Abstract
Bredden av HER2 uttrykk ved primære humane eggstokkreft er fortsatt kontroversielt, som stiller spørsmål ved sin egnethet som en universell antigen i denne malignitet. For å løse disse problemene, utførte vi omfattende HER2 uttrykk analyse på et bredt panel av primære svulster samt etablerte og kortsiktige menneskelige eggstokkreft cellelinjer. Konvensjonell immunhistokjemisk (IHC) analyse av flere kreft nettsteder i 50 tilfeller av høy klasse på eggstokkene serøs karsinom viste økt forekomst av HER2 i 29% av vurderte nettsteder. Men mer følsomme påvisningsmetoder inkludert flowcytometri, western blot analyse og q-PCR avslørte HER2-ekspresjon i alle nye tumor-celler avledet fra primære ascites eller faste tumorer, så vel som alle etablerte og kortsiktig dyrkede cancercellelinjer. Kreftceller generelt uttrykt HER2 på høyere nivåer enn det som finnes i vanlige eggstokk overflaten epithelial (OSE) celler. Følgelig genetisk konstruert humane T-celler som uttrykker en HER2-spesifikk kimære antigen reseptor (CAR) anerkjent og reagerte mot alle etablerte eller primære eggstokkreft celler testet med minimal eller ingen reaktivitet mot normale OSE celler. I konklusjonen, alle menneskelige eggstokkreft uttrykke immunologisk-detekterbare nivåer av HER2, noe som indikerer at IHC måling undervurderer den sanne hyppigheten av HER2-uttrykke eggstokkreft og kan begrense pasientens tilgang til ellers klinisk betydning HER2-rettet behandling.
Citation : Lanitis E, Dangaj D, Hagemann IS, Song DG, Best A, Sandaltzopoulos R, et al. (2012) Primær Menneskelig Ovarian epithelial kreft celler bredt Express HER2 ved Immunologisk-detekterbare nivåer. PLoS ONE 7 (11): e49829. doi: 10,1371 /journal.pone.0049829
Redaktør: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 13 juli 2012; Godkjent: 17 oktober 2012; Publisert: 26.11.2012
Copyright: © 2012 Lanitis et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Eggstokkreft forskningsfond, Sandy Rollman Ovarian Cancer Foundation, National Institutes of Health (1R21CA152540) og Joint Fox Chase Cancer Center og University of Pennsylvania Eggstokkreft SPORE (P50 CA083638). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ErbB2
proto-onkogen koder for et trans protein tyrosin kinase reseptoren er involvert i utvikling og progresjon av mange kreftformer, inkludert kreft i eggstokkene [1], [2]. Dysregulert HER2-signalisering i eggstokk-kreft (OvCa) er resultatet av enten genamplifikasjon eller overekspresjon og fører til raskere cellevekst [3], forbedrede DNA-reparasjon [4] og øket kolonidannelse [5]. HER2 overekspresjon er assosiert med økt risiko for progresjon og død spesielt blant kvinner med FIGO stadium I og II OvCa [6]. Imidlertid har ingen sammenheng ble funnet mellom tilstedeværelsen av økt forekomst av HER2 og FIGO stadium, noe som tyder på at aktivering av økt forekomst av HER2 er bred og kan oppstå både i tidlige og sene stadier av sykdommen [7]. Disse kvalitetene ville synes å gjøre HER2 en attraktiv molekyl for målrettet immunterapi hos kvinner med HER2-positiv eggstokkreft, hvor naturlig forekommende CD4
+ og CD8
+ T-celle responser har blitt observert [8].
HER2 protein uttrykk er oftest påvises via semi-kvantitativ IHC analyse på parafin innebygd vev gjennom etablerte protokoller som benyttes for vurdering av brystkreftpasienter som vurderes for anti-HER2 Herceptin (trastuzumab) behandling [9]. I hvilken grad HER2 uttrykkes ved OvCas fremdeles kontroversiell, som frekvensen av HER2-positiv OvCas er rapportert i litteraturen varierer fra 4,9% til 52,5% [6], [7], [10], [11], [12] , [13], [14], [15]. Imidlertid, i en enkelt studie utført av Hellstrom et al., Alle tumorcellelinjer som ble etablert
in vitro
fra fast tumor eller ascites uttrykt HER2 som tyder på en selektiv vekst fordel for HER2-positiv kreft celler i kultur [16 ]. En etablert cellelinje ble vist å være følsomme for HER2-rettede antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC), derimot, HER2 uttrykk og ADCC-sensitivitet ble ikke vurdert på celler avledet fra fysiologiske eggstokkene. I tillegg ble HER2 uttrykk analyse benyttes flowcytometri som eneste deteksjonsmetode og begrenset til et forholdsvis lite antall tilfeller, avhengig tungt på in vitro cellekultur.
I denne studien, etablerte eggstokkreft cellelinjer, primære korttids dyrkede cellelinjer og friske eggstokkreft celler avledet fra ascites og solide tumorprøver ble evaluert for HER2 ekspresjon anvendelse av forskjellige påvisningsmetoder, herunder kvantitativ PCR (q-PCR), western blot analyse og flowcytometri, og ekspresjonsnivåene ble sammenlignet tilsvarende nivå i normale eggstokkene overflaten epitel celler. Videre ble immunologisk aktive nivåer av HER2 målt ved hjelp av humane T-celler som ble genmodifisert til å uttrykke en HER2-spesifikk kimære antigen reseptor (CAR). Anti-HER2 CAR T-celler ble evaluert for deres evne til å gjenkjenne HER2-uttrykk OvCas og normale celler. Våre resultater viser at alle OvCa prøvene uttrykker HER2, og at dette nivået av uttrykket er tilstrekkelig til å utløse immun anerkjennelse.
A.
Farging viser regionale mangfold av HER2 uttrykk i høyverdig papillær serøs eggstokkene adenokarsinom. HER2 uttrykk nivåene ble gradert i en 0-3 skala (skår 0 = umulig å oppdage, scorer 3 = sterk farging). Original forstørrelse var 200 ×.
B.
Heatmap illustrasjon av HER2 uttrykk nivå i 50 grunnskoler og metastaserende ovarialcancer tilfeller, som scoret etter IHC farging.
C
Frekvensfordeling av nettsider uttrykker HER2 på nivåer som spenner fra poengsummen 0 til 3. Gjennomsnittlig antall evaluerte områder for saker med ikke målbart eller påviselig HER2 uttrykk ble lignende (4.2 vs. 3.7 henholdsvis.
P
= 0,19). .
D
Frekvensfordeling av enten primær eller metastaser uttrykker HER2 på nivåer som spenner fra poengsummen 0 til 3. En større frekvens av primær tumor nettsider uttrykt HER2 (36%; 30/84) sammenlignet med metastaser (24 %, 27/111), og hadde en høyere gjennomsnittlig HER2 uttrykk poengsum (0,37
vs
0,21,
P
= 0,04).. Ingen statistisk signifikant forskjell ble observert sammenligne uttrykket nivåer mellom primær- og metastaser som uttrykte HER2 på alle nivå (1,03
vs.
0,86,
P
= 0,26).
P
verdier ble beregnet ved hjelp av uparet t-test analyse.
Materialer og metoder
kreftceller og Lines
Givere inngått en university of Pennsylvania Institutional Review Board (IRB) -godkjent klinisk protokoll og signert et informert samtykke før svulst eller blodprøvetaking. Ved solide tumorer eller normale eggstokk-prøver, ble prøven terninger i RPMI-1640, vasket og sentrifugert (800 rpm, 5 minutter, 15-22 ° C), og resuspenderes i enzymatisk fordøyelse buffer (0,2 mg /ml collagenase og 30units /ml DNase i RPMI-1640) for rotasjon over natten ved romtemperatur. Ascites samlingene ble vasket og oppbevart før studien. Kortsiktige dyrkede primære linjer ble vennlig levert av Dr. Richard Carroll ved University of Pennsylvania [17]. Etablerte menneske eggstokkreft og brystkreft cellelinjer, ble CEM human T-celle lymphoblast lignende cellelinje og 293T cellelinje kjøpt (ATCC). Normal IOSE-4 og IOSE-6 cellelinjer ble vennlig levert av Dr. Birrer fra Dana-Farber /Harvard Cancer Center [18] og 398 cellelinjen var en gave fra Dr. Lin Zhang ved University of Pennsylvania [19]. 293T-celler og tumorcellelinjer ble holdt i komplett medium; RPMI-1640 (Invitrogen) supplert med 10% (volum /volum) varme-inaktivert FBS, 2 mM L-glutamin, og 100 ug /mL penicillin og 100 U /mL streptomycin.
A.
ErbB2
mRNA nivåer i eggstokkreft cellelinjer av Q-PCR.
ErbB2
mRNA-nivåer av ovarie cancer cellelinjer står i forhold til det av ErbB2-negative CEM-celler. Alle eggstokkreft cellelinjer uttrykke
ErbB2
mRNA. B-aktin ble benyttet som et endogent gen kontroll. Resultatene viser gjennomsnitt ± SD av triplikate brønner. Gjennomsnittlig relativ
ErbB2
mRNA uttrykk blant etablerte og kortsiktige OvCa cellelinjer var ikke statistisk forskjellig (
P
= 0,45).
P
verdi ble beregnet ved hjelp av uparet t-test analyse.
B
Påvisning av overflate HER2 protein uttrykk (fylt histogrammer) ved menneskelige eggstokkreft cellelinjer ved flowcytometri.; isotype antistoff kontroll (åpne histogrammer).
C.
Western blot analyse av HER2 protein uttrykk i representative cellelinjer som uttrykker differensial mengder HER2. HER2-proteinet blir uttrykt ved variable nivåer i alle ovarie-cellelinjene som ble testet. B-aktin ble brukt som kontroll.
Immunohistochemistry
Institutional Review Board godkjenning ble innhentet. Vi hentet poster fra 50 pasienter fortløpende med metastatisk papillær serøs eggstokkreft (FIGO stadium IIB og over) som gjennomgår primær reseksjon ved vår institusjon mellom 2005 og 2008. Lysbilder ble gjennomgått og kommentert og parafininnstøpte vevsblokker ble valgt til å konstruere en vev microarray av primære og metastatiske svulster. 206 totale kreftforekomster (primære tumor og metastaser) var representert på tabellen. Et gjennomsnitt på 3,7 seter ble inkludert per pasient. De vanligste metastaser inkludert omentum, bukhinne (f.eks blindgate), livmor serøse hinnen, og tarmveggen. For hver blokk, ble tredoble 0,6 mm kjerner av svulst plassert på en vev microarray. 5 um paraffin-snitt ble farget med kanin anti-humant HER2-antistoff (Dako) i henhold til standard protokoller. HER2 uttrykk i hver kjerne ble scoret av lysmikroskopi ved 200 × forstørrelse ved hjelp av en semikvantitativ skala fra 0 til 3.-kjerner som viser mindre enn 10% tumor ikke ble scoret. For hver tumorlokalisering, sluttresultatet var gjennomsnittet av resultatet for alle evaluerbare kjerner.
Kvantitativ PCR
RNA ble isolert ved hjelp av RNA lett kit (Qiagen). cDNA ble generert fra en ug RNA ved hjelp av First Strand Ready-To-Go perler (GE Healthcare). Real-time PCR ble utført i tre paralleller bruker Applied Biosystems primere for
ErbB2 Hotell og Bed-aktin.
ErbB2
mRNA nivåer i kreftcellene ble normalisert til B-aktin, og sammenlignet med de i CEM, og er presentert som fold
ErbB2
mRNA nivå. Datainnsamling og analyse ble utført i henhold Applied Biosystems instruksjoner.
A
.
ErbB2
mRNA kvantifisering i CD45-utarmet primære ascites kreftceller. SKOV-3 og CEM ble brukt som positiv og negativ HER2-uttrykkende cellelinje kontroller respektivt. Barer viser gjennomsnitt ± SD verdier av triplikate brønner.
B
.
ErbB2
mRNA kvantifisering i CD45-utarmet primære solide tumorceller.
ErbB2
mRNA nivå ble ikke observert noen signifikant forskjell i gjennomsnittlig mellom ascites og solide tumorer (
P
= 0,46).
C.
Surface HER2 uttrykk (solide histogrammer) ved representant ber-EP4
+ CD45
– gated ascites og solide tumor-avledet kreftceller overvåkes av flowcytometri; isotype antistoff kontroll (åpne histogrammer). Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i HER2 protein nivå mellom ascites eller solide tumorer avledet celler (
P
= 0,95).
D.
Western blot analyse av HER2 protein uttrykk i bulk solide svulster lysatene. B-aktin ble benyttet som endogene gen kontroll. OVCAR-3 og CEM ble anvendt som positive og negative kontroller for HER2-ekspresjon. P-verdier ble beregnet ved hjelp av uparet t-test analyse.
flowcytometrisystemer
Mus anti-human CD3, CD4, CD8, CD45, CD69, CD107a og CD107b mAbs (
BD Biosciences)
ble brukt for fenotypeanalyser. 7-AAD ble brukt for levedyktighet farging. HER2 overflate-ekspresjon ble evaluert ved anvendelse av biotin-konjugert anti-HER2 affibody (Abcam) fulgt av PE-merket streptavidin. Anti-HER2 CAR overflate uttrykk ble evaluert ved hjelp av rekombinant humant HER2 Fc chimera fulgt av PE-konjugert anti-huIgG. Oppkjøp og analyse ble utført ved hjelp av en BD FACS CANTO II med DIVA programvare.
A.
ErbB2
mRNA kvantifisering i normale OSE celler (398, IOSE-4, IOSE -6 og 1744) med q-PCR. SKOV-3 og CEM ble brukt som positiv og negativ HER2 uttrykkende cellelinjer henholdsvis. Linjer viser gjennomsnitt ± SD verdi av tredoble brønner.
Surface HER2 protein uttrykk B plakater (solide histogrammer) ved normale eggstokkene epitelceller ved flowcytometri.; isotype antistoff kontroll (åpne histogrammer).
C-D. Host Sammenligning av
ErbB2
mRNA og proteinnivåer mellom eggstokkreft ascites, solid tumor og normale OSE celler. (
C
) Vertikale spredningsplott av
ErbB2
mRNA i ascites, solid tumor og normal OSE bestemmes av q-PCR. Middelverdien for hver gruppe er angitt ved den horisontale linjen.
P
= 0,0498 når man sammenligner
ErbB2
mRNA i ascites vs normale OSE celler;
P
= 0,0210 når man sammenligner
ErbB2
mRNA i solide svulster vs normale OSE celler. (
D
) Vertikale spredningsplott av proteinnivået i ascites, solid tumor og normal OSE bestemmes av flowcytometri. Middelverdien for hver gruppe er angitt ved den horisontale linje
P
= 0,0616 ved sammenligning av HER2-protein i ascites vs normale OSE celler;
P
= 0,1749 når man sammenligner HER2 protein i solide svulster vs normale OSE celler.
P
verdier ble beregnet ved hjelp av uparet t-test analyse.
Western blotting
Cell monolagene ble vasket med fosfatbufret saltvann (PBS) og lysert i RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,0), 1,0% NP-40, 0,1% deoksykolsyre, 30 mM Na
3VO
4, 1 mM PMSF). Lysates ble klarert av sentrifugering og kvantifisert ved hjelp av en Nanoorange Kit (Invitrogen). 15 ug totalt protein pr kjørefelt ble løst ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) i pre-støpt gradient (4-15%) geler (Bio-Rad) ved 120 V i 60 minutter. Protein ble overført fra gelen til Immobilon-P-membran overføring i 30 minutter, blokkert natten over med 5% melk /PBST og blottet ved bruk av 1 ug /ml av muse-anti-humant HER2-mAb (klon 3B5, BD Biosciences). Membranene ble vasket 3 x med PBST og blottet med HRP-konjugert anti-muse-sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. B-actin ble påvist ved anvendelse av anti-human B-aktin-HRP (1:30,000). Membraner ble inkubert med ECL Plus (GE Healthcare) i 5 minutter og utsatt for filmer for 15-30 sek.
A
. Skjematisk fremstilling Anti-HER2 kimære antigen reseptor (CAR) konstruksjon inneholdende CD3ζ cytosoliske domene alene (C6.5-z) av. C6.5, anti-HER2 scFv; VL, variabelt lettkjede; L, Linker; VH, variable tunge kjeden; TM, transmembrane region. C6.5 scFv CAR uttrykk (grå histogrammer) ble oppdaget på menneskelig CD4
+ og CD8
+ – gated T-celler ved hjelp av rekombinant humant HER2-Fc kimære protein 10 dager etter transduksjon, sammenlignet med untransduced T-celler (åpne histogrammer ). Andel CAR transduksjon er indikert.
B.
Anti-HER2 CAR omsatte T-celler produsere IFN-γ spesielt etter stimulering med menneskelige eggstokkreft cellelinjer. CAR omformet eller untransduced T-celler ble dyrket alene (ingen) eller stimulert over natten med menneskelig HER2
+ etablert og kortsiktige eggstokkreft cellelinjer eller HER2
– kontrollinjer CEM og MDA468. IFN-γ ble kvantifisert fra cellefrie supernatanter ved hjelp av ELISA.
C.
Anti-HER2 CAR T-celler utskiller IFN-γ etter stimulering av HER2
+ primære ascites (venstre) eller fast eggstokkene (midten) tumorceller. Minimale mengder av IFN-γ ble påvist etter stimulering med de normale eggstokk overflate epitelceller 398, IOSE-4, IOSE-6 eller 1744 (høyre). Cytokinkonsentrasjoner (pg /ml) er rapportert som gjennomsnitt ± SEM av tredoble brønner.
Anti-HER2 CAR Construction
PCR-produkter som inneholder C6.5Y100KA HER2 scFv [20] ble vennlig levert av Silvana Canevari (Instituto Nazionale dei Tumori, Italia) og deretter klonet inn i pCR2.1-TOPO vektor bruker Topo TA Cloning Kit (Invitrogen). Den C6.5 scFv [21] DNA-sekvens ble utviklet fra den ovenfor plasmidet ved hjelp av QuikChange multiseterettet mutagenese Kit (Stratagene). Det endelige plasmid ble brukt som et templat for PCR-amplifikasjon av et 795 bp-C6.5 scFv-fragment ved å bruke de følgende primere: 5′-GCGGGATCCATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGGGGCA-3 «(BamHI er understreket) og 5′-GCGGCTAGCCGCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCCTCCGCC-3» (Nhel er understreket ). Det resulterende PCR-produkt ble spaltet med BamHI og Nhel og ligert inn i de tredje generasjons selvinaktive lentiviral ekspresjonsvektor pCLPS inneholdende en CD3ζ system Bil sekvens, med transgen ekspresjon drevet av CMV-promoteren. Den resulterende konstruksjon ble betegnet pCLPS-C6.5-z.
C6.5 CAR T-celler degranulate og uttrykke T-celle aktivering markører i respons til HER2-spesifikk stimulering. C6.5 CAR T-celler ble dyrket uten målceller (ingen) eller med de indikerte HER2-negativ eller -positivt etablert og primærtumorcelle mål eller normale OSE celler for 5 timer mens de har vært farget av en anti-CD107a, b antistoff konjugert med FITC. Etter inkubasjonstiden, ble T-celler farget for CD8 og CD69 og analysert ved flowcytometri.
rekombinant Lentivirus Produksjon
Høy titer replikering-defekt lentiviral vektorer ble produsert og konsentrert som tidligere beskrevet [22]. Kort fortalt ble 293T celler transfektert med 7 ug pVSV-G plasmid, 18 ug pRSV.REV plasmid, 18 ug pMDLg /p.RRE plasmid, og 15 ug pCLPS-C6.5-z transfer plasmid bruker Express I (Open Biosystems). Viral supernatant ble høstet ved 24 timer og 48 timer etter transfeksjon. Virale partikler ble konsentrert ved ultrasentrifugering i 3 timer ved 25 000 rpm med en Beckman SW28 rotor (Beckman Coulter) og resuspendert i 0,4 ml RPMI.
T Cell Transduksjon
primære humane T-celler som er kjøpt fra menneskelig immunologi Kjerne ved University of Pennsylvania ble isolert fra friske donorer etter leukaferese av negativ seleksjon. Alle prøvene ble samlet under et universitet Institutional Review Board godkjent protokollen, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver donor. T-celler ble stimulert i fullstendig media med anti-CD3 og anti-CD28 mAb belagte perler (Invitrogen) og omformet med rekombinant CAR-koding lentivirus på MOI av ~5-10 som beskrevet [22].
cytokine release assays
1 x 10
5 T-celler ble ko-dyrket med 1 x 10
5 målceller per brønn i triplikat i 96-brønners rundbunnede plater i et endelig volum på 200 ul komplett media. Etter 20~24 timer ble cellefrie supernatanter analysert for tilstedeværelse av IFN-γ ved hjelp av enten en ELISA Kit (Biolegend) eller cytokin Bead Array (BD Biosciences), i henhold til produsentens instruksjoner.
degranulation analysen
-analysen ble utført som beskrevet [23] med mindre modifikasjoner. 1 x 10
5 T-celler ble ko-dyrket med 1 x 10
5 målceller i 100 ul media per brønn i en 96-brønns plate i tre eksemplarer. Kontrollkulturer inneholdt T-celler alene. Anti-CD107a og anti-CD107b Ab (10 pl /brønn) eller lgG1 konjugert til FITC (BD Biosciences), og 1 ul /prøve av monensin (BD Biosciences) ble tilsatt til kulturen og inkubert i 5 timer ved 37 ° C. Cellene ble vasket to ganger med PBS, beiset for uttrykk av CAR, CD8 og CD69 og analysert ved flowcytometri som beskrevet ovenfor.
Chromium Slipp analysen
51 Cr frigjøring ble utført som beskrevet [24]. Målceller ble merket med 100 uCi
51Cr ved 37 ° C i 1,5 timer. Målceller ble vasket tre ganger i PBS, resuspendert i kulturmedium ved 1 x 10
5 levedyktige celler /ml og 100 pl tilsatt per brønn av en 96-brønn v-bunn plate. Effektorceller ble vasket to ganger i kulturmedium og tilsatt til brønner i de gitte forhold. Platene ble raskt sentrifugert for å avgjøre celler, og inkubert ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator i 18 timer, hvoretter supernatantene ble høstet, overført til en Lumar-plate (Packard) og tellet ved bruk av en 1450 Micro væskescintillasjonsteller (Perkin-Elmer). Spontan
51 Cr frigjøring ble evaluert i målet celler inkubert med medium alene. Maksimal
51Cr frigjøring ble målt i målceller inkubert med SDS til en sluttkonsentrasjon på 2% (v /v). Prosent spesifikk lysis ble beregnet som (eksperimentelt – spontan lysering /maksimal – spontan lysering) ganger 100.
Statistical Analysis
GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Software) ble brukt for statistiske beregninger.
P
0,05 verdier ble betraktet som signifikant. R-squared verdier (R
2) ble beregnet ved hjelp av lineær regresjon via Microsoft Excel.
Resultater
Immunhistokjemisk påvisning av HER2 uttrykk i eggstokkreft
HER2 uttrykk ble evaluert i 50 tilfeller av høy klasse på eggstokkene serøs karsinom bruker immunhistokjemiske (IHC) analyse i en vev microarray (TMA). Enkelte tilfeller variert med hensyn til antall av tumor steder som er tilgjengelige for analyse. Alle tilfeller inneholdt minst én primær lesjon området mens de fleste tilfellene (96%) hadde både primære og ≥1 metastatisk nettstedet tilgjengelig. For mange prøver, var det ≥2 (62%) eller ≥3 (42%) metastaser tilgjengelig på TMA. Ifølge IHC score, ble HER2 uttrykk på ulike nivåer mellom de 50 tilfellene som spenner fra undetectable (0 poeng) til sterk farging (scorer 3+, figur 1A). Positiv HER2 uttrykk på alle nivå ble påvist i 26 saker (52%), mens ingen HER2 kunne påvises på alle områder i 24 tilfeller (Figur 1b). Ut av de 26 tilfellene uttrykker HER2 på ett eller flere områder, bare 6 (23%) uttrykte HER2 på alle områder ved IHC; slike saker ble vektet mot høyere HER2 uttrykk. De fleste saker som uttrykt HER2 på alle områder (20/26) viste uharmoniske uttrykk (påviselig versus undetectable) på ett eller flere kreft nettsteder. Det midlere antall av vurderte områder var lik blant de 26 tilfeller med detekterbar HER2 og de 24 tilfeller med ingen påvisbar HER2 (4,2 vs. 3,7, henholdsvis; dyrkningsmedium
P
= 0,19). Heterogenitet i fordelingen av HER2 protein uttrykk blant de forskjellige områdene i enkeltsaker var til stede med flere mønstre: påvises i alle (6/50); påvises i primær men undetectable i metastatisk tumor (8/50); påvises i metastatisk men påvises i primærtumor (5/50); påvisbare i minst en primær og en metastaser (7/50). Av 195 tumorsider evaluert, 138 (71%) viste ingen påvisbar HER2 uttrykket (figur 1C). Femti-sju (29%) hadde positiv HER2 uttrykk; 25% (49/195) med a 0≤1 HER2 poengsum; 2,5% (5/195) med a 1≤2 HER2 poengsum; og 1,5% (3/195) med a 2≤3 HER2 poengsum. En større frekvens av primær tumor nettsider uttrykt HER2 (36%; 30/84) sammenlignet med metastaser (24%; 27/111) og hadde en høyere gjennomsnittlig HER2 uttrykk poengsum (0,37
vs
0,21,
P
= 0,04, figur 1D). Blant primære og metastaser som uttrykte HER2 på alle nivå, var det ingen statistisk signifikant forskjell i uttrykksnivået (1,03
vs.
0,86,
P
= 0,26). I konklusjonen, IHC åpner for påvisning av HER2 uttrykk i 29% av alle nettsteder og omtrent halvparten av alle avanserte OvCa tilfeller testet.
HER2 er uttrykt Alle Ovarian Cancer Cell Lines
Den relativt lav sensitivitet av IHC analyse kan påvirke deteksjonen av lav overflod proteiner og som derfor uriktige opplysninger om den virkelige frekvens av kreft som uttrykker HER2. For å bedre evaluere HER2 uttrykk i OvCa, 12 etablert og 7 kortsiktige OvCa cellelinjer ble målt for
ErbB2
mRNA nivåer av Q-PCR, og sammenlignet med det som oppdages fra CEM, en human T-celle lymphoblast lignende cellelinje som mangler HER2 uttrykk [25]. Alle OvCa cellelinjer uttrykte
ErbB2
mRNA, om enn på ulike nivåer (Figur 2A). Økt
ErbB2
mRNA uttrykk, i forhold til CEM kontroll, varierte fra 63- til 6614-fold i etablerte linjer og fra 40- til 1088-fold i kortsiktige primære cellelinjer. Gjennomsnittlig relativ
ErbB2
mRNA uttrykk blant etablert (815 ganger) og kortsiktige OvCa cellelinjer (372 ganger) var ikke signifikant forskjellig fra hverandre (
P
= 0,45).
ErbB2
mRNA ble ikke påvist i CEM-styreledningen, men var detekterbar i lave nivåer i styre brystkreft linje, MDA468, som uttrykker
ErbB2
mRNA, men ikke overflaten HER2-protein [25] .
HER2-protein-ekspresjon ble undersøkt på etablerte og kortvarig primær tumorcellelinjer ved å farge ikke-permeabiliserte celler med en meget følsom anti-HER2-affibody [25], en høy affinitet ligand mot det ekstracellulære domene av HER2 , etterfulgt av strømningscytometrisk analyse. Representative histogrammet viser etablert OvCa cellelinjer som uttrykker høye, middels eller lav overflate nivåer av HER2 protein, og negative kontrollcellelinjer med noen påviselig HER2 uttrykk (figur 2B). All etablert (n = 12) og kortvarig (n = 7) OvCa cellelinjene som ble testet viste HER2-protein overflate-ekspresjon (Tabell 1). De fleste cellene i etablert (97,7 ± 1,3%) og kortsiktige linjer (88,9 ± 4,8%) uttrykte HER2 protein, med en høyere prosentandel i de etablerte linjer (
P
= 0,03) (tabell 1). Mener HER2 protein nivåer målt ved spesifikk gjennomsnittlig fluorescens intensitet (MFI) tendert mot å bli høyere i etablerte cellelinjer (1906 ± 1221 EFE, fluorescens intensitet enheter) i forhold til kortsiktige cellelinjer (594 ± 165 EFE), men var ikke signifikant forskjellig (
P
= 0,43) (tabell 1), i samsvar med mRNA resultater. HER2 protein og
ErbB2
mRNA uttrykk nivåer fra alle OvCa cellelinjer ble signifikant korrelert (R
2 = 0,83; beregnet ved hjelp av lineær regresjon). Cellular HER2 protein uttrykk ble bekreftet av western blot analyse (representative prøver vist Figur 2C).
Bred HER2 uttrykk i Primær Eggstokkreft Prøver
Siden
in vitro
kultur kan selektivt berike for HER2-uttrykk OvCa celler [16], målte vi HER2 uttrykk i ukulturtumorceller avledet direkte fra primær peritoneal OvCa ascites eller fersk resected solide tumorer. Tumorceller fra ascites eller heldekkende vevsprøver ble beriket av magnetisk uttømming av CD45
+ leukocytter og vurderes for relativ
ErbB2
mRNA nivåer via q-PCR (figur 3A, B). Alle primær ukultiverte tumorceller testet (n = 22) uttrykte
ErbB2
mRNA på nivåer som spenner fra 35- til 1225 ganger høyere enn CEM-celler. Ingen signifikant forskjell i gjennomsnittlig
ErbB2
ble observert mRNA nivå mellom ascites og solide tumorer (477
v
s 583, henholdsvis.
P
= 0,46). Flowcytometri utført ved hjelp av anti-HER2 affibody viste at ikke-permeabilized tumorceller (BerEp4
+ CD45
-) i alle primære ascites (n = 22) og solide tumorprøver (n = 10) uttrykte overflate HER2 protein, om enn på variable nivåer, i samråd med påvisning av
ErbB2
mRNA av q-PCR (tabell 2; representative data vist i Figur 3C). Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i HER2 protein nivå mellom ascites eller solide tumorer avledet celler (7209 ± 1197 EFE
vs
7407 ± 2531 EFE, henholdsvis.
P
= 0,95), i samråd med mRNA resultater. Western blot analyse utført på hele svulsten lysatene viste også allestedsnærværende uttrykk for HER2 i grunnskolen solide tumorer (representative prøver vist i figur 3D).
registreres HER2 uttrykk i Normal Eggstokk Epitelceller
Tre udødelig eggstokkreft overflate epitel cellelinjer (OSE) og én primærukulturcelleprøve (1744) stammer fra normale eggstokker ble testet for HER2 uttrykk. Alle normale OSE cellene uttrykte lave nivåer av
ErbB2
mRNA som varierte fra 35 ganger til 217 ganger høyere enn CEM kontrollceller (128 ± 5.5, Figur 4A). Flowcytometri (figur 4B) og western blot analyse (ikke vist) indikerte at alle normale OSE-celler uttrykker lave, men påviselige nivåer av HER2-protein. IOSE-6 og IOSE-4 cellelinjer uttrykte høyere proteinnivåer enn 398 linjen og 1744 normal eggstokk prøven, i samsvar med mRNA resultater.
Neste vi sammenlignet de
ErbB2
mRNA og proteinnivåer i normale celler OSE, ondartet ascites og primære solide tumor-avledede tumorceller (figur 4C-D). Ascites og solide tumorprøver generelt uttrykt høyere nivåer av
ErbB2
mRNA og protein sammenlignet med OSE celler, selv om en overlapping i uttrykket nivå fantes blant grupper. Ascites og solide tumorer uttrykt betydelig mer
ErbB2
mRNA enn OSE celler (Ascites, 483 ± 319-fold,
P
= 0,0498; Solid svulst, 583 ± 330-fold,
P
= 0,0210; OSE, 128 ± 93 ganger). HER2 protein nivåer tendens til å være høyere i ascites (5825 ± 1202 ganger) og solide tumorprøver (7407 ± 2531 ganger) sammenlignet med normal OSE (1429 ± 111 ganger), men til en lav statistisk signifikans (Ascites
v.
s OSE
P
= 0,0616;. Solid
vs
OSE
P
= 0,1749). Variasjon i HER2 uttrykk nivåer i OSE prøvene var begrenset, slik at en pålitelig diskriminering av tumorprøver som økt forekomst av HER2. Til sammenligning, 75% (9/12) av ascites og 90% (9/10) faste tumorer uttrykte høyere nivåer av HER2 i forhold til OSE, og 91% (20/22) av ascites og 80% (8/10) fast tumorer hadde høyere HER2 protein nivåer enn normalt OSE celler.
HER2-spesifikke T-celler gjenkjenner Alle ovarialcancer cellelinjer
kimære antigen reseptorer (biler) kombinerer antistoff spesifisitet for et overflateantigen med effektor aktiviteten av T-lymfocytter [26]. HER2-spesifikke CAR-uttrykke T-celler kan utøve potent, doseavhengig
in vitro
anti-tumor aktivitet mot HER2-positiv målceller [20], [25]. For å undersøke i hvilken grad bred HER2 uttrykk ved OvCa overfører følsomhet for HER2-rettet immunterapi, menneskelig donor T-celler ble genmodifisert til å uttrykke en anti-HER2 CAR (C6.5) [27], og dermed omdirigere dem mot overflaten HER2, og testet for spesifikk aktivitet mot OvCas. Den C6.5 CAR-konstruksjon består av C6.5 scFv forbundet med en CD8a hengsel og transmembranområdet, etterfulgt av en intracellulær signalerings CD3ζ domene (C6.5-z, figur 5A). Primær menneskelig CD4
+ og CD8
+ T-celler ble effektivt transduced med bil ved hjelp lentiviral vektorer med overføringseffektivitet reproduserbart 60% (figur 5A). I co-kultur, anti-HER2 CAR T-celler anerkjent og svarte til stimulering av alle etablerte (n = 10) eller kortsiktig (n = 4) menneskelige OvCa celler, men ikke mot CEM og MDA-468 cellelinjer mangler HER2 uttrykk (figur 5B).
