Abstract
Bakgrunn
Cancer Stem Cells (cscs) hypotese hevder at bare en liten undergruppe av celler i en tumor er i stand til både tumor initiering og opprettholdelse. Den Epitelial-Mesenchymale Transition (EMT) er en embryonale utviklings program som ofte blir aktivert i løpet av kreft invasjon og metastasering. Målet med denne studien er å belyse forholdet mellom EMT og cscs ved hjelp LC31 lungekreft primære cellelinje.
Materialer og metoder
A549 og LC31 cellelinjer ble behandlet med 2 ng /ml TGFB-en i 30 dager, og 80 dager, henholdsvis. For å evaluere EMT, ble morfologiske endringer vurderes ved lysmikroskopi, immunfluorescens og cytometri for følgende markører: cytokeratins, e-cadherin, CD326 (epiteliale markører) og CD90, og vimentin (mesenchymale markører). Videre RT-PCR for Slug, Twist og beta-catenin gener ble utført. På TGFB-1 behandlede og ubehandlede LC31 cellelinjer utførte vi stemness tester som pneumospheres vekst og demme markører uttrykk som Oct4, Nanog, Sox2, c-kit og CD133. Western Blot for CD133 og tumorgenisiteten analyser ved hjelp av NOD /SCID-mus ble utført.
Resultater
TGFB-en behandles LC31 cellelinje mistet sin epitelial morfologi forutsatt en fibroblast-lignende utseende. De samme resultater ble oppnådd for A549-cellelinjen (som kontroll). Immunfluorescens og cytometri viste opp-regulering av vimentin og CD90 og nedregulering av cytocheratin, e-cadherin og CD326 i TGFp-1 behandlede LC31 og A549 cellelinjer. Slug, Twist og β-catenin m-RNA-transkripter var oppregulert i TGFB-en behandles LC31 cellelinje som bekrefter EMT. Denne cellelinjen viste også over-uttrykk for Oct4, Nanog, Sox2 og CD133, alle genene til stemness. I tillegg, i TGFp-1 behandlede LC31-cellelinje, en øket pneumosphere dannende kapasitet og tumorer dannende evne i NOD /SCID-mus var detekterbare.
Konklusjoner
Induksjonen av EMT av TGFp -1 eksponering, i primær lungekreft cellelinje fører til kjøp av mesenchymale profil og i uttrykket av stamcellemarkører
Citation. Pirozzi G, Tirino V, Camerlingo R, Franco R, La Rocca A, Liguori E, et al. (2011) Epitelial til Mesenchymale Transition av TGFB-en Induction Øker Stemness Kjennetegn i Primær Ikke småcellet lungekreft Cell Line. PLoS ONE seks (6): e21548. doi: 10,1371 /journal.pone.0021548
Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 5 april 2011; Godkjent: 01.06.2011; Publisert: 30 juni 2011
Copyright: © 2011 Pirozzi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Nåværende Forskning 2009/10 av den italienske Department of Health til G. Pirozzi og G. Rocco. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
To viktige hypotesen har vært postulert i genesis, dannelse, vekst og metastasering av epitelial kreft: rolle kreftstamceller (cscs) eller Tumor initiere Cells (tics) og involvering av den såkalte epitelial -Mesenchymal Transition (EMT).
Cancer stamceller har blitt definert som «en celle i en svulst som har evnen til å fornye seg selv og til å føre til at heterogene linjer av kreftceller som utgjør svulst» [1 ]. Disse to definitive biologiske egenskaper er det som gjør cscs den førsteklasses kandidat for initiering av tilbakefall.
cscs hypotese hevder at bare en liten del av celler i en svulst er i stand til både startfasen og opprettholdelse [2], [ ,,,0],3]. Disse cellene uttrykker stemness markører, er i stand til å danne flytende sfærer i serumfritt medium, en egenskap som er tilknyttet stamceller, og er også i stand til å skille i en avvikende celle fenotype danner tumor heterogenitet [4]. Eksperimentelt er denne populasjonen identifisert ved sin evne til å danne nye svulster gjennom serietransplantasjon i immunodeficient ikke-overvektige diabetiske (NOD) /alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus, re-etablering av tumor heterogenitet [5].
Det er to grunnleggende emner som understreker den hypotesen om at cscs stammer fra normale vev stamceller. Først av alt, cscs har normal stamcelleegenskaper som selvfornyelse, differensiering, resistens og spredningsevne. Deretter lang av stamceller gjør dem utsatt for akkumulering av genetiske og epigenetiske skader slik som å gjøre dem gode kandidater for fremveksten av neoplastisk transformasjon [6], [7]. De cscs er de eneste celler som er i stand til å generere svulster som ligner på de opprinnelige pasientprøver når transplantert inn immunsupprimerte mus som NOD /SCID-mus [8].
Eksisterende behandling har økt lengden på overlevelse etter diagnose kreft, men helt mislykket når det gjelder utvinning. Kreft terapi feil kan skyldes ineffektiv effekter av nåværende behandling ved potensielt hvil cscs, som forblir vital og beholde evnen til å regenerere tumor [9]. I de fleste tilfeller vil de aktive terapeutiske strategier er utviklet for å målrette mot hoveddelen av kreft og sannsynligvis ikke utrydde cscs helt. Cscs er mer motstandsdyktig mot behandling, på grunn av overlevelse fordel med økt anti-apoptotiske aktivitet og medikamentresistens på grunn av økte nivåer av medikament efflukspumper som BCRP (brystkreft motstand protein) og MDR (multimedikamentresistens) -komplekser [10], [11].
cscs har blitt identifisert i en rekke forskjellige faste tumorer inkludert glioblastom [12], bryst [13], og lungekreft [14], [15]. Det er tre forskjellige hovedmetoder for å isolere cscs fra solide tumorer: i) isolering av cscs ved flow-cytometri ifølge CSC-spesifikke celleoverflatemarkører slik som CD44 eller CD133; ii) påvisning av side befolkningen fenotype ved Hoechst33342 eksklusjon; iii) sfæren formasjon under dyrking av definert serumfritt medium med vekstfaktorer som opprettholder cscs udifferensiert.
Epitelial-Mesenchymale Transition (EMT) er en embryo nøkkelen utviklings program som ofte blir aktivert i løpet av kreft invasjon og metastase [16], [17]. Det er en prosess ved hvilken celler som gjennomgår en morfologisk bryter fra den epiteliale polariserte fenotypen til den mesenchymale fibroblastoid fenotype. Som et resultat av EMT, epitelceller miste sine definerte celle-celle /celle-undergrunnen kontakter og deres strukturelle /funksjonelle polaritet, og de blir spindelformet og morfologisk lik den aktiverte fibroblaster [18]. På molekylært nivå, blir EMT definert ved tap av celle-celle adhesjon molekyler (f.eks, E-cadherin og ZO-1), nedregulering av epitelial differensiering markører inkludert cytokeratins og E-cadherin og transcriptional induksjon av mesenchymale markører så som vimentin, fibronektin og N-cadherin med et kjernefysisk lokalisering av beta-catenin [19]. Nuclear beta-catenin induserer en genuttrykksmønstrene favorisering tumorinvasjon, og montering bevis indikerer flere gjensidige interaksjoner av E-cadherin og beta-catenin med EMT-induserende transkripsjons repressors å stabilisere en invasiv mesenchymale fenotype av epiteliale kreftceller [20], [21 ]. Andre gener involvert i EMT er sneglen, Twist e SIP-1 /ZEB-2, alle repressors av genet CDH1 som koder for E-cadherin [16]. Flere forskjellige egenskaper har blitt formidlet av EMT, inkludert cellemotilitet, invasivitet, motstand mot apoptose, og noen av egenskapene til stamceller. Mange signalveier har bidratt til induksjon av EMT, inkludert transvekstfaktor-beta (TGFB-1), Wnt, pinnsvin, Notch, og nukleær faktor-kappa B (NFkB) [22]. Kyoung-Ok Hong et al. [23] har vist at aktivering av PI3K /Akt-aksen er en av de viktigste mekanismene i ferd med EMT og det synes at dens hemming ved behandling med phosphatidylinositol eter lipid analoger (PIA) kan regulere det motsatte prosessen Mesenchymale epithelial reversere Transition (Mert ) som fører til re-ekspresjon av både E-cadherin og β-catenin, og reduserer ekspresjon av vimentin, mesenchymale markør, i oral plateepitel carcinom linjer stabilisert. Under prosessen med tumormetastase, som ofte aktivert ved emts, ville disseminerte kreftceller ser ut til å kreve selvfornyelse evne, lik den som oppvises av stamceller, for å spre makroskopiske metastaser [24]. Dette øker muligheten for at EMT prosessen, som gjør det mulig for kreftcelle spredning, kan også gi en selvfornyelse evne til formidling av kreftceller. Faktisk er metastatisk prosessen minst overfladisk likhet med de prosessene som oppstår under vev reparasjon og regenerering og gjør at voksne stamceller for å avslutte vev reservoarer som benmargen, skriv og overleve i sirkulasjon, og komme inn i videregående vev områder, der de sprer, differensiere, og delta i vev rekonstruksjon [25]. Sammen utgjør disse forskjellige linjer av bevis tyder på en mulig sammenheng mellom kreft stamceller og mesenchymale-vises celler generert av EMTs og omvendte prosessen kalles Mesenchymale epithelial omvendt Transition (Mert). Mani ET kolleger [26] var de første til å vise en slik sammenheng i udødeliggjort menneskelige mammary epitelceller (HMLEs).
I denne sammenheng er det viktig å identifisere hvilke faktorer som kan indusere EMT og hvordan EMT cellene kan bli en ressurs for kreft stilk-lignende celler, utvikle nye og målrettede behandlingsformer for lungekreft. Derfor er målet med denne studien er å belyse mulig sammenheng mellom EMT og cscs ved hjelp LC31 primære cellelinje hentet fra vevsprøve etter operasjonen i pasient påvirket av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC).
resultater
TGFB-en behandling induserer morfologiske forandringer i NSCLC cellelinjer
for å undersøke effekten av TGFB-en på LC31 og A549-cellelinjer, vi behandlet dem med 2 ng /ml TGFp-1. Som allerede også demonstrert ved Ju Hee Kim [27], A549-celler behandlet med TGFp-1 mistet sin morfologi epitelial observerbar etter 48 timers behandling; de ble dispergert og antok en fibroblast-lignende utseende med lengtet form og sentrale kjerne.
LC31 celler behandlet med TGFp-1 mistet sin morfologi og epitelial ervervet mesenchymale egenskaper som starter fra 21 dagers behandling. Cellene ble lengtet, fibroblast som med sentral kjerne og begynte å vokse som bunter. Dette morfologi ble opprettholdt i all tid for behandling (fig 1A-D.)
A:. Ubehandlet A549, OM 200 ×; B: behandlet A549, på 2 dager TGFB-en behandling, OM 400 ×; C: ubehandlet LC31, OM 400 ×; D: behandlet LC31, 30 dager TGFB-en behandling, OM 400 ×; E: vekstkurver av ubehandlet og behandlet A549; F:. Vekstkurver av ubehandlet og behandlet LC31
TGFB-en behandling induserer veksthemming hos NSCLC cellelinjer
I alle cellelinjene som ble testet, TGFfi-en indusert veksthemming. I A549, analyser vekstkurver viste en sterk veksthemming i løpet av kulturen tid med DT 28 h for behandlet A549 hensyn til DT 18 timer for den tilsvarende ubehandlede cellelinje. I LC31 celler, DT var 72 timer for behandlede celler mens DT var 36 timer for ubehandlede celler (Fig. 1E-F).
TGFB-en behandling fremmer et skifte fra epitelial til mesenchymale fenotype
Den morfologiske effekten av TGFB-1 på A549 og LC31 cellelinjer antydet at TGFB-1 fremmet en EMT. De morfologiske forandringer som er karakteristiske for celler som gjennomgår EMT er ledsaget av en endring i ekspresjon fra en epitelial til en mesenchymale repertoar. For å avgjøre om TGFB-en indusert slikt skift, vi brukte cytometri, immunfluorescens og RT-PCR for å undersøke uttrykk og distribusjon av CD90, CD326, vimentin, e-cadherin og cytockeratins markører og β-catenin, Slug og Twist gener.
i henhold til cytometrisk analyse, i ubehandlede cellelinjer, CD90 ble svakt uttrykt på A549 (gjennomsnittlig prosentandel 10%) og LC31 (gjennomsnittlig prosentvis 4%). CD326 og cytokeratins uttrykk nivåer var lav både i A549 (gjennomsnittlig prosentandel 10% og 1,1% henholdsvis) og LC31 (gjennomsnittlig andel på henholdsvis 1% og 18,6%). Vimentin var svakt positiv i A549 (gjennomsnittlig prosentandel 22%) og LC31 (gjennomsnittlig prosentandel 17%). Etter TGFB-en behandling, CD90 (gjennomsnittlig prosentandel 93%) og vimentin (gjennomsnittlig prosentandel 91%) nivåer økt, mens CD326 og cytokeratins redusert i A549 og LC31 (figur 2A, B).
A:. Cytometri analyse for CD90, CD326, vimentin og Cytokeratin i ubehandlet (linje rød) og TGFB-en behandles [linje green] i A549-cellelinjen etter 20 dagers behandling; B: cytometri analyse for CD90, CD326, vimentin og Cytokeratin i ubehandlet [linje red] og TGFB-en behandles (linje grønn) i LC31 cellelinje etter 30 dagers behandling. Isotype kontroller er i svart.
I immunfluorescens analysen, i ubehandlet cellelinjer ble vimentin uttrykt både i A549 og LC31, men det fantes i perinukleære vescicles. Cytokeratins og E-cadherin ble svakt uttrykt i begge cellelinjer. Etter TGFB-en behandling, vimentin var sterkt og jevnt fordelt i alle A549 og LC31 celler, mens cytokeratins og E-cadherin forble svakt uttrykt og lokalisert i perinukleære områder av celler til å bli opphevet etter 30 dager for A549 og 40 dager for LC31 (fig 3 A-L.)
Immunofluorescence for vimentin (A), cytokeratin (B) og e-cadherin (C) på ubehandlede A549-cellelinjen.; vimentin (D), cytokeratin (E) og E-cadherin (F) videre behandlet i A549-cellelinjen etter 20 dager av TGFp-1-behandling; vimentin (G), cytokeratin (H) og E-cadherin (I) på ubehandlede LC31-cellelinje; vimentin (J), cytokeratin (K) og E-cadherin (L) på behandlet i LC31 cellelinjen etter 30 dagers TGFp-1-behandling. Alle immunofluorescence bildene har OM 200 ×; M: RT-PCR-analyse og evaluering densitometri for Slug, Twist og β-catenin på ubehandlet og TGFp-1 behandles på LC31 cellelinje etter 0, 20, 50 og 80 dagers behandling. *, P 0001, **, p. 0,0001 i forhold til foreldrecellelinje (0 behandlingsdag)
RT-PCR data viste at det var massivt skifte av genuttrykk fra et mønster karakteristisk for epitelceller, slik at av mesenchymale celler i LC31 cellelinje med en betydelig økning i ekspresjon av EMT-induserende transkripsjonsfaktorer, spesielt beta-catenin (~1,5 ganger), Twist (~1,5 ganger), og Slug (~2,7 fold) indikerer deres EMT fenotype. Oppregulering av disse genene nevnt ovenfor var TGFp-1-avhengige tid med unntak av beta-catenin som det var en økning på 20 og 80 dager etter behandling i forhold til ubehandlet cellelinje og en svak reduksjon i 50 dager respektere 20 og 80 dager etter behandling, men alltid økt i forhold til ubehandlet cellelinje (fig. 3M).
Gene uttrykk profilering av stemness markører i EMT-LC31 cellelinje
for å undersøke genene regulerer og opprettholde stamcelle fenotype av LC31 celler som har EMT signaturer (betegnet EMT-LC31 cellelinje), utførte vi RT-PCR for OCT4, Nanog og Sox2. Interessant, transkripsjonsfaktorer OCT4, Nanog, Sox2, kjent for å være tilstrekkelig til å omprogrammere mus eller humane somatiske celler til udifferensierte, pluripotente stamceller, ble funnet å være signifikant økt i EMT-LC31 cellelinje med en økning på 3,5 ganger, tre , 0 fold, og 1,4 ganger for OCT4, Nanog og Sox-2, henholdsvis mer enn foreldrecellelinje som indikerer deres stemness fenotype (fig. 4A)
A:. RT-PCR og densitometry evaluering for Oct4 , Sox2 og Nanog gener på LC31 og EMT-LC31 cellelinjer etter 0, 20, 50 og 80 dager med behandling; B: RT-PCR og densitometry evaluering for CD133 og c-kit gener på LC31 og EMT-LC31 cellelinjer etter 0, 20, 50 og 80 dager med behandling; C: Western blot for CD133 LC31 og LC31 EMT-cellelinjer etter 0, 20, 50 og 80 dagers behandling. *, P 0001, **, p 0,0001 i forhold til LC31 cellelinje (0 dags behandling). α-tubulin er brukt som lasting kontroll.
CD133 og c-kit markører ble økt i EMT-LC31 cellelinje
For å kunne fastslå hvorvidt celler med EMT fenotype kunne vise kreft stammen som celle egenskaper, vurderer vi uttrykk for CD133, hoved markør for å identifisere kreftstamceller i NSCLC [14], [15] og c-kit [28], mesenchymale stilk markør.
Cytometry analyser viste at i LC31 opphavelige cellelinje, prosentandelen av CD133 var 3% av den totale cellepopulasjon. Etter at TGFp-1-behandling, viste resultatene at ingen forskjeller i CD133 ekspresjonsnivåer mellom sperre og EMT-celler kunne påvises (resultater ikke vist). Dette resultatet er forskjellig i forhold til dem som ble oppnådd ved RT-PCR og western-blotting for CD133. Både RT-PCR og Western blotting viste en økning på CD133 (~2,3 fold for RT-PCR) etter ulike tider av TGFB-en behandling. Når det gjelder c-Kit-genet, sistnevnte resulterte oppregulert i EMT-LC31 celler med en økning på ~2,3 ganger mer enn foreldrecellelinje (Fig. 4B, C).
Pneumospheres formasjon evne ble økt i EMT-LC31 cellelinje
Liu et al. [29] og andre [30] har vist at evnen til å danne mammospheres
in vitro
avhenger av tilstedeværelsen av selv-fornyende. Vi testet pneumophere dannende evne EMT-LC31 celler i forhold til foreldrenes cellelinje.
Betydelig, etter at vi indusert en EMT i LC31 celler ved å utsette dem for TGF-β1, fant vi at EMT-LC31 celler viste signifikant økt evne til å danne pneumopheres sammenlignet med foreldrecellelinje som danner i det minste 40 ganger mer pneumospheres enn parentale celler. Forholdet mellom pneumospheres størrelse og deres vekst var signifikant større enn for ubehandlede celler. Videre EMT pneumospheres var mer enn 50 pm i diameter etter 5 dager, mens sperre pneumospheres var 20 nm (Fig. 5A, B). I tillegg var positive alle EMT pneumospheres for CD133 (Fig. 5C). Basert på denne funksjonelle analysen konkluderte vi med at cellene som genereres av en EMT kjøpt enda en egenskap av lungekreft stamceller
A:. LC31 pneumospheres; EMT-LC31 pneumospheres; C:. CD133 uttrykk på EMT-LC31 pneumospheres
Colony effektivitet analyser
En av metodene for å analysere karsinogent potensial er myk agar metode som måler forankringsuavhengig vekst, som er en indikator for celletransformasjon. Som beskrevet i tabell 1, vurdering av vekstkinetikk avslørte store koloni effektivitet av EMT-LC31-cellelinje sammenlignet med foreldrecellelinje med 18 og tre ganger økning for 1000 og 10000, respektivt, av seeded EMT-celler i forhold til foreldrecellelinje (fig. 6A-C)
A:. fotografier av kolonier fra LC31 cellelinje og [B] EMT-LC31 cellelinje; C:. Kolonien nummer ble talt opp og dataene ble presentert som CFU (%) i forhold til celle nummer seeded
EMT-LC31 genererer svulster større enn tilsvarende foreldrecellelinje
i våre tidligere studier [15], viste vi at svulstene fra LC31 celler dyrket som pneumopsheres vokste mye raskere i forhold til at fra tilsvarende celler dyrket i tilhenger kultur tilstand. For å teste hvorvidt TGFp-1 behandling lyktes i å endre den tumor-initiering frekvens av transformerte celler, injiserte vi EMT-LC31 celler og tilsvarende cellelinje inn i immundefekte verter. Som rapportert i tabell S1, har vi funnet at volumet av tumoren indusert av EMT-LC31-celler var signifikant større enn den til parentale celler (fig. S1). Disse resultatene tyder på at cellene med EMT signatur fremmet tumorigenicity
in vivo
.
Diskusjoner
Epitelial til mesenchymale overgang (EMT) er en fundamental fysiologisk prosess der epitelceller mister sin polaritet og gjennomgår en overgang til en mesenchymale fenotype. Kjennetegn på EMT inkluderer tap av celle-celle adhesjon, re-organisering av cytoskeletal aktin og oppkjøp av økt trekkende egenskaper [31], [32].
EMT er en viktig hendelse i tumor progresjon og flere studier tilstand at EMT er aktivert i mange typer kreft [33] – [35]. Til tross for nylige fremskritt, er ytterligere studier for å avklare hvilken rolle EMT i invasjonen og metastasering av svulster. Under prosessen med tumormetastase, kreftceller, som metastaserer, tilegne ferdigheter i selvfornyelse, lik den som oppvises av stamceller for å spre metastasene [24].
Til sammen utgjør disse indikasjoner tyder på en mulig koblingen mellom kreft stamceller og mesenchymale-vises celler generert av emts.
i denne sammenheng, er målet med denne studien er å vise at EMT ervervet er forbundet med en økning av stemness signaturer i et primær-cellelinje oppnådd i vårt laboratorium. A549 lungekreft er et godt karakterisert cellelinje som har vært brukt som et modellsystem for å studere mekanismene for carcinogenese, apoptose og progresjon av kreft i lungekreft [36], [37]. Fordi EMT spiller en sentral rolle i tumorprogresjon, vi valgte A549 cellelinje som modellsystem for EMT. Vi fokuserte vår oppmerksomhet på LC31 cellelinje oppnådd i vårt laboratorium og undersøke effekten av TGFB-en på EMT og stemness mekanisme på denne linjen. Etter avtale med tidligere rapporter [38], [39], viste vi at TGFB-1 induserer EMT i A549 celler ved kjøp av mesenchymale morfologi, økt uttrykk av mesenchymale markører som vimentin og CD90 og redusert uttrykk av epiteliale markører som cytokeratins og CD326. Når definert som vår EMT Studiemodellen er brukbar, testet vi effekten av TGFB-en på LC31 cellelinje. Vi behandlet LC31 cellelinje med TGFp-1 2 ng /ml i 80 dager. Først etter ca 20 dager, ser vi morfologiske endringer som er i tråd med oppkjøpet av EMT fenotype som preget av tapet av uttrykket av epiteliale markører som cytokeratins, e-cadherin og CD326 og gevinst eller økt uttrykk av mesenchymale markører som vimentin erstatte cytokeratins. Etter 20 dager med behandling, ble LC31 celler langstrakt, sentral kjerne med fibroblast lignende form og økt stress fiber omorganisering.
EMT tar 48 timer i A549 fordi den har sterkere mesenchymale markører uttrykk enn LC31 trenger 20 dager til å gjennomgå EMT .
Derfor viser LC31 cellelinje flere funksjoner som er typisk for EMT: reduksjon i celle-celle adhesjon, flatere og spredning, uttrykk for mesenchymale markører. Slug, Twist og β-catenin, hovedtranskripsjonsfaktorer som er involvert i EMT, er oppregulert i celler behandlet og disse faktorene øker med økende TGFB-en behandlingstiden, bekrefter deres EMT fenotype.
Disse resultatene åpne måte for å kontrollere om LC31 primær lungecancercellelinje, følsom for TGFp-1-behandling, kunne øke stamcelle egenskaper. Interessant, EMT-LC31 celler også vise stilk-lignende celle fenotype preget av økt pneumosphere dannende kapasitet sammenlignet med foreldre LC31 cellelinje med EMT pneumospheres større enn foreldre pneumopheres. Videre EMT pneumospheres var positive for CD133 markør forsterke stemness signatur. Viktigst er det vel kjent at co-uttrykk for Sox-2, Nanog og Oct4 i menneskelige eller musesomatiske celler kan omprogrammere disse cellene til pluripotente embryonale stamceller lignende celler [40], [41]. I vår studie fant vi at de uttrykk for Sox-2, Nanog og Oct4 ble dramatisk oppregulert i EMT-LC31 cellelinje i forhold til foreldrenes cellelinje. Til sammen disse dataene, LC31 cellelinje med EMT signatur viste en økning på stilk-lignende celle egenskaper knyttet til overuttrykk av Sox-2, Nanog og Oct4.
Nyere studier har vist at c-kit og dens ligand uttrykkes i lungekreft. Immunohistologiske studier av c-kit ekspresjon viste at proteinet blir avvikende uttrykt bare i lungekreftceller og ikke i pneumocytes eller normale bronkiale epitelceller [42]. I tillegg Levina et al. [43], [44] har vist at behandling av lungetumorceller med doksorubicin, cisplatin, etoposid eller resulterte i valget av medikament overlevende celler som uttrykker CD133, CD117, SSEA-3, TRA1-81, Oct-4, og atom beta-catenin med lav uttrykk for differensiering markører cytokeratins 8/18. I vår studie viser vi at TGFB-1 induserer også en økning av c-kit m-RNA uttrykk, en annen stemness markør, forsterke hypotesen om at LC31 cellelinje med EMT signatur viste en økning på stammen fenotype. Et annet interessant resultat er det oppregulering av CD133 i EMT-LC31-cellelinje, men da hoved for cscs identifikasjon i lungekreft som rapportert av Eramo et al. [14] og Tirino et al. [15]. I vår studie observerte vi en økning på CD133 både i RT-PCR og Western blot, men ikke i cytometri og immunfluorescens på tilhenger celler. Det er mange jobber der tvil om begrensninger i bruk av antistoff diskuteres [45]. Antistoffene mer brukte gjenkjenne AC133 og AC141 svært glykosylerte epitoper [46]. Derfor medfører risiko for undervurdert ikke-glykosylerte former av antigenet deres bruk. Dessuten har flere CD133 mRNA spleising blitt identifisert, som i sin tur gi opphav til protein produkter ikke gjenkjennelige ved vanlige antistoffer; endelig, iboende begrensninger ved immunfluorescens og Cytometry metoder, noe som innebærer antistoff følsomhet, epitop skade på grunn av rutinemessig fiksering /inklusjons prosedyrer, antigen gjenfinning, enzymatiske trinn av cellepreparat må det tas hensyn til [47]. I denne sammenheng, kan vi også hypotese at TGFp-1-behandling gir opphav til konformasjonsendring av CD133 epitoper og dets antistoff er ikke i stand til å gjenkjenne molekylet i Cytometry og immunfluorescens prosedyrer. I pneumospheres, mest sannsynlig, kan tridimensional struktur eksponering av epitoper gjenkjent av vanlige antistoffer. Dessuten er de ikke underlagt enzymatiske trinn som kan skade cellestruktur.
Selv om dette hensynet, RT-PCR og Western blot bekrefte det samme stemness funksjon i EMT-LC31 cellelinje etter behandling av TGFB-en med oppregulering både CD133 m-RNA og CD133 protein.
til slutt, for å evaluere TGFfi-en effekt på karsinogent potensial, vi utført både myk agar assay og tumorigenicity
in vivo
. TGFp-1, i linje med kreft stamceller konsept, induserer en økning av kolonier dannelse i myk agar eksperimenter og volumet av tumorene var betydelig større enn for ubehandlet LC31 cellelinje som bekrefter at EMT fenotype ikke bare markedsføres stemness fenotype, men også den tumorigenisitet . I konklusjonen, cellene med EMT fenotype fremmet tumorigenicity.
Derfor er stor sannsynlighet for at EMT genererer celler med mange av egenskapene til selvfornyende stamceller er bekreftet av økt uttrykk av Nanog, Oct4 og Sox2, determinant selvfornyelse faktorer og CD133 og c-Kit, hoved stemness markører av cscs i lungekreft.
i konklusjonen, rapporterer vi at induksjon av EMT av TGFB-en behandling i en primær lungekreft cellelinje resultater i oppkjøpet av mesenchymale profil og i oppregulering av uttrykk for stamcellemarkører.
Denne studien fremhever muligheten til å ta en ny farmakologisk tilnærming versus EMT-fenotype celler eller kreft stilk-lignende celler for forebygging for tumorprogresjon og metastasedannelse.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
de eksperimentelle protokollene er vurdert og godkjent av den etiske komiteen på dyr bruk av Biogem. Den eksperimentelle prosjektet har godkjenning ID 10.08 og har blitt kommunisert mai
th 26, 2008 til den italienske helseministeren, etter nasjonale lover om beskyttelse av dyrevelferd. Pasienten, innrullert i denne studien, hadde signert informert samtykke, godkjent av vår interne etiske komité (National Cancer Institute, Napoli).
Cell Culture
A549-cellelinjen ble kjøpt fra ATCC Cell Bank og ble dyrket i RPMI1640 (Lonza, Milano, Italia) med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C, 5% CO
2. LC31 cellelinje er oppnådd i vårt laboratorium av en pasient påvirket av lunge plateepitel adenokarsinom med skriftlig informert samtykke, godkjent av vår interne etiske komité (National Cancer Institute, Napoli) og ble dyrket i IMDM (Lonza) på 10% FBS [14] . For eksperimenter ble cellene dyrket til 90% samløpet.
TGFB-en behandling og vekstkurver
For å indusere EMT prosess, A549 og LC31 cellelinjer ble behandlet med 2 ng /ml TGFB -1 (Abcam, Milano, Italia) i 30 og 80 dager, henholdsvis. TGFp-1 er blitt tilsatt to ganger i uken i mediet. For å teste mulige veksthemning på grunn av TGFp-1-behandling, ble 10.000 celler sådd ut i 24well plater for hver cellelinje og TGFp-1 ubehandlede og behandlede celler ble løsnet hver 24. time i 10 dager. Antallet celler for hver eksperimentell tilstand ble tellet og representeres på en lineær graf. Den dobling tid (DT) ble bestemt fra vekstkurver ved hjelp av formelen: hvor t og t
0 var de gangene hvor cellene ble talt, og N og N
0 var celle tall til tider t og t
0, respektivt.
pneumospheres assay
for å evaluere effekten av TGFp-1 på pneumospheres vekst og dannelse, ble LC31-cellelinjen sådd ut ved en tetthet på 60000 celler per brønn i seks-brønners ultralave festeplater (Corning Inc., Corning, NY, USA) i BEBM celle medium, supplert med BEGM [ingredienser SingleQuots inneholder retinonsyre, bovint hypofyse-ekstrakt, insulin, hydrokortison, transferrin, triiodotyronine, adrenalin, human epidermal vekstfaktor, gentamicin og amfotericin B (alt fra Lonza Group Ltd., Basel, Sveits) pluss human EGF (10 ng /ml, Sigma, Milano, Italia) og human bFGF (10 ng /ml, Sigma, Milano , Italia). Celler ble inkubert i en fuktig atmosfære ved 37 ° C med 5% CO
2. Friske prøver av TGFp-1, ble EGF og bFGF tilsatt to ganger i uken. Etter 48-72 timer av kultur, kuler var synlige ved omvendt fase-kontrast mikroskopi.
flowcytometrisystemer
For å evaluere effekten av TGFB-en på både stemness og differensiering fenotype av A549 og LC31 cellelinjer, 200.000 celler ble farget med følgende antistoffer (2 mikrogram /ml): mus anti-human CD90 FITC (Becton Dickinson, Buccinasco, Milano, Italia), mesenchymale markør, mus anti-human CD133 PE ( Miltenyi Biotec, Calderara di Reno, Bologna, Italia), mus anti-human CD326 PerCP (EpCAM, Becton Dickinson), epitelial markør, mus anti-human vimentin (DAKO, Milano, Italia) og mus anti-Cytokeratin (klone CK3 -6H5, Miltenyi Biotec). Antistoffene ble inkubert i 30 minutter ved 4 ° C i mørket. Etter inkubering, ble prøvene vasket med PBS og analysert ved FACSAriaII (Becton Dickinson).
