Abstract
Bakgrunn
Tyrosinkinaser drive spredning og overlevelse av mange menneskelige kreftformer. Dermed profilering den globale tilstanden tyrosinfosforylering av en svulst er sannsynlig å gi et vell av informasjon som kan brukes til å klassifisere svulster for prognose og prediksjon. Imidlertid er det omfattende analyse av tyrosinfosforylering av et stort antall humane kreftprøver teknisk krevende med dagens metoder.
Metodikk /hovedfunnene
Vi brukte en phosphoproteomic metode kalt SH2 profilering for å karakterisere det globale tilstand av fosfotyrosin (pTyr) signalisering i human lungecancercellelinjer. Denne fremgangsmåte kvantifiserer de fosforylerte bindingsseter for SH2-domener, som brukes av celler for å reagere på endringer i pTyr under signalering. Celler kan grupperes basert på SH2 bindende mønstre, med noen klynger korrelerte med EGF reseptor (EGFR) eller K-RAS mutasjonsstatus. Binding av spesifikke SH2-domener, aktivatorer mest fremtredende RAS sti GRB2 og ShcA, korrelert med EGFR mutasjon og følsomhet for EGFR-hemmer erlotinib. SH2 bindende mønstre speiles også MET aktivering og kunne identifisere celler drevet av flere kinaser. De Ptyr svarene av celler behandlet med kinase hemmere gitt bevis av distinkte mekanismer for hemming.
Konklusjon /Betydning
Denne studien illustrerer potensialet av modulære proteindomener og deres proteomikk bindende profiler så kraftig molekylær diagnostikk verktøy for svulst klassifisering og biomarkør identifikasjon
Citation:. Machida K, Eschrich S, Li J, Bai Y, Koomen J, Mayer BJ, et al. (2010) karakteriserer tyrosinfosforylering signale i Lung Cancer Bruke SH2 Profiling. PLoS ONE 5 (10): e13470. doi: 10,1371 /journal.pone.0013470
Redaktør: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, USA
mottatt: 3 mai 2010; Godkjent: 23 september 2010; Publisert: 19 oktober 2010
Copyright: © 2010 Machida et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble delvis finansiert med tilskudd fra National Funksjonell genom senter (https://nfgc.moffitt.org/nfgc_Site.aspx?spid=E395859332944CBF8AFBDED2CE39B74A) (W81XWH-08-2-0101), National Institutes of Health (http: //grants.nih.gov/grants/oer.htm) (P50-CA119997, R33-CA107785, og RC1-CA146843) og CT Breast Health Initiative, Inc. (https://ctbhi.org/). Dette arbeidet har vært støttet delvis av en bevilgning fra National Institutes of Health (P30CA076292) til Molecular Biology Core og bioinformatikk kjernefasiliteter ved H. Lee Moffitt Cancer Center Forskningsinstitutt. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
reseptor og ikke-reseptor-tyrosin-kinaser regulere mange aktiviteter viktige for kreft, inkludert celleformering, overlevelse, invasjon /metastase, og angiogenese [1]. Disse signal proteinene utgjør derfor en viktig klasse av drug targets for behandling av kreft, og tallrike tyrosinkinase-inhibitorer (TKI) er under utvikling eller blir nå brukt i klinikken. Lungekreft står for mer enn 160 000 dødsfall per år i USA [2], så det er en kraftig begrunnelsen for å identifisere sentrale drivere av lungekreft som kan terapeutisk utnyttes. Aktiviteten av den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR) blir ofte forhøyet i lunge cancer, og hemming av EGFR TKI gjennom erlotinib kan forlenge overlevelsen hos pasienter med lungecancer motstandsdyktige overfor kjemoterapi [3]. I tillegg til EGFR, har en rekke andre tyrosin-kinaser er foreslått som terapeutiske mål i lungecancer, inkludert MET, insulin-lignende vekstfaktor-reseptorer (IGFR), SRC kinase, fibroblast vekstfaktor-reseptorer (FGFR), blodplate-avledet vekstfaktor reseptorer (PDGFR), anaplastisk lymfom kinase (ALK), og Ef-reseptorer [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12] .
Et sentralt spørsmål i TKI behandling for lungekreft er hvilke pasienter som vil ha nytte av disse stoffene, siden kostnadene er betydelig og mange får ingen nytte av behandling. Et viktig gjennombrudd var oppdagelsen av aktiverende somatiske mutasjoner i EGFR som forbedrer reseptorsignalisering og forutsi følsomheten til TKI rettet mot EGFR, slik som erlotinib og gefitinib [13], [14], [15]. I lungekreftpasienter som bærer disse mutasjonene, responsrater til EGFR TKI kan være høy og overlevelse er bedre enn det som ble sett med cytostatika [16]. Ikke desto mindre noen pasienter uten EGFR mutasjon kan dra nytte av EGFR-inhibitorer, og markører som for eksempel EGFR genamplifikasjon, autokrin TGFa produksjon, eller genekspresjonsprofiler har vært foreslått for å identifisere disse pasientene [17], [18], [19]. I tillegg kan resistensmekanismer som MET forsterkning eller sekundære mutasjoner i EGFR raskt føre til resistens [20], [21], [22]. Til slutt, noen tumorceller er sannsynlig å bli drevet av flere tyrosinkinaser, og fremgangsmåter for å identifisere og klassifisere disse er nødvendige [23].
proteomic strategier (som undersøker globale mønstre av proteinekspresjon eller fosforylering) er også å være brukes til å klassifisere svulster [24]. Massespektrometri (MS) sammen med anti-fosfotyrosin-antistoff er identifisert ulike mønstre av tyrosin kinase signalering i lungekreftceller og svulster, og denne tilnærmingen var i stand til å identifisere celler som drives av onkogene EGFR, PDGFR, og ALK [4]. Andre studier som bruker samme metode fant mønstre tyrosinfosforylering forbundet med mutant EGFR-signalisering [25], [26]. Totalt sett dette arbeidet gir bevis på prinsippet om at globale tyrosinfosforylering mønstre kan gi nyttig informasjon for svulst klassifisering. Imidlertid, nåværende MS metoder krever relativt store mengder av prøve og kvantifisering av fosforylerte områder er utfordrende, således nye phosphoproteomic strategier er nødvendig.
Vi har utviklet en alternativ phosphoproteomic metode, betegnet SH2 profilering, som komplementerer MS-baserte tilnærminger [27], [28]. SH2 profilering er svært følsom og gjennomstrømning er relativt høy, og dermed er det ideelt for profilering fosfotyrosin (pTyr) signalering i kreftceller. Den konseptuelle grunnlaget for SH2 profilering er å bruke mobil egen pTyr signal beredskapsapparatet å avhøre staten pTyr signalering. Ved reseptor-tyrosinkinase (RTK) aktivering av den resulterende økning i protein-tyrosin-fosforylering genererer bindingsseter for modulære Ptyr-spesifikke bindende domener; det er relocalization av intracellulære effektorer som inneholder Ptyr bindende domener til disse fosforylerte områder som er nøkkelen steg i signaloverføring [29]. Den klart mest tallrike pTyr bindende modul hos mennesker er Src homologi 2 eller SH2 domenet [30]. Det er 120 SH2-domenene er kodet av det humane genomet, og hver SH2 domene binder et unikt spektrum av tyrosin-fosforylert sider [28], [31]. Fordi SH2-domener er det som cellen bruker til å svare på eller «lese» endringer i tyrosinfosforylering under signalering, kan omfanget av binding av forskjellige SH2-domener gir et vell av informasjon om mekanismene og status av pTyr signalering.
for å teste om denne tilnærmingen er nyttig for å karakterisere og klassifisere kompliserte krefttyper som lungekreft, der flere tyrosin kinaser drive nedstrøms signalering og vedlikeholde tumorvekst, søkte vi SH2 profilering til lungekreft cellelinjer. Vi finner at Ptyr mønstre kan være relatert til kjente funksjoner i cellene inkludert EGFR mutasjonsstatus og følsomhet for EGFR-TKI. Våre resultater tyder på at SH2 profilering gir ny innsikt i pTyr signale som trolig vil være nyttig for prediksjon og prognose for lungekreft.
Resultater
SH2 profilering identifiserer undergrupper av lungekreft cellelinjer
Vi har valgt en gruppe på 22 ikke-småcellet lungekreft cellelinjer med kjent EGFR og K-RAS mutasjonsstatus og kjent følsomhet for EGFR TKI erlotinib (Suppl. Tabell S1). Den generelle strategi for våre studier er vist i fig. 1. Cellelysater ble fremstilt fra aktivt voksende celler dyrket i serum-supplert medium. To fremgangsmåter for å generere SH2-profiler ble anvendt, revers-fase protein matrise og vidt Western blotting [28]. I den første metoden blir multiple proteinprøver (cellelysater) sett i rekker i linje med brønnene i en 96-brønners kammerapparat. Hver brønn blir så fylt med en oppløsning inneholdende en annen GST-SH2 domene sonde, og etter inkubering og vasking, blir det bundne probe kvantifisert for hver enkelt flekk. Mengden av binding avhenger av antallet og affiniteten av tyrosin-fosforylert protein steder i prøven. Med denne tilnærming, som vi kaller den «rosett» analysen, er det mulig å profilere det totale nivå av bindings for praktisk talt alle SH2-domener i genomet (94 SH2-domene prober og en PTB domene som representerer 90 forskjellige proteiner) ved anvendelse av minimale mengder av proteinet prøven.
humane lungekreftcellelinjer (Suppl. Tabell S1) ble dyrket i nærvær eller fravær av tyrosin-kinase-inhibitorer erlotinib eller dasatinib. Celleproteiner ble ekstrahert og analysert ved rosett og vidt Western blotting ved anvendelse av en rekke SH2-domene prober (Suppl. Tabell S3). Bioinformatiske analyse av tallfestet data ble brukt for klassifisering og biomarkør screening.
For å undersøke slektskap forskjellige celle lunge kreft cellelinjer, ble kvantitative SH2 bindende verdier utsatt for unsupervised hierarkisk clustering analyse (se Methods). Resultatene er vist i varmekartet format på fig. 2A og rå bildedata vises i Suppl. Fig. S1. Data med lavt signal /bakgrunn ble forkastet; data for de resterende 70 sondene var median-sentrert for clustering; rødt indikerer høyere enn medianen bindende, grønt lavere. De behandlede data kan bli funnet i Suppl. Tabell S2. Data kan også nås ved hjelp av en web-basert viewer (https://proteome.moffitt.org/sh2/). I denne analysen cellelinjer som bærer mutant EGFR klynge sammen i tre distinkte underklynger, mens to store grupper (av fire og åtte cellelinjer) utelukkende består av linjer med villtype (wt) EGFR. Disse resultatene tyder på at SH2 profilering kan identifisere undergrupper av lungekreftceller, og at slike grupper synes relatert til EGFR mutasjonstatus.
(A) Rosett data gruppert ved SH2 domene og cellelinje. Hver rad representerer en enkelt SH2 domene og hver kolonne representerer en enkelt cellelinje. Biologiske egenskaper (EGFR mutasjon, K-RAS mutasjons, erlotinib følsomhet) er vist ovenfor i svart og hvitt. For erlotinib følsomhet, positive /sensitiv: IC
50 10 nM; middels /moderat følsomme: 10-1000 nM; negativ /ufølsom: 1000 nM. (B) Far-vestlige data grupperte etter SH2 domenespesifikke bin og cellelinje. Hver rad representerer en enkelt MW bin (20 binger /kjørefelt) for en bestemt SH2-domene og hver kolonne representerer en enkelt cellelinje.
Den andre SH2 profilering tilnærmingen bruker langt Western blotting for å få mer detaljert informasjon om den relative overflod og tilsynelatende molekylvekt (MW) av fosfoproteiner som binder forskjellige SH2 domene prober. Proteinprøver ble separert på basis av størrelse ved hjelp av gelelektroforese og overført til membraner, som deretter probet med merket SH2-domener. SH2 bindende proteiner er avslørt som band, og den tilsynelatende MW av disse bandene kan gi ledetråder til sin identitet. Vi utviklet programvareverktøy som lar SH2 bindende data fra langt-vestlige blotter å bli kvantifisert i «binger» av tilsynelatende MW, f.eks 20 binger per kjørefelt. Dataene fra hver binge (svarende til fosfoproteiner av en spesiell MW-området som bindes til proben SH2) kan deretter bli brukt som basis for klassifisering av prøver. Således i stedet for en enkelt verdi for hver prøve og SH2 domene, som i rosett-analysen, gir kvantitativt langt Western blotting minst 20 forskjellige datapunkter, i stor grad øke den potensielle diskriminering mellom prøvene.
Far-Western blots av lungekreft cellelinjer ble probet med 36 SH2 eller PTB-domener, så vel som anti-pTyr-antistoff. Rå bildedata kan bli funnet i Suppl. Movie S1, og kvantitative data i Suppl. Tabell S2. Når kvantitative resultater ble utsatt for hierarkisk clustering, prøvene samlet inn i 3 forskjellige klasser, pluss to uteliggere (Fig. 2B). En av disse (klynge 3) består i sin helhet av celler med wt EGFR og er sterkt anriket for celler med aktivering av K-ras-mutasjoner. I kontrast er klynger 1 og 2 anriket for celler med EGFR mutasjoner; innenfor hver av disse klyngene, celler med vekt og mutant EGFR er segregert. Således kvantitativ vidt Western blotting synes å gi ytterligere informasjon om tyrosin kinase signaleringstilstand som kan brukes til å klassifisere funksjonelt celler på basis av RTK aktiveringsstatusen. Samlet clustering resultatene fra Rosett og langt-vestlige analyser er like, men ikke identiske, som beskrevet nedenfor.
Binding av et sett med SH2-domener er forbedret i celler som aktiverer EGFR mutasjoner
neste spurt om binding av alle individuelle SH2 domenet sonder var sterkt forbundet med aktivering av EGFR mutasjoner. Fra rosett bindende eksperimenter vi identifisert 7 prober som bindingen ble korrelert i en statistisk signifikant måte med EGFR mutasjonsstatus. GRB2, ShcA (PTB), Grap2, Brk, TXK, CblB og CblA (Fig. 3A) (se Suppl tabell S3 for SH2 domenenavn og tilsvarende proteiner). Vi inngangs disse domenene til PPI Spider, et verktøy for å tolke proteomics data i sammenheng med kjente protein-protein interaksjon nettverk. Denne analysen viste at fem av disse proteinene (ShcA, GRB2, CblA, CblB, og BRK), har blitt rapportert å binde seg direkte til EGFR, mens Grap2 er potensielt bundet til EGFR gjennom ShcA (Fig. 3B). Det faktum at bindingsseter for GRB2 og ShcA (og den nære GRB2 relative Grap2) er nært forbundet med EGFR mutasjon er spesielt interessant, ettersom økt binding av disse SH2-domener vil være sterkt spådd å føre til aktivering av RAS signalveien via rekruttering av RAS aktivator Sos [32], [33]
(A) SH2-domener som bindende er signifikant korrelert med EGFR mutasjon (q 0,1).. Bar tomt på SH2 signal for mutant og villtype EGFR cellelinjer er vist som gjennomsnitt med standardfeilfelt. «SH2 domene» er brukt på figurene for alle prober, herunder PTB domener og anti-pTyr-antistoff. (B) Protein-protein interaksjon kartet for EGFR (grå sirkel) og proteiner med SH2-domener som bindende er signifikant korrelert med EGFR mutasjon (hvite sirkler). Linjene indikerer rapporterte direkte bindende interaksjoner. (C) Far-vestlige domenespesifikke band signifikant korrelert med EGFR mutasjon. Fargede boksene viser resultatene av statistisk signifikans i en Mann-Whitney test for forskjeller (q 0,1) blant de 22 cellelinjer som er vist i figur 2B. Pil viser bin tilsvarer EGFR familiemedlemmer. Tallene ved siden av binger indikere tilsynelatende MW, f.eks «291,0» = MW mellom 256-291 kDa.
En tilsvarende analyse ble utført ved hjelp av data fra fjerne Western blotting. Vi fant ut at en rekke konkrete band på langt-vestlige blotter korrelerte signifikant med EGFR mutasjon (Fig. 3C). Her er det interessant å vurdere band som bindende tendens til å øke i EGFR muterte celler (rød) versus de som bindende tendens til å avta i EGFR muterte cellene (grønn). Vi merker oss at for prober forutsagt (på grunnlag av kjente signaleringsaktivitet) for å være assosiert med stimulering av RAS pathway (GRB2 og SHC), økt binding i molekylvektområdet inneholdende fosforylerte EGFR-familiemedlemmer (MW194, pil) er sett etter EGFR muterte cellene. Dette sannsynligvis skyldes økt binding av disse effektorer unormalt aktivert EGFR, sammenlignet med vekt reseptoren. Dette gjelder også for SH2-domener av andre kjente positive effektorer av EGFR-signalering, inkludert Vav2, PI 3-kinase (PI3K, P85B)., Og PLCγ Plcg1)
I motsetning til EGFR mutasjon, fant vi ingen individuell SH2-domener som binding korrelert sterkt med RAS mutasjonsstatus ved rosett eller langt-Western blotting. Til tross for dette, la vi merke til en interessant tydelig sammenheng mellom clustering basert på globale SH2 profiler og K-RAS mutasjonsstatus. Dette er spesielt tydelig i tilfellet med vidt Western blotting (fig. 2B), hvor to hovedklyngene utelukkende består av celler med wt K-RAS, mens en tredje hovedgruppe (klynge 3) består nesten utelukkende av celler med wt EGFR men mutant K-RAS. Vi ble først forvirret av utseendet på H1299 i klyngen # 3, som K-RAS er vekt i disse cellene. Imidlertid ytterligere undersøkelse av sekvensdata viste at K-RAS relativ N-RAS er mutert i H1299 (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/CellLines/), men ikke i noen av de andre celle linjer brukt i denne studien. Dermed en prognose basert på SH2 profilering, som H1299 celler er sannsynlig å huse aktiverte RAS, ble båret ut, sterkt validere den biologiske relevansen av denne tilnærmingen. Denne klyngen av RAS mutanter (6 av 6 cellelinjer som bærer RAS mutasjon) er svært lite sannsynlig å ha skjedd ved en tilfeldighet (p = 0,001, permutasjon test, n = 100 000). Disse resultatene indikerer at tyrosinfosforylering mønster kan under klassifisere celler basert på RAS-mutasjon status. Mangelen på sammenheng mellom individ SH2 domene prober og RAS mutasjon (i motsetning til korrelasjon basert på den globale tyrosinfosforylering profil) kan gjenspeile det faktum at RAS funksjoner nedstrøms av tyrosin kinaser. Vi tester for tiden den modellen som konstituerende Ras aktivitet fører til aktivering av tilbakemeldinger veier som grovt downregulate tyrosin kinase-signalering.
Et sett med SH2 prober er korrelert med følsomhet av lungekreftceller til EGFR-TKI
Vi neste fastsatte hvis SH2 domenet binding korrelert med følsomhet for lungekreft cellelinjer som erlotinib, et lite molekyl EGFR kinase inhibitor. Slike domener kan tjene som grunnlag for prediktiv biomarkører for å identifisere svulster sannsynlig å svare på TKI behandling. SH2-profileringsdata ble undersøkt for mulig korrelasjon med IC
50 for erlotinib for hver cellelinje (IC
50 ble analysert med hensyn på denne studien under de samme dyrkningsbetingelser som brukes for SH2 profilering). Vi har funnet at bindingen av 13 prober som tilsvarer 12 proteiner korrelerte på en statistisk signifikant måte med erlotinib IC
50 (fig. 4A). Disse inkluderer GRB2 (vist i fig. 4B), ShcA, ShcA (PTB), p85B, Cis1, Arg, Eat2, Plcg1, Ptk70 /SRMs, Fes, LNK, Tem6, og BTK. Network analysen bekrefter rapporter om direkte interaksjon mellom EGFR og GRB2, ShcA, p85B, Cis1, Arg, Plcg1, Fès, og BTK (fig. 4C). Samlet resultatene er konsistente med en modell hvor erlotinib følsomhet er forbundet med spesielt sterk signal fra aktivert EGFR til kjente kjerne nedstrøms effektbokser, inkludert MAPK (GRB2 og ShcA), PI3K /Akt (p85B), og PLCγ (PLCg1) veier.
SH2 domenet signal i ubehandlede celler ble sammenlignet med ln IC
50 for erlotinib. (A) domener signifikant korrelert til ln IC
50. Negative korrelasjoner indikerer høyere SH2 bindende i cellene mer følsomme (lavere IC
50) til erlotinib. (B) Scatter tomt på GRB2 SH2 domene bindende vs. ln (IC
50) for erlotinib. (C) Protein-protein interaksjon kartet for EGFR og proteiner med SH2-domener som bindende er signifikant korrelert med erlotinib følsomhet. Linjene indikerer rapporterte direkte bindende interaksjoner. (D) Heatmap representerer korrelasjonen av hvert domene-spesifikke bin til erlotinib følsomhet. Pearsons korrelasjon ble beregnet for hver domene-spesifikk bin på tvers av 22 cellelinjer og ln (IC
50) for den tilsvarende cellelinje. Hver heatmap plassering representerer korrelasjonskoeffisient for at bin; grønn indikerer økende SH2 signal med synkende IC
50-verdier (større følsomhet); Rødt indikerer økende SH2 signal med økende IC
50 verdier (se farge bar). Pil viser MW bin inneholder EGFR familie proteiner. (E) Listen over de 46 domenespesifikke binger med | korrelasjonskoeffisient | . 0.5
Far-Western blotting også identifisert band som korrelerte med erlotinib følsomhet (fig 4D . E). For et stort antall av SH2-domener, høyere tilsynelatende binding til EGFR-familiemedlemmer (pil ved MW194 i fig. 4D) ble forbundet med erlotinib følsomhet, mens CSK (som nedregulerer Src-familie kinaser) var unikt i den lavere tilsynelatende binding av sin SH2 domene til EGFR ble assosiert med erlotinib følsomhet. Disse resultatene var svært lik de som ble sett for EGFR mutasjon (Fig. 3 C), noe som tyder på at økt binding av RAS aktivatorer og redusert binding av CSK til EGFR er forbundet både med EGFR mutasjon og erlotinib følsomhet. Mens i prinsippet vår analyse kan bli forvirret av den kjente sammenhengen mellom EGFR mutasjon og erlotinib følsomhet, vi inkludert i våre analyse flere linjer som er resistente overfor erlotinib til tross for at aktive EGFR mutasjoner (H1975, H820, H2279 og H1650), samt linjer med vekt EGFR som er følsomme overfor erlotinib (H292, H358, H1648, og H322). Det er spesielt interessant at CSK er den eneste SH2 domene hvis binding til det område av klatt inneholdende EGFR avtar i begge EGFR mutante celler og i celler som er følsomme for erlotinib. CSK regulerer negativt Src-familie kinaser, en viktig klasse av ikke-reseptor tyrosin kinaser [34]. Selv om CSK SH2 binding er relativt svakt og forskjeller mellom cellelinjene er beskjeden, har vi bekreftet den statistiske betydningen av sammenhengen i flere separate forsøk (Suppl. Fig. S2).
MET aktivering fanges opp av SH2 profilering
A potensiell styrken av SH2 profilering vil være å identifisere tumorer der flere hyperactivated tyrosinkinaser virker sammen for å drive nedstrøms signalering, så vi undersøkt hvorvidt SH2 profilering kunne identifisere cellelinjer der MET og EGFR samtidig er aktivert . MTT-kinase forsterkes i H820 og H1648-celler [20], [35], som klynge tett sammen ved både rosetter og langt-vestlig SH2 profilering (fig. 2). I langt-vestlige blotter, vi også bemerket sterk binding av flere SH2-domener, inkludert p85a til regionen ~148 kDa i H820 og H1648. Vi observerte en lignende bånd ved ~148 kDa for en rekke andre cellelinjer, inkludert HCC827, H4006, H358 og H441 (Fig. 5A). Mistanke om dette bandet ble en markør for MET aktivering, vi testet dette ved sondering immunoblotter med en phosphospecific antistoff som spesifikt gjenkjenner aktivert MET (Suppl. Fig. S3A). Denne analysen, sammen med immunpresipitering og inhibitor-studier, viste at fosforylering av 148 kDa båndet var sterkt avhengig av MET-aktivering (sin tilstedeværelse korrelert med aktivert MET og ble inhibert med MET-spesifikke TKI), men bandet var ikke MET-reseptoren selv (Suppl. fig. S3b, C). Samtidig har vi indirekte undersøkte aktiviteten av EGFR familien ved å kvantifisere tyrosinfosforylering av ~194 kDa-regionen i immunoblot, hvor EGFR-familiemedlemmer er funnet (Suppl. Fig. S3A). Immunoutfelling og inhibitor-studier viste at det meste av SH2 bindingssignalet i denne regionen av blottene kunne tilskrives EGFR-familiemedlemmer (Suppl. Fig. S3b, C).
(A) Far-Western blot for lunge kreft cellelinjer undersøkt med p85A SH2-domener. Merk fremtredende band av ~145 kDa i H820 (pil). (B, C) hierarkisk clustering relatert til MET og EGFR familie aktivering. Hierarkisk gruppering basert på rosett-data (B) eller vidt Western-data (C), som tidligere er vist på fig. 2. farge indikerer cellelinjer som co-klynge av både rosett og langt-Western-analyse (klynge 1, 2, 2b og 3). MET aktivering = immunoreaktivitets med phosphospecific MET antistoff. pTyr MW 194 = immunoreaktivitet med anti-pTyr på 194 kDa kasse, som er en avlesning av EGFR familien aktivering (se Suppl. Fig. S3). Cutoffs for MET aktivering: positive, 50% høyeste verdien i immunoblotting med anti-MET pY1334 /1335; middels, 25-50%; negativ, 25%. Cutoff for pTyr MW194: positiv, 25% høyeste verdien i immunblotting med anti-pTyr; middels, 10-25%; negativ,. 10%
Vi relaterte MET og EGFR aktiveringsstatus med SH2 profilering resultater. Bemerkelsesverdig, uten tilsyn gruppering av både rosett og langt-vestlige data viste at de fleste cellelinjer med sterk MET aktivering klynge i en distinkt, tett gruppe (Fig 5B . C). Både ved rosett og vidt Western-baserte profilering, de fleste cellelinjer med sterk MET aktivering danner en enkelt klynge (cluster 1) som er klart adskilt fra de andre cellelinjer. Alle disse cellelinjene oppviser også sterk tyrosinfosforylering av proteiner som ko-migrerer med EGFR, noe som tyder på co-aktivering av MET, og EGFR-signalering i denne gruppen. Informasjon om MET og EGFR aktivisering også tillatt oss å mer generelt sammenligne clustering resultater basert på rosett og langt-vestlige data. Denne sammenligningen viser at fire forskjellige grupper var felles for begge metoder (Fig. 5B, C), som omfatter 15 ut av de 22 cellelinjer (7 linjer klynge forskjellig når de to metodene blir sammenlignet). Klynge 1 består av cellelinjer med sterk aktivering av både EGFR og MET signalering. Klynge 3 består av cellelinjer med mutert RAS og lav EGFR og MET-aktivitet, som alle er erlotinib resistente. Klynge 2 kan deles inn i to undergrupper basert på EGFR mutasjonstatus. Fra et klinisk perspektiv disse to undergrupper er de mest interessante: en består av linjer med mutant EGFR som er motstandsdyktig erlotinib (cluster 2b), og den andre omfatter flere linjer med wt EGFR som befinner erlotinib følsomme
Neste vi. testet om binding av eventuelle individuelle SH2 domenet prober ble forbundet med MET aktivering. Ved rosett analyse fant vi at binding av 46 SH2-domener ble signifikant assosiert med MET fosforylering (Fig. 6A). På samme måte, vidt Western-analyse viste et stort antall bånd er forbundet med MET-fosforylering status (fig. 6B). Antallet SH2-domener og markører som korrelerer med MET aktivering er større enn de som forbindes med EGFR mutasjon, noe som tyder på MET aktivitet har en mer dyp effekt på gjennomsnittlige Ptyr mønstre enn EGFR mutasjon.
(A) SH2-domener korrelerte med MET fosforylering (p 0,01, q 0,1). Bar tomt på SH2 signal for høy og lav MET fosforylering. Gjennomsnitt og standardfeil vises. For denne analysen «Low» inkluderer både middels og lave /negative kategorier (Fig. 5). (B) Far-vestlige domenespesifikke band korrelerte med MET fosforylering. Fargede boksene indikerer statistisk signifikans i Mann-Whitney test for forskjeller (q 0,1). (C) H1648-celler ble utsatt for kontroll (DMSO), 1000 nM erlotinib (E), 1000 nM PHA665752 (P), eller kombinasjon (E + P) i 3 timer og analysert ved immunblotting. Lysates fra ubehandlede H820 celler fungerte som kontroll for p-MET. Anti-β-aktin ble benyttet for å bekrefte lik belastning. (D) Celleviabilitet for H1648 celler eksponert for 60 nM erlotinib (E), 300 nM PHA665752 (P), eller kombinasjon (E + P).
Det faktum at H1648 cellelinje gruppert tett med H820-cellelinjen, som tidligere var blitt funnet å ha en aktiverende EGFR-mutasjonen sammen med MET-amplifikasjon [20], foreslått at H1648 celler kan være lik H820 i den nedstrøms signalisering er drevet av både EGFR og MET. For å teste dette, utsettes vi H1648 celler til hemmere av EGFR (erlotinib), MET (PHA665752) [36], eller kombinasjonen og undersøkt nedstrøms Akt og ERK-aktivering (Fig. 6C). Vi har observert beskjeden reduksjon i fosforylert Akt og ERK som reaksjon på hver inhibitor alene, men sterk hemming ved dobbel EGFR og MET inhibering. Virkningene på cellenes levedyktighet speilet signaleringsresponser, som en kombinasjon av begge midler resulterte i økt inhibisjon av cellevekst (fig. 6D). Dermed globale Ptyr mønstre, analysert ved SH2 profilering, spår MET aktivering og kan forutsi respons på MET TKI i disse cellelinjene.
forstyrrelse av globale Ptyr profiler etter TKI
neste brukte SH2 domene profilering å undersøke endringer i global tyrosinfosforylering i celler eksponert for TKI. Vår forventning er at endringer i SH2 bindende mønstre kan være korrelert med biologiske reaksjoner på hemmere, og at prober som binding redusert kraftig i TKI-hemmet celler var trolig representere viktige trasé for TKI handling. Fire lunge kreft cellelinjer (H292, H441, H358 og HCC827) ble kort utsatt for erlotinib, en hemmer av EGFR, eller dasatinib, en SRC familie kinase inhibitor som hemmer flere tyrosin og serin /treonin kinaser [37], [38], [39]. Disse cellelinjene er svært forskjellige i sine svar på disse TKI. I HCC827 celler med aktivering av EGFR mutasjon, hemmer begge indusere apoptose; i H358 og H292 celler med vekt EGFR, både agenter induserer cellesyklus arrest; og H441-celler med wt EGFR er resistente mot begge midler ([9] og data ikke vist). Rosett og langt lige SH2 profilering ble utført i alle fire cellelinjer i både behandlede og ubehandlede grupper.
Rosett-bindingsdata (log
2 fold endringer i behandlede versus ubehandlede grupper) ble visualisert i fall plott vurdering endringer i SH2 binding (fig. 7A, Suppl. fig. S4A). I HCC827, erlotinib forårsaket fullstendig kollaps av pTyr signalering, som store reduksjoner i SH2 binding er observert i nesten alle sonder. De mest betydelige reduksjoner i bindende skjedde for GRB2, Grap2, Vav2, og Vav1 SH2-domener. Grovt ble observert tilsvarende endringer på dasatinib behandling, noe som tyder på en overlapping av mekanismen, men fold endringene var mindre for de fleste prober, i samsvar med sine mindre potente effekter på EGFR fosforylering [9]. I likhet med HCC827, binding av nesten alle SH2 domenet prober ble kraftig redusert i TKI-behandlede H358-celler, og det var enda større likhet mellom svarene på erlotinib og dasatinib. I H441, som er motstandsdyktig mot TKI, erlotinib og dasatinib fremkalle lignende generelle endringsmønstre som H358. Men reduksjonen i SH2-binding ble avstumpet i H441 sammenlignet med H358 og HCC827, og bindingen av et større antall av SH2-domener økt i nærvær av begge inhibitorer sammenlignet med ubehandlede celler. Til slutt, H292 viste de minst dramatiske endringer i SH2 domene binding, og den samlede mønster av respons på TKI behandling i denne cellelinje var svært forskjellig fra de andre tre. Videre er erlotinib og dasatinibbehandlede profilene var mer forskjellig i forhold til de andre cellelinjene som ble testet. De samme prøver ble også analysert ved hjelp av lang Western blotting ved å bruke et begrenset sett av SH2-prober (Suppl. Fig. S4B). Fig.
