Abstract
Behandlingstilbud for sent stadium prostata og tykktarm kreft er begrenset, og det er et presserende behov for å utvikle mer effektive og målrettede nye behandlingsformer , som starter med identifisering og validering av nye terapeutiske mål. Nyere kliniske studier har vist at tissue inhibitor matriks-metalloproteinase-1 (TIMP-1) nivåene er forhøyet i kreftpasient plasma og forhøyede TIMP-1-nivåer er assosiert med dårligere kliniske resultater. Det er imidlertid ikke kjent hvorvidt TIMP-1 tjener bare som en biomarkør for kreft progresjon eller har en funksjonell rolle i å fremme progresjon av kreft, og kan tjene som en cancer terapeutisk mål, som er hovedformålet med denne studien. Her viser vi at stroma av human prostata og tykktarm kreft uttrykker høyere nivåer av TIMP-1 i forhold til deres normale motstykker, og økt ekspresjon av TIMP-1 fremmer
in vivo
vekst av begge typer kreft. Vi viser for første gang at økt TIMP-1 uttrykk stimulerer opphopning av kreft assosiert fibroblaster (kafeer) innen prostata og tykktarm kreft vev og at TIMP-1 øker prostata CAF spredning og migrasjon
in vitro Hotell og fremmer ERK1 /2 kinase aktivering i disse CAF celler. Våre resultater etablere nye PROMOTIVE effektene av TIMP-1 mot kreft progresjon og på akkumulering av kafeer som i sin tur gir en pro-svulstens mikromiljø. Sammen utgjør disse resultatene fastslå potensialet av TIMP-1 som et nytt mål for cancerterapi, og den mekanisme som ligger under pro-tumor aktivitet av TIMP-1
relasjon:. Gong Y, Scott E, Lu R, Xu Y, Oh WK, Yu Q (2013) TIMP-1 Fremmer Opphopning av kreft Associated fibroblaster og kreft progresjon. PLoS ONE 8 (10): e77366. doi: 10,1371 /journal.pone.0077366
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 24 mars 2013; Godkjent: 02.09.2013; Publisert: 15 oktober 2013
Copyright: © 2013 Gong et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en United States Army Medical Research (Department of Defense) stipend, W81XWH-10-1-0321. Finansiører har ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prognose for metastatisk kastrering resistent prostatakreft (CRPC) forblir dårlig med en median overlevelse på mindre enn 2 år. Behandlingstilbud for sent stadium prostata kreft er begrenset, og det er et presserende behov for å utvikle mer effektive og målrettede nye behandlingsformer [1-5]. Under kreft progresjon, er det viktig at kreftceller skal samhandle med og vellykket endre deres omkringliggende vertsmikromiljøet. Kreftceller kommuniserer med sine mikromiljøet gjennom celleoverflate adhesjonsreseptorer og reseptorer for den ekstracellulære matriks (ECM) og modifisere sine omgivelser i stor grad gjennom aktiviteter av matriks-metalloproteinaser (MMP). MMP spiller sentrale roller i nedverdigende ECM og bioaktivitet av MMP reguleres av vev hemmere av metalloproteinaser (TIMPs) [6]. Det er fire medlemmer av TIMP-familien, tissue inhibitor matriksmetalloproteinase-1 (TIMP-1), -2, -3, og -4. TIMPs kan hemme aktiviteten til alle MMP men med varierende effektivitet mot forskjellige MMP. MMP spiller viktige roller i tumor spredning og progresjon, og de er etablert terapeutiske mål for en rekke krefttyper [6-8]. Tidligere studier indikerte at TIMPs inkludert TIMP-1 skjerm anti-kreft aktiviteter [9-13]; Imidlertid har nyere studier vist en paradoksal pro-tumor effekt av TIMP-1 [6,14-16]. TIMPs kan påvirke kreft progresjon i en MMP-avhengig og MMP-uavhengig måte, selv om den underliggende mekanisme av den sistnevnte ikke er godt forstått [17,18].
Mange bredspekt MMP-hemmere (MMPIs) utviklet av farmasøytiske selskaper ble testet i prospektive kliniske studier, og resultatene har vært jevnt skuffende. Det er ikke etablert definitive mekanistisk forståelse for slike feil. Det er imidlertid sannsynlig et resultat av en mangel på forståelse av de forskjellige bioaktiviteter og funksjonene til forskjellige MMP’er, som siden har vært verdsatt for deres bedre pro- og /eller anti-tumor aktivitet [6,19-22]. Disse skuffende resultatene understreker også viktigheten av bedre forståelse av biologi av kreft terapeutiske mål før du utfører kliniske studier. Nylig har flere kliniske studier har vist at TIMP-1-nivåer i cancerpasientplasma og kreftvev er sterkt forhøyet, og de forhøyede TIMP-1-nivåer er assosiert med dårligere kliniske resultater i mange krefttyper, inkludert prostata og tykktarm kreft [23-34]. Det er imidlertid uklart om TIMP-1 fungerer bare som en biomarkør for kreft progresjon eller funksjoner for å fremme kreft progresjon i tillegg; og således kan tjene som et viktig terapeutisk mål kreft. Dette spørsmålet løses ved denne studien.
Her viser vi at stroma av menneskelig prostata og tykktarm kreft uttrykke høyere nivåer av TIMP-1 i forhold til sine normale kolleger, og at økt uttrykk av TIMP-1 fremmer
in vivo
vekst av både kreft typer. I tillegg viser vi at TIMP-1 øker prostata CAF spredning og migrasjon
in vitro
mens knockdown av TIMP-1 hemmer prostatakreft CAF spredning og migrasjon. I tillegg TIMP-1 fremmer aktivering av ERK1 /2 kinase i disse kafeer. Vi viser også at økt uttrykk av TIMP-1 stimulerer opphopning av kreft assosiert fibroblaster (kafeer) innen prostata /tykktarm kreft vev. Sammen våre resultater etablere de nye PROMOTIVE virkningene av TIMP-1 i progresjon av kreft og CAF akkumulering, er potensialet av TIMP-1 som en ny kreft terapeutisk mål, og den mekanisme som ligger til grunn av TIMP-1-effekter.
Materialer og metoder
Pasient kreft Samples, Celler, og reagenser
Menneskelige prostata og tykktarm kreft prøver ble innhentet fra Cooperative menneskelig vev Network (CHTN) ved Universitetet i Pennsylvania og Ohio State University. Primær prostata kreft assosiert fibroblaster (PCAFs) ble innhentet fra Asterand USA (Detroit) og dyrket i henhold til produsentens anvisninger. Menneskelige prostata fibroblaster var fra ScienCell (HPrF, Carlsbad) og dyrket i fibroblast Medium (FM, ScienCell). PC3, PC3 /M, DU145, 22RV1, LNCaP, Vcap, RWPE-en og WPE1-NB26-65 menneskelige prostata kreft celler og HCT116 og HT-29 menneskelige tykktarmskreftceller var fra NCI (DTP, DCTD Tumor Repository) og ATCC (Manassas) og vedlikeholdes etter tilbydernes anbefalinger. Menneskelig prostatakreft LAPC-4-celler ble oppnådd fra ATCC Patent Depository.
Anti-v5 epitop (Invitrogen), -TIMP-1, alfa glatt muskulatur aktin (R 0,05
Resultater
Serum TIMP-1-nivåer er forhøyet i prostatakreftpasienter sammenlignet med menn uten kreft
Serum TIMP-1 er blitt rapportert å være forhøyet i bryst, mage, tykktarmskreft og flere andre krefttyper. I denne studien har vi sammenlignet serum TIMP-1-nivåer i 140 prostatakreftpasienter i ulike sykdomsstadier og 16 menn uten kjent tegn på prostatakreft, inkludert pasienter med benign prostatahyperplasi av sandwich-ELISA. Våre resultater viste at pasienter med prostatakreft hadde en gjennomsnittlig serum TIMP-1-konsentrasjonen av 351.4 ng /ml, betydelig høyere enn gjennomsnittlig konsentrasjon av 211,0 ng /ml sett i menn uten prostatakreft rekruttert fra en urologi klinikk (
p
0,001) (figur 1A).
A. Serum TIMP-1 var signifikant forhøyet hos pasienter med prostatakreft (
p
0,001), målt ved sandwich-ELISA (R PSA på 5,6). 1070717A: prostata adenokarsinom vev fra en 53 år gammel WM (Gleason score på 4 + 3 = 7; Ptil 8,03). Bar, 100 mikrometer. C-D. TIMP-1 uttrykk ble forhøyet i mer aggressiv prostata kreft cellelinjer. TIMP-1 mRNA (C) og protein (D) ekspresjon i forskjellige prostatakreftcellelinjer ble målt ved hjelp av sanntids-qPCR (C) og sandwich-ELISA (D), respektivt. TIMP-1 mRNA ble normalisert til beta-aktin i en tosidig qPCR. TIMP-1 protein i kondisjonert medium fra de angitte cellelinjer ble målt med TIMP-1 ELISA DuoSet (R 0,05. C-E. Vekstrater i de subkutane svulstene prostata PC3 avledet fra (C), 22RV1 (D), og LAPC-4 (E) celler som uttrykker TIMP-1V5 eller transdusert med den tomme ekspresjonsvektoren (kontroller) som angitt i panelene. Vekstratene er uttrykt som gjennomsnittet av tumorvolum (mm
3) +/- SD. Seks mus ble benyttet for hver enkelt type av transduserte prostataceller.
*
p
0,05.
TIMP-1 fremmer opphopning av kreft-assosiert fibroblaster (kafeer) in vivo
For å få innsikt mulig mekanisme bak den pro-vekst effekt av TIMP-1 i prostatakreft utførte vi immunhistokjemi (IHC) analyser av tumor seksjoner som følger av dette
in vivo
eksperimenter og observert at tumorsnitt avledet fra prostata kreft celler med økt uttrykk av TIMP-1 skjerm økt mengde kafeer (figur 3-øvre og midtre paneler). De kafeer ble oppdaget ved hjelp av anti-alpha-glatt muskel aktin (SMA) antistoff, som rutinemessig brukes til å markere kafeer [40-42]. Det har vært godt etablert som kafeer spiller viktige roller i å fremme kreft progresjon og formidling terapeutisk motstand [43,44] og at kafeer er assosiert med økt risiko for tumorinvasjon og metastase [45-47].
Svulsten seksjonene ble avledet fra PC3 /22RV1-kontrollceller og PC3 /22RV1-TIMP-1 celler. Seksjonene ble farget med H E (AD) for å avsløre tumorhistologi, med anti-alfa glatt muskel aktin (anti-SMA, R 0,05
For å bekrefte effekten av TIMP-1 på kafeer, utførte vi tilsvar IHC analyser på tumor seksjoner avledet fra
in vivo studier av
HCT116 coloncancere, med eller uten økt ekspresjon av TIMP-1. Vi har funnet at sammenlignet med tumorer avledet fra HCT116-kontrollceller (figur S2A-C), økt ekspresjon av TIMP-1 (HCT116-TIMP-1) fremmer ansamling av kolon kafeer innenfor tumorer (figur S2D-F). Sammen utgjør disse resultatene gir støtte først for en ny rolle av TIMP-1 i regulering av CAF infiltrering og /eller ekspansjon.
TIMP-1 fremmer prostata CAF celleproliferasjon og migrasjon og aktiverer ERK1 /2 kinaser
For å avsløre den cellulære mekanismen som TIMP-1 fremmer CAF akkumulering og kreft progresjon
in vivo
, vi først vurderes virkningene av det kondisjonerte media (CM) avledet fra 22RV1-kontroll og 22RV1-TIMP-1-celler på prostata CAF proliferasjon og migrasjon. Vi fant at den CM avledet fra 22RV1-TIMP-1-celler mer effektivt fremmet prostatakreft proliferasjon og migrering transwell i forhold til den CM avledet fra 22RV1-kontrollceller (figur S3). For ytterligere å avgjøre om renset TIMP-1 kan utøve tilsvarende effekt på prostata kafeer, utførte vi flere eksperimenter med renset humant TIMP-1. Vi fant at TIMP-1 i betydelig grad fremmet proliferasjon av prostata CAF, men ikke den av prostatakreftceller (figur 6 AC), og at TIMP-1 betydelig forbedret bevegelighet av disse kafeer (figur 6D), noe som tyder på at TIMP-1-mediert akkumulering av prostata kafeer er trolig et resultat av både økt infiltrasjon og utvidelse av prostata kafeer innen svulster.
A-C. Prostata kafeer eller prostata kreft-celler ble sådd ut ved 2 x 10
3 celler /brønn i 96-brønners plater i triplikat. Prostatakreft celle og prostata CAF spredning ble utført hver dag ved hjelp av et sett med 96-brønners plater ved hjelp Premiks WST1 kit (Takara) etter produsentens anvisninger.
*
p
0,05. D. Prostata kafeer ble undersøkt for sin bevegelighet på tvers av transwell barriere i løpet av 30 timer i nærvær eller fravær av 250 ng /ml av TIMP-1. 0,5 x 10
6 celler /ml prostata kafeer ble plassert i forkamrene av Transwell inserts (Costar) i tre paralleller. Representative bilder av prostata CAF celler migrert gjennom transwell inserts vises. Prostata kafeer migrerte gjennom Transwell inserts i 20 tilfeldig valgte 200 x mikroskopiske felt ble talt opp.
*
p
0,05. A-D viser resultatene representative middel +/- SDS av triplikater i en av to uavhengige eksperimenter.
For ytterligere å bekrefte TIMP-1 effekt på prostata kafeer, vi slått ned TIMP-1 uttrykk i prostata kafeer (figur 7A) med to forskjellige shRNAs (Open Biosystems). Vi fant at TIMP-1-knockdown inhiberer prostata CAF proliferasjon og migrering signifikant (figur 7B-C), noe som tyder på at TIMP-1 spiller en viktig rolle i regulering av CAF-atferd, som i sin tur modulerer progresjon av kreft. Denne oppfatningen ble også støttet av våre funn at prostata kafeer men ikke prostatakreftceller uttrykker et høyere nivå av TIMP-1 reseptoren, tetraspanin CD63. CD63 er et glykosylert membranprotein som viser heterogene molekylvekt (figur 8A). TIMP-1 ble funnet å aktivere pro-overlevelse signalering ved binding til CD63 /integrin beta 1- kompleks i bryst epitelceller [49,50]. Vi fant ut at TIMP-1 øker ERK1 /2 aktivitet av serum sultet prostata kafeer men ikke prostatakreftceller (Figur 8B-C), noe som tyder på at
in vivo
effekter av TIMP-1 på prostatakreftceller kan være utøves gjennom å påvirke prostata kafeer indirekte (figur 9).
A. Relative nivåer av TIMP-1 i prostata kafeer infisert med ikke-målsøkende shRNAs eller shRNAs mot TIMP-1 ble undersøkt ved hjelp av ELISA og resultatene viste at to TIMP-1 shRNAs slås ned TIMP-1-ekspresjon ved ~ 70% og ~ 50%, henholdsvis. B. Prostata kafeer ble sådd ut ved 4 x 10
3 celler /brønn i 96-brønners plater i triplikat og prostata CAF proliferasjonsanalyser ble utført hver dag ved hjelp av et sett av 96-brønners plater ved bruk av Premiks WST1 sett (Takara).
*
p
0,05. C. Prostata kafeer ble undersøkt for sin bevegelighet på tvers av transwell barriere i løpet av 30 timer i nærvær eller fravær av 250 ng /ml av TIMP-1. 1 x 10
6 celler /ml prostata kafeer ble plassert i forkamrene av Transwell inserts (Costar) i tre paralleller. Prostata kafeer migrert gjennom transwell i 20 tilfeldig valgte 200 x mikroskopiske felt ble talt opp.
*
p
0,05.
A. Ekspresjon av CD63-protein i forskjellige humane prostatacancercellelinjer, humane prostata-fibroblaster (HPrF), og humane prostata kafeer (PCAFs) ble bestemt ved Western-blotting ved anvendelse av anti-CD63-antistoff, som gjenkjenner heterogen glykosylert CD63 protein. Aktin ble anvendt som en kontroll for protein lasting (nedre panel). B-C. Serum-sultet prostata CAF-celler (B) og 22RV1 prostatakreftceller (C) ble tilført med serumfritt medium (SFM), eller SFM inneholdende 250 ng /ml av TIMP-1 til 3 og 12 timer. Cellene ble lysert og proteinene ble analysert ved Western blotting ved anvendelse av anti-fosfo-ERK1 /2 eller anti-fosfo-AKT antistoffer (øvre panel), eller anti-ERK1 /2 eller anti-antistoffer (AKT bunn paneler).
: Økt ekspresjon av TIMP-1 av tumorceller og kafeer fører til økt CAF proliferasjon og migrering gjennom binding av TIMP-1 i TIMP-1-reseptoren, uttrykt CD63 på kafeer, noe som fører til opphopning av kafeer innenfor kreft vev.
