære lokaliserings [25], men rollen til 30aa motiv i virveldyr NKD proteiner forblir ukjent. Sletting av 30aa motiv i Nkd1
1-286 restaurert Dvl bindende, mens ytterligere sletting av EFX motiv eliminert Dvl binding (fig. 5A). Disse data antyder at en funksjon av virveldyr NKD 30aa-motivet er å motsette Nkd1-EFX /dvl interaksjoner, som selv er tilsynelatende motstand fra ytterligere C-terminale sekvens som er slettet i våre MSI-CRC-tumorer.
( A) Y2H mellom Nkd1-agn og Dvl-byttedyr analysert for vekst på trippel dropout (3D + 3AT) eller doble dropout (2D) media. Søylediagram på høyre viser ONPG enheter fra kvantitativ Y2H analysen. Western blot viser at Nkd1 mutante proteiner er av sammenlignbar mengde (ikke vist). (B) GST-pulldown analysen av
in vitro
oversatt,
35 [S] -merket Dvl1-3 med hver GST-Nkd1 protein. Søylediagram er kvantitativ bandet intensitet. Coomassie-beiset gel viser hver GST-fusjonsprotein, med pilspisser indikerer full-lengde proteiner. (C) Western blot av Flag-IP-adresser fra HEK-293 celleekstrakter med like mengder av hver HA /Flag-merket Nkd1, og deretter probet med α-HA (øverst) og α-Dvl3 (i midten). β-aktin laster kontroll (lavere). Legg merke til at mindre Dvl3 er IP’d av Nkd1
C6 eller Nkd1
C8 i forhold til full-lengde Nkd1. Ingen co-IP ble observert mellom villtype eller mutant Nkd1s og Dvl1 eller Dvl2, som minner om mangel på stabil co-IP mellom
Drosophila
NKD og Dsh [13].
Vi bekreftet Y2H resultatene etter GST-pulldown og coimmunoprecipitation eksperimenter. Som vist på fig. 5B, hver Dvl protein utstilt redusert binding til GST-Nkd1
C6 og GST-Nkd1
C8, sammenlignet med villtype GST-Nkd1, mens GST-Nkd1
R288H viste redusert assosiasjoner med Dvl1 og Dvl2, men i mindre grad med Dvl3, lik den som er sett ved Y2H. Når uttrykt i HEK-293 celler, Nkd1
C6 og Nkd1
C8 akkumulert til høyere nivåer enn Nkd1 og Nkd1
R288H (ikke vist); ved å normalisere inngangslysatene, slik at like mengder av villtype-Nkd1 og hver mutant Nkd1-protein ble immunopresipitert, observerte vi en to-gangers reduksjon i mengden av Dvl3 ko-immunopresipitert ved Nkd1
C6 eller Nkd1
C8 sammenlignet til Nkd1 eller Nkd1
R288H (fig. 5C). Dermed blir
NKD1
mutasjoner redusere Nkd1 /DVL foreninger
in vitro Hotell og
in vivo
.
Mutant Nkd1s er defekte ved å endre DVL nivåer
Dvls kan ubiquitinmolekyler og degradert ved proteosomet, og bindingen av NKD eller andre Dvl-bindende proteiner fører til Dvl omsetningen [17], [26] – [28].
NKD1
mutasjoner kan derfor svekke evnen til Nkd1 å destabilisere Dvls. Ved å uttrykke
Drosophila
NKD
GFP på ulike nivåer i tilstøtende celler i tredje stadium
Drosophila
spyttkjertel, vi konsekvent observert en invers sammenheng mellom nivåene av NKD
GFP og DSH (fig. 6A-A «). Siden
dsh
transkripsjon er ikke kjent for å være regulert i
Drosophila
er NKD
GFP sannsynlig destabiliserende Dsh, som observert da Nkd1 ble overuttrykt i dyrkede pattedyrceller [17]. Neste, vi co-transfektert villtype eller hver mutant Nkd1 med Dvl1, Dvl2, eller Dvl3 i HEK-293 celler og undersøkt nivåene av hver Dvl protein ved western blot. Som vist på fig. 6B, Dvl1 og Dvl2, og i mindre grad Dvl3, var mindre rikelig når co-uttrykkes med villtype Nkd1 enn når det uttrykkes alene. Hverken tom vektor eller ko-uttrykt GFP påvirket nivået av hver Dvl (ikke vist). I motsetning til dette er mengden av Dvl1 detekterbar med ko-ekspresjon av hver mutant Nkd1 var lik den Dvl1-transfektert eneste kontroll (Fig. 6B). Dvl2 nivåer ble delvis redusert med hver mutant Nkd1, mens Dvl3 ble redusert mindre ved koekspresjon av enten avkortet Nkd1 enn av villtype Nkd1. I likhet med den inverse forholdet mellom NKD
GFP og DSH nivåer i
Drosophila
spyttkjertel (Fig. 6A-A «), fine punktat Dvl1 immunoreaktivitets i celler med høye nivåer av Nkd1
GFP dukket redusert sammenlignet med tilstøtende celler med lavere nivåer av Nkd1
GFP (fig. 6C, C «). Til sammen våre data støtter hypotesen om at den spesifikke endringen av Nkd1 evne til å fremme Dvl omsetning kan aktivere Wnt /β-catenin signal under CRC tumorprogresjon.
(A-A «)
71B-Gal4 /UAS-NKD
GFP
tredje stadium
Drosophila
spyttkjertel farget med α-Dsh og avbildes for GFP (A) og Dsh (A «) distribusjoner (sammenslåtte bildet i A «). Kvantifisering av Dsh piksel intensitet (hvit boks i A «) avslører redusert flekker i cellen uttrykker mer (høyre, grønn stjerne) NKD
GFP enn i tilstøtende cellen uttrykker mindre NKD
GFP. (B) Western blot av HEK-293 celler transfektert med angitte Flag /HA-merket Nkd1 og Dvl1, Dvl2, eller Dvl3 konstruksjoner probet med α-HA, α-Dvl1-3, og α-βtubulin som en lasting kontroll. Hver av de Dvl1-3 blottene ble lastet med like mengder av ekstrakt, som bekreftet ved sondering hver blot med α-βtubulin. (C) HEK-293 celler samtidig uttrykte Nkd1
GFP og Dvl1, farget med α-Dvl1, og avbildes for GFP (grønt), Dvl1 (rød) og DNA (blå) viser fin punktat Dvl1 fordeling i celler som uttrykker lav til fraværende Nkd1
GFP (hvit pil). I tilstøtende celler uttrykker Nkd1
GFP, er Dvl1 relocalized å Nkd1
GFP /Dvl1 aggregater (gul pil), med tap av fine punktat Dvl1 flekker (pilspisser). (D, E) Alle modeller av NKD funksjon i
Drosophila product: (D) og
NKD1
-mutant CRC (E). Doble linjer: øvre = plasmamembran; lavere = kjernemembranen. (D) Fly Wg (Wnt) binder Fz /Arrow (Lrp5 /6) reseptorer, som hemmer Apc /Axin /CK1 /GSK3p kompleks som fremmer nedbrytning av Arm (β-catenin). Arm komplekser med Pan (TCF) for å aktivere målgener inkludert
NKD
. NKD fremmer Dsh omsetning for delvis å hemme signalering, og sysselsetter atom import faktoren Imp-α3 å gå inn i kjernen og videre hemme signaliserer gjennom ukjente mekanismer [31]. (E) I
NKD1
-mutant CRC, muterte Nkd1 protein ikke lenger binder og fremmer Dvl omsetning, stabiliserende β-catenin og aktivere TCF-avhengig transkripsjon av målgener.
diskusjon
mutasjon av svulst suppressor
APC
løfter Wnt /β-catenin signalisering i de fleste av 1 million nye tilfeller av CRC diagnostisert årlig på verdensbasis [3], [29 ]. Vi antok at mutasjoner i andre Wnt antagonister kan heve signalering i undergruppe av CRC, spesielt MSI-CRC, uten mutasjoner i kjente Wnt regulatorer. Vi rapporterer tre kreft-assosiert menneskelig
NKD1
mutasjoner som endrer Wnt /β-catenin signal og forstyrre Nkd1 /Dvl bindende. Basert på frekvensen av
NKD1
mutasjon (5%) identifisert i vår kohort av MSI-CRC, anslår vi at
NKD1
mutasjoner forekommer hos opptil ~ 1% av nydiagnostiserte CRC, eller ~10,000 tilfeller per år.
Siden MSI svulster er utsatt for mutasjon i hele genomet, oppstår spørsmålet om
NKD1
mutasjoner kjøre tumorprogresjon eller er bare «bystander» mutasjoner. En National Cancer Institute workshop [30] foreslått fem kriterier for å skille bona-fide målgener fra tilskuer mutasjoner, inkludert a) høy mutasjonsfrekvensen, b) biallelic inaktivering, c) en rolle i en vekst suppressor sti, d) inaktivering av det samme vekstsuppresjon reaksjonsvei i tumorer uten MSI gjennom mutasjon i det samme gen eller i et annet gen innenfor samme vei, og e) funksjonelle suppressor studier, selv om gyldigheten av disse kriteriene i vurderingen av sjeldne eller nye driver mutasjoner har blitt stilt spørsmål {f.eks [6]}. Vårt arbeid antyder at
NKD1
mutasjoner oppfylle fire av de fem kriteriene – a, c, d og e. Mens hyppigheten av
NKD1
mutasjon var relativt lav sammenlignet med kjente Wnt pathway gener, en gjensidig eksklusivitet mellom mutasjoner i
NKD1 Hotell og andre Wnt pathway gener var statistisk signifikant i tumorprøver. Fraværet av
NKD1
mutasjoner i vårt utvalg av svulster uten MSI kan skyldes den sjeldne arten av spesifikke Nkd1 avkorting i svulster med intakt MMR, eller på grunn av vår lille utvalgsstørrelsen. Men andre gener i Wnt signalveien som
APC
ofte mutert, slettet eller metylert i svulster med intakt MMR. Biallelic inaktivering av
NKD1
ble ikke observert, men tilstedeværelsen av villtype Nkd1 i tumorcellelinjer, så vel som evnen til mutanten Nkd1 for å stabilisere β-catenin, tyder på at
NKD1
mutasjoner kan opptre dominant (se nedenfor). Endelig NKD familie av proteiner hemmer kanoniske Wnt signalering, og denne aktiviteten er defekt i alle tre muterte Nkd1 proteiner, noe som tyder på at Nkd1 mutasjoner endre Wnt /β-catenin signal
in vivo
.
Vi viser videre at NKD kan begrense Dsh /Dvl overflod i både pattedyrcellekultur og fly systemer, med fly NKD tillegg har ukjente, men viktige kjernefunksjoner [25], [31] (fig. 6D). Vi foreslår at mutant menneskelige Nkd1 proteiner, hver med en redusert evne til å binde og begrense overflod av Dvls, øke Wnt-avhengige Dvl aktivitet, og dermed dempe β-catenin nedbrytning og økende TCF-avhengig transkripsjon av målet gener som fremmer spredning (Fig . 6E). Men hindrer direkte Nkd1 /Dvl foreningen er tydeligvis ikke nok for å fremme neoplasi, som sletting av Dvl bindende
Nkd1
EFX motiv verken gjengitt mutant mus utsatt for kreft eller forsterkes hyppigheten av
Apc
mutasjon-drevet intestinal adenomer [32]. Tilsvarende mus som bærer N-terminal avkorting
Nkd1
og /eller
Nkd2
mutasjoner ikke utviklet spontane svulster [33]. Siden NKD er integrert i feedbacksløyfer i fluer og virveldyr [12], [34], vi tidligere hypotese om at i pattedyr mangel på NKD aktivitet kan kompenseres ved redundante tilbakekoblingsmekanismer, mens fluer ingen slik kompensasjon er mulig gitt fraværet av gener som koder for ekstracellulære wnt signal antagonister [33].
den ikke-tilfeldig paring av ulik
APC
mutasjoner i svulstene {f.eks protein trunkering nær mutasjon klynge regionen (MCR) med allel sletting eller metylering}, kombinert med funksjonelle studier av mutante APC proteiner [35], [36], har foreslått at cellen må beholde noen evne til å regulere Wnt /β-catenin signal under tumorprogresjon – den såkalte «akkurat passe» hypotese [ ,,,0],37]. En vurdering av de kjente roller for Wnt /β-catenin signal under tykktarmskreft progresjon gir noen begrunnelse for denne hypotesen: i tidlige stadier, fremmer økt signalestamcelle fornyelse og endrer migrasjon av krypten epitelceller [38], mens senere den fungerer som en bryter for å regulere epitelial til mesenchymale overganger under invasjon og metastasering [39]. Således kan tumorprogresjon kreve forbigående opp- eller nedregulering av target genekspresjon avhengig av mutasjonsbelastnings og lokale miljøforhold. Gitt at villtype Nkd1 protein vedvarer i
NKD1
-mutant cellelinjene som ble testet, hypoteser vi at de mutante Nkd1 proteiner – som hver beholder flere funksjonelle motiver (N-terminal myristoylation, EFX, og 30 aa motiver ) – aktivere Wnt signale
in vivo
, kanskje analog til på hvilken måte APC proteiner avkortet nær MCR aktivere Wnt signalering [36]
til tross for overveldende bevis for at unormal Wnt /β-. catenin signal fører til kreft, rollen Dsh /DVL proteiner i neoplasi er fortsatt uklar. Wnt signal kan fremme Dsh /Dvl opphopning [40], og Dvl overekspresjon kan etterligne aktivering av Wnt /β-catenin signal aksen [41], noe som tyder på at Dvl hyperaktivitet, som β-catenin stabilisering på grunn av mutasjon, kan være en primær årsak av forhøyet Wnt signal i kreft. Faktisk har Dvl forsterkning og overekspresjon blitt identifisert i neoplasi {f.eks lungekreft [42]}, men Dvl akkumulering i kreft kan også være en sekundær konsekvens av uhindret Wnt ligand drevet autoaktivering av signalering [43]. Gitt de avgjørende roller for Dsh /Dvls i «ikke-kanoniske» Wnt trasé som styrer planar-celle-polaritet og cellemigrasjon i virveldyr [44],
NKD1
mutasjoner kan også endre Dvl aktivitet i ikke-kanoniske wnt veier som styrer celle polaritet eller migrasjon under kreft progresjon. Fremtidige eksperimenter vil fokusere på å forstå hvordan de mutante Nkd1 proteiner endre Wnt signal under kreft progresjon
in vivo
.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Dette studien ble utført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Studien ble godkjent av Institutional Review Board of Mayo Clinic sykehus. Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke til uttak av prøver og påfølgende analyse. Frog reindrift, in vitro fertilisering, og embryo kultur og iscenesettelse ble utført i henhold til standard protokoller og alle dyrene ble håndtert i henhold til god dyr praksis som definert av American Association for Laboratory Animal Science, og
Xenopus
På fig.
