Abstract
Bakgrunn
Gjennom negativ regulering av genekspresjon, microRNAs (mirnas) kan fungere i kreft som oncosuppressors, og de kan vise endret uttrykk i ulike krefttyper. Her har vi undersøkt medulloblastoma svulster (MBS), som oppstår fra en tidlig svekkelse av utviklingsprosesser i lillehjernen, der Notch signalering er involvert i mange celle-skjebne bestemmende trinn. MBs oppstå bimodally, med topp forekomst sett mellom 3-4 år og 8-9 år, men det kan også forekomme hos voksne. Hakk regulerer et delsett av MB celler som har stamcelle-lignende egenskaper og kan fremme tumorvekst. På grunnlag av dette bevis, hypotese vi at mirnas rettet mot Notch veien kan reguleres disse fenomenene, og kan brukes i kreftterapi.
Metodikk /hovedfunnene
I en screening av MB cellelinjer, ble miRNA MIR-199B-5p ses å være en regulator av Notch vei gjennom sin målretting av transkripsjonsfaktoren HES1. Nedregulering av ekspresjon av HES1 MIR-199B-5p negativt regulerer formeringshastigheten og forankrings-uavhengig vekst av celler MB. MiR-199B-5p over-uttrykk blokker uttrykk for flere kreftstamcelle gener, svekker engrafting potensialet MB celler i lillehjernen av atymiske /naken mus, og av spesiell interesse, reduserer MB stamcelleliknende (CD133 +) subpopulasjon av celler. I vår analyse av 61 pasienter med MB, uttrykket av MIR-199B-5p i de ikke-metastatisk tilfeller var betydelig høyere enn i de metastatiske tilfeller (P = 0,001). Korrelasjon med overlevelse for disse pasientene med høye nivåer av MIR-199B uttrykk viste en positiv trend å bedre total overlevelse enn for de lavt uttrykker pasienter. Disse dataene viser nedregulering av MIR-199B-5p metastatisk MBs foreslå en potensiell stillemekanisme gjennom epigenetiske eller genetiske endringer. Ved induksjon av de-metylering ved hjelp av 5-aza-deoxycytidine, senke MIR-199B-5p uttrykk ble sett i et panel av MB cellelinjer, støttet en epigenetisk mekanisme for regulering. Videre er to cellelinjer (Med8a og UW228) viste en betydelig oppregulering av MIR-199B-5p etter behandling. Infeksjon med MB-celler i en indusert xenograft-modell i mus lillehjernen og anvendelse av en adenovirus som bærer MIR-199B-5p indikere en klinisk fordel ved denne negative påvirkning av MIR-199B-5p på tumorvekst, og på den undergruppe av MB stem- cellelignende celler, noe som gir ytterligere bevis på konseptet.
Konklusjon /Betydning
til tross for fremskritt i vår forståelse av patogenesen av MB, en tredjedel av disse pasientene er fortsatt uhelbredelig og nåværende behandlinger kan signifikant skade langtidsoverlevende. Her viser vi at Mir-199B-5p uttrykk korrelerer med spredning spredning, identifisere en ny molekylær markør for en dårlig risikoklasse hos pasienter med MB. Vi viser videre at i en xenograft-modell, kan MB tumorbyrde reduseres, noe som indikerer at bruken av miR199b-5p som en hjelpeterapi etter kirurgi, i kombinasjon med stråling og kjemoterapi, for forbedring av anti-kreft MB terapi og pasientens kvaliteten av liv. Til dags dato, er dette den første rapporten som uttrykk for en miRNA kan utarme tumor stamceller, noe som indikerer en interessant terapeutisk tilnærming for målretting av disse cellene i hjernesvulster
Citation. Garzia L, Andolfo jeg, Cusanelli E, Marino N, Petrosino G, De Martino D, et al. (2009) mikroRNA-199B-5p Svekker kreftstamceller gjennom Negative Regulering av HES1 i medulloblastoma. PLoS ONE 4 (3): e4998. doi: 10,1371 /journal.pone.0004998
Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Ordway Research Institute, USA
mottatt: 28 november 2008; Godkjent: 23 februar 2009; Publisert: 24 mars 2009
Copyright: © 2009 Garzia et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av FP6-EET rørledning LSH-CT-2006-037260 (MZ), FP7-Tumic HELSE-F2-2008-201662 (MZ), Associazione contro la lotta al Nevroblastom Italiana «Progetto Pensiero» (AI, MZ), AIRC bevilgning 2007 (MZ), Progetto AIRC Tumori Pediatrici 2008 (MZ). Associazione Åpne Nevroblastom (AI), en Scuola Europea di Medicina Molecolare (semm-CEINGE) Fellowship (EC), og AIRC-FIRC Fellowships (LG, NM). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs (mirnas) er single-strandet RNA av ~22 nukleotider i lengde, og de utgjør en ny klasse av genet regulatorer [1]. Hos dyr mirnas ha regulatoriske effekter gjennom sin binding til ufullkomne komplementære områder innenfor 3′-utranslaterte regioner (3’UTRs) av sine mRNA mål. Endret ekspresjon av mange mirnas er sett i flere tumortyper: f.eks B-cellelymfom (gruppert MIR-17) [2], [3], maligne lymfomer (MIR-15a, MIR-16-1, målretting BCL2) [4], glioblastom svulster (MIR-21up regulering) [5] , kolorektal neoplasi (MIR-143, MIR-145 nedregulert) [6], lungekreft (MIR-29) [7], og brystkreft (MIR-10b) [8], med langt flere krefttyper under analyse.
Her har vi fokusert på de mest vanlige ondartede hjernesvulster, Medulloblastomas (MBS). MB ser ut til å stamme fra stamceller og fra granule neuron forløpere i det ytre lag granulat av lillehjernen [9], eller alternativt, fra multipotente forløpere i ventrikulær sone av lillehjernen [10] – [12]. Fra et klinisk synspunkt, aktuelle multimodale behandlinger inkluderer radikal kirurgisk reseksjon etterfulgt av stråling og kjemoterapi. Selv om disse behandlingene kan forbedre overlevelse, forblir MB uhelbredelig i omtrent en tredjedel av disse pasientene. Den viktigste årsaken til død tilbakefall forbundet med svulst formidling, og da nåværende behandlingsalternativer har liten effekt [13]. Disse behandlingene er også giftig og kan føre til langvarige funksjonshemninger [14] – [16]. Følgelig er det et betydelig behov for nye, effektive, lave toksisitet terapi for barn med medulloblastoma.
MB-celler kan også inneholde funksjonelt viktige undergrupper av celler med stilk-lignende egenskaper som er unikt i stand til å forplante seg tumorvekst [17], [18]. Nyere studier har vist at både forfedre og stamceller kan svare på Sonic-Hedgehog (Shh) sti og kan tjene som celler av opprinnelse for MBs [19].
Notch aktivitet har vist seg å regulere granulat-celle stamfedre som MBs oppstår, med Notch2 genet kopiantall økte i 15% av MBs [12], [20]. Vedvarende uttrykk for
bHLH HES1
, rektor Notch-responsive genet, hindrer både migrasjon av nevrale stamceller ut av ventrikulære sonen og uttrykk for nevrale markører [21]. Mus som mangler
Hes1
viser tidlig neurogenesis, sett på som oppregulering av nevrale bHLH transkripsjonsfaktorer, noe som resulterer i store neural-tube defekter [22]; stamceller som stammer fra disse musene har svekket selvfornyende potensial, med en forpliktelse overfor en neuronal avstamning [23].
Betydelig, uttrykk for HES1 i MB har vært forbundet med dårligere klinisk resultat [24]. Av notatet, har et samspill med Shh i korncelle forløper utvikling postulert [25], som har cross-talk med andre veier, f.eks den polycomb gruppe genet
BMI-en product: [26].
Vår tilnærming startet med et søk etter mirnas (miRNA register) med mål gener som er involvert i Notch vei, og vi identifisert miR199b-5p som målgruppe HES1, Notch effektor. Vi viser at Mir-199B-5p uttrykk er tapt i metastatiske pasienter og postulere en mekanisme for regulering etter epigenetisk lyddemping gjennom metylering prosesser som skjer i løpet av kreftutvikling, identifisere en ny molekylær markør for en dårlig risikoklasse hos pasienter med MB. MiR199b-5p uttrykk svekker spesielt kreftstamcelle (CD133 +) befolkningen, noe som resulterer
in vivo
i nedskrivning av MB svulst utvikling i lillehjernen xenograft mus modell, og dermed gi bevis på konseptet. Som microRNAs har nylig vist seg å være nyttige verktøy for å slå kreft, de kan være i stand til å fylle dette gapet gjennom sin kontroll over flere målgener. Vi gir her bevis for bruk av miRNAs i klinikken, med vår anti-tumor terapi målretting av kreft stamceller av MIR-199B-5p.
Resultater
Hsa-MIR-199b- 5p stillhet HES1 uttrykk via 3’UTR bindende
in-silico
analyse av mirBase rettet mot databasen [27] var rettet mot identifisering av miRNAs potensielt rettet mot HES1, en effektor av Notch veien en grunnleggende mekanisme i regulering av celleproliferasjon MB. MiR-199B-5p og MIR-199A-5p var bedre scorings mirnas, og ble spådd å binde 3’UTR av menneskelig bHLH HES1. Vi fokuserte på MIR-199B-5p på grunn av sin evne til å redusere HES1 til uttrykk under forbigående over-uttrykk, sammenlignet med MIR-199A-5p (Tekst S1, fig. S1 A, B). MiR-199B-5p er tapt i lungesvulster [28] og det har blitt koblet til en genomisk region slettet i blærekreft [29]. MiR-199A * (også kjent som MIR-199A-5p, og med en identisk sekvens i Mir-199B-5p) blir også redusert i leverkreft [30] – [32]. Analysen av MIR-199B-5p ekspresjon i to MB cellelinjer, humant voksent vev og mus cerebellum, er vist i Text S1, fig. S1C, D og S2A, B.
For å finne ut om HES1 er et mål på MIR-199B-5p, den HES1 3’UTR ble klonet nedstrøms for en luciferasereportergenet vektor; pre-MIR-199B-5p ble også klonet i en pattedyr uttrykk vektor (se tekst S1). HEK-293-celler ble så transfektert med det relative luciferaseaktiviteten som viser at MIR-199B-5p ko-transfeksjon ble redusert reportergen aktivitet, og således indikerer binding med 3’UTR og destabilisering av produktiv translasjon av mRNA luciferase (Text S1, fig. S1E ). Som kontroller, HES1 3’UTR mutert i MIR-199B-5p-bindingssete ble ikke påvirket av MIR-199B-5p (Text S1, fig. S1E), og når en to-O»-metyl oligoribonukleotid (2-OM) komplementær til modne MIR-199B-5p ble co-transfektert, det motvirket effekten av MIR-199B-5p transfeksjon, gjenopprette reporter aktivitet (Tekst S1, fig. S1E). Lignende resultater ble oppnådd i Daoy MB celler (Tekst S1, Fig. S1F).
For å finne ut hvilken rolle MIR-199B-5p MB cellebiologi, ble Mir-199B-5p uttrykk konstruere transfektert inn Daoy celler, og flere stabile kloner over-uttrykker Mir-199B-5p ble valgt. Over utfoldelse ble bekreftet av real-time PCR (Tekst S1, Fig. S1G). Tre kloner vist redusert HES1 protein nivåer, hvorav den ene (199bSC1) viste ingen påviselig HES1. De 199bSC1 og 199bMC1 kloner ble valgt for videre undersøkelser (Tekst S1, Fig. S1H). Disse effektene av MIR-199B-5p på HES1 protein ekspresjon ble ikke begrenset til de stabile kloner eller Daoy celler, som D283MED celler transient transfektert med uttrykket konstruere for MIR-199B-5p viste også reduserte HES1 nivåer (Text S1, fig. S1B ).
for å styrke disse funnene ble 199bSC1 klone tilført med 2-OM antisens til Mir-199B-5p og brukt som en negativ kontroll (Tekst S1, fig. S1I). Her ble HES1 nivåer restaurert, noe som tyder 2-OM blokk med HES1 undertrykkelse av MIR-199B-5p, gir ytterligere bekreftelse på at Mir-199B-5p mål HES1 direkte. Andre potensielle mål av MIR-199B-5p ble også undersøkt på denne måten (Tekst S1, Fig. S2C, D).
Over-uttrykk for MIR-199B-5p reduserer celleproliferasjon og svekker klonogene potensialet MB cellelinjer
199bSC1 og 199bMC1 kloner hadde redusert spredning priser under standard kultur forhold, sammenlignet med kontrollgruppen klone. Derfor har vi sett etter potensielle celle-syklus endringer i disse kloner. FACS-analyse på den 199bSC1 klonen viste en 31% reduksjon i S-fasefraksjonene, og en økning i celler i G0-G1 på 15%, sammenlignet med den tomme vektoren klon (fig. 1A). Dette antydet som går ut fra cellesyklus har en rolle i den reduserte formeringshastigheten av den Daoy cellen 199bSC1 klon. I motsetning til dette ble det 199bMC1 klon ingen signifikante endringer i cellesyklusen. Vi mener at disse funnene for å være på grunn av en generell lavere effektivitet av 199bMC1 for å redusere HES1 proteinnivåer. Disse cellesyklus fenotyper oversatt til redusert spredning priser
in vitro
, som vurderes av
in vitro
spredning analyser som sammenligner 199bSC1 og 199bMC1 kloner med en tom-vektor klone og en forbigående transfektant for 2-OM designet mot Mir-199B-5p (fig. 1B). Både 199bMC1 og 1999SC1 klonene viste markert redusert spredning priser. Transfeksjon av denne anti 2-OM indusert en markert økning i spredning av stallen 199bSC1 klone, i samråd med restaurerte uttrykket nivåer av HES1. Disse resultatene på Daoy celleproliferasjon ble bekreftet også med D283 og ONS76 celler (Tekst S1, Fig. S2F). Virkningene av MIR-199B-spesifikke to-OM ble også bekreftet i villtype Daoy celler, hvor det potensielt virker på den endogene MIR-199B (Tekst S1, Fig. S2G).
A) Representant FACS analyse med propidium jod som viser en reduksjon i prosentandelen av celler i S-fasen, og en økning i G0-G1 for den stabile 199bSC1 klonen. Fraværet av skulder signaler med G0-G1 rød topp i 199bSC1 og 199bMC1 kloner utelukker apoptotiske prosesser. B) proliferasjonsanalyser ved 3-4,5-dimetyltiazol-2-yl-5-3-carboxymethoxyphenyl-2-4-sulfofenyl-2H-tetrazolium-salt (MTS), som viser redusert spredningshastigheter for stabil 199bSC1 klonen (røde trekanter) og den 199bMC1 klon (grønne kors), sammenlignet med stabil klon med tom vektor alene (blå diamant). Denne effekten av MIR-199B-5p over-uttrykk ble redusert med 2-OM transfeksjon (rosa firkanter). Dataene som vises, er middel ± SD fra to uavhengige forsøk, hvert utført i tre eksemplarer. C) Rapresentative mRNA uttrykk for differensiering (f.eks Mash1, MATH3 og NEUROGENIN 2) og spredning (f.eks c-MYC, cyclin D1) markører ved MIR-199B-5p over-uttrykk, som avslørt av real-time PCR, sammenligne stabil 199bSC1 og 199bMC1 kloner med tom vektor klone. D) Den stabile 199bSC1 klone for MIR-199B-5p viser nedsatt kolonidannelse i myke agar analyser. Plottet viser kolonier regnet som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter, hver utført i tre eksemplarer. E) Representative Western blot ved å bruke anti-c-myc og anti-cyklin D1 antistoffer viser disse to proteinene for å være nedregulert i den stabile 199bSC1 klon; se også densitometrisk analyse i panelet til høyre. F) Som for E, og viser GABRA6 og MATH3 proteiner oppregulert etter MIR-199B uttrykk, noe som tyder på induksjon av differensiering. Anti-Laminin-p-antistoffer ble brukt til å normalisert atom c-Myc og cyclin D1 proteinekspresjon. Anti-β-Actin antistoffer ble brukt til å normalisert cytoplasma GABRA6 og MATH3 proteiner uttrykk.
Virkningene av induksjon av MIR-199B-5p ble evaluert på molekylære markører for spredning og differensiering av en real- tid tilnærming. Som illustrert i fig. 1C, MAP2, som er mest uttrykt i modne nevroner [33], var oppregulert i stabile 199bSC1 og 199bMC1 kloner. Tilsvarende har Daoy celler blitt rapportert å uttrykke GFAP etter differensiering med phenylbutyrate [34], og i stallen 199bSC1 klone, ble GFAP nivåer økt. Totalt sett bildet av genuttrykk i vår stabil cellelinje over-uttrykker Mir-199B-5p er i samsvar med fenotype som har blitt sett i hjernen til
Hes1 – /-
mus [23]. Blant de andre gener, GABRA6, en markør for lillehjernen granule celledifferensiering, var også betydelig over uttrykt i stabile kloner (Fig. 1C).
En finjustert kaskade av positive og negative bHLH transkripsjonsfaktorer er sentralt for neurogenesis, med gener som
Mash1
,
MATH3 Hotell og
NGN2
indusere neurogenesis, og HES1-mutante mus som viser oppregulering av disse aktivator-type bHLHs [ ,,,0],35]. Begge MIR-199B-5p stabile kloner viste økning i uttrykk for pro-nevrale bHLH. Etter avtale med sin reduksjon i proliferasjonsrate ble sprednings markører c-myc og cyclin D1 redusert. Av de to kloner som ble analysert, 199bSC1 viste mer konsistent fenotype; vi forklare disse resultatene ved mer effektiv HES1 stanse i denne klonen.
Siden MIR-199B-5p stabil 199bSC1 klone viste en sterkere og mer konsekvent fenotype, vi neste undersøkt det i en standard klonogene analyse, for å fastslå enten forankringsuavhengig vekst ble påvirket av MIR-199B-5p. Her var det en 80% reduksjon av kolonidannelsen potensiale, sammenlignet med tom vektor klon (fig. 1D). Etter avtale med denne reduksjonen i proliferasjonsrate ble spredning markører c-myc og cyclin D1 redusert (Fig. 1E). Vi bekreftet også at proteinnivået som GABRA6 og MATH3 var oppregulert i 199bSC1 klone (Fig 1F.); det sistnevnte er kjent for å være direkte undertrykt av HES1 [35].
MiR-199B-5p tapper side populasjonen rommet i Daoy cellelinje, og negativt regulerer MB tumor stilk-cellepopulasjoner
den Notch veien har vært knyttet til den fraksjon av MB-tumorceller som havn forløper stilk-cellemarkører [36], og HES1 har en rolle i selv-fornyende av multipotente stamceller [23]. Denne side populasjon (SP) fra tumorceller har en rolle i den engrafting av en tumor i dyremodeller [37]. Vi undersøkte derfor påvirkning av MIR-199B-5p på befolkningen av kreftceller som utelukker Hoechst 33342 fargestoff, en strategi for å identifisere disse SP celler. Dette ble bestemt ved flow-cytometri i Daoy cellelinje, SP som utgjør opp til 4,9% av cellene, sammenlignet med verapamil-behandlede celler (negativ kontroll) (Text S1, fig. S3A, B). Denne verapamil behandling var basert på verapamil hemming av ione-pumper ansvarlig for Hoechst 33342 fargestoff utelukkelse, og dermed gjør SP-cellene til å bli sett [38]. Farging av 199bSC1 og 199bMC1 celler indikerte at SP ble ablated, som det var nær ingen forskjeller mellom Hoechst behandlede prøven og Hoechst pluss verapamil prøver (Tekst S1, Fig. S3C-F).
Det er også kjent at sentralnervesystemet tumor stamceller uttrykker CD133 antigen, og at disse celler er unikt i stand til tumordannelse i NOD-SCID-mus [18], [39]. I tillegg har hakk pathway en sentral rolle i den selvpolerende prosess, med dens inhibering fører til uttømming av CD133-positive (CD133 +) Daoy celler via induksjon av apoptose av progenitor-lignende celler [36]. Nylig ble det vist at CD133 + Daoy celler fremme tumorvekst i flanken av nakne mus, mens CD133- cellene ikke [40]. Av disse grunner, evaluerte vi den CD133 positivitet av Daoy celler sammenlignet med de stabile 199bSC1 og 199bMC1 kloner (fig. 2). Her blir villtypeceller var 14,8% CD133 +, mens de stabile 199bSC1 og 199bMC1 kloner dette ble redusert til 2,4% og 6,5% CD133 +, henholdsvis (fig. 2C-F). Dette demonstrerte således en rolle for MIR-199B-5p negativ regulering av denne fraksjon av tumorcellene initiere.
A-F) Representative FACS analyser av den stabile 199bSC1 (D) og (F) 199bMC1 kloner viste en reduksjon i prosentandelen av celler som var positive for stamcelle markør CD133 (B); A, C og E er negative kontroller (ingen antistoff).
HES1 over-uttrykk redder Mir-199B-5p klone fenotype
For å bekrefte at den cellulære fenotype er direkte korrelert med nedregulering av HES1, utførte vi
in vitro
celle-redningsforsøk. Vi valgte å redde mer konsistent fenotype, vist ved den stabile 199bSC1 klonen. Når full-lengde HES1 cDNA ble klonet og transfektert inn i stallen Daoy-celle 199bSC1 klone, ble HES1 uttrykk restaurert, som vurderes av immunoblotting (Fig. 3A). Vi har også bemerket re-uttrykk for cyclin D1, som ble nedregulert i stallen 199bSC1 klone. Restaurert HES1 uttrykk også reverseres effekten av MIR-199B-5p på celleproliferasjon (Fig. 3B). På samme tid, er transfeksjon av HES1 cDNA inn i 199bSC1 klon redusert induksjon av pro-nevrale bHLHs og differensieringsmarkører, og økte nivåer av sprednings gener (fig. 3C). Videre er forbigående transfeksjon av cDNA HES1 inn i stallen 199bSC1 klon ført til en økning i prosentandelen av celler i S-fasen, og en fjernelse av blokken i G0-G1 fase (Fig. 3D). Dette var motsatt av virkningene sett i stabil 199bSC1 klon over-uttrykker MIR-199B-5p (se fig. 1C og fig. 3C). Effekten av gjen ekspresjon av HES1 på SP av det stabile 199bSC1 klonen ble også evaluert. Når HES1 transfekterte celler (GFP positiv) ble evaluert for deres evne til å utelukke Hoechst fargestoff, viste de en minimal økning i SP, på opp til 1,3%. Selv om høyere enn det som ble målt for de stabile kloner 199B (Fig. 3E-H), dette var fortsatt under nivået av SP-celler for villtype-celler (Text S1, fig. S3). Dette er sannsynligvis på grunn av den korte tid for re-ekspresjon av HES1 etter transient transfeksjon, som kanskje ikke være nok til å tillate fullstendig fenotype redning. Vi prøvde å redde påvirkningen på CD133 rommet; men det gjorde transient transfeksjon av HES1 i 199bSC1 klone ikke resultere i en betydelig økning i CD133 + celler. Vi tror at dette er på grunn av den korte transient transfeksjon tid, som ikke tillater en re-organisering av Daoy celle hierarki.
A) Representant Western blot og densitometrisk analyse som viser at rednings av HES1 uttrykk ved over- uttrykk for HES1 cDNA i stallen 199bSC1 klone gjenoppretter cyclin D1 uttrykk. B) proliferasjonsanalyse av 3-4,5-dimetyltiazol-2-yl-5-3-carboxymethoxyphenyl-2-4-sulfofenyl-2H-tetrazolium-salt (MTS) som viser øket formeringshastigheten av den stabile 199bSC1 klone med HES1 uttrykket (mørk blå firkanter), sammenlignet med den stabile 199bSC1 klone alene (lyseblå diamanter). Dataene som vises, er middel ± SD fra to uavhengige forsøk, hvert utført i tre eksemplarer. C) Rapresentative mRNA uttrykk for differensiering (f.eks Mash1, MATH3 og NEUROGENIN 2) og spredning (f.eks c-MYC, cyclin D1) markører ved celle-redning med HES1 i stallen 199bSC1 klone, sammenligne med vill-type celler, som avslørt av real-time PCR. Uttrykket av GABRA 6 og MAP2 er nedregulert i rednings forsøket. D) Representative FACS-analyse av den HES1-uttrykkende stabil 199bSC1 klon viser en økning av fraksjonen av celler i S-fasen, og en reduksjon i G1, med hensyn til stabil 199bSC1 klon alene. E-H) Effekten av MIR-199B-5p uttrykk på SP av Daoy celler reverseres ved HES1 re-uttrykk. 199bSC1 stabil klon ble transfektert med cDNA HES1 og et GFP-kodende plasmid, behandles deretter etter 48 timer med Hoechst og verapamil (E-F) eller Hoechst alene (G-H) og analysert ved FACS. GFP-positive celler (P5 gate), panel E og G, ble analysert for tilstedeværelse av fargestoff eksklusiv-celler (F-H, P6 gate). De utransfekterte GFP negative celler (P3 gate), ikke ble analised.
Tumorvekst er redusert i xenografter avledet fra stallen 199SC1 klone
Funnene her indikerte at MIR-199b- 5 p er en potensiell inhibitor av tumordannelse. Derfor, for å undersøke hvilken rolle MIR-199B-5p i en
in vivo
tumormodell, stabilisert vi 199bSC1 og kontrollere Daoy kloner med et uttrykk vektor som bærer luciferase cDNA. De oppnådde kloner ble testet for luciferase uttrykk nivåer og også validert for oppbevaring av foreldre fenotype, i form av både HES1 og MIR-199B-5p uttrykk (se tekst S1, Fig. S4A-D). Disse stabile 199B-Luc1 og Ctl-Luc-4 Daoy kloner ble deretter injisert i den venstre og høyre flanker, henholdsvis av fem atymiske nakne /nakne mus. Tumorvekst ble evaluert av ukentlig
in vivo
bioluminesens imaging (BLI) injisert mus. På åtte uker, alle musene viste synlige massene i hvert kontroll flanke, mens bare tre flankene injisert med 199B-Luc1 viste svulst engrafting. Totalt sett en signifikant forskjell i tumorvolum mellom kontroll flankene og MIR-199B-5p flankene ble sett (fig. 4A). Bioluminescence Målingene viste betydelige reduksjoner i utslipp for Mir-199B-5p sider under tumorvekst sammenlignet med kontroll sider (f.eks mus # 4, Fig. 4B). Etter ni uker, viste fire av de fem mus statistisk signifikante forskjeller i disse Bioluminescens signaler mellom styrings sider og MIR-199B-5p benke sider (fig. 4C). Samlet utgjør disse dataene viser at Mir-199B-5p kan svekke svulstdannelse
in vivo
i atymiske nakne /nakne mus. De xenografttumorer fra mus # 5 og mus # 4 ble eksplantert og analysert for MIR-199B-5p og HES1 uttrykk og evaluert histopathologically (Tekst S1, Fig. S4E-H).
A) Xenotransplantat eksperiment i løpet av ni uker, etter sc injeksjon av fem mus med kontroll Daoy celler (CTR side) og Daoy celler over-uttrykker Mir-199B-5p (199B side). Med CTR celler, svulster var påvisbare makroskopisk i 5/5 mus; med over-uttrykkende celler, i 3/5 mus. Totalt tumor volum forskjell mellom CTR og 199B injisert sider etter ni uker med vekst var statistisk signifikant, som indikert (gjennomsnitt ± SD). B) Photon utslipp av mus som nr 4 etter ni uker med tumorvekst. Den 199B side (199bLuc-1) hadde en gjennomgående lavere foton emisjon enn kontroll side (Ctl-Luc-4). De sammenligninger av tumor dimensjoner er også vist. C) Når foton emisjon (se B) ble omdannet til celle nummer, en av fem mus viste ingen signifikante forskjeller (betyr ± SD) (to tailed uparet
t
test). D) Photon utslipp av 3 mus injisert i fjerde ventrikkel med henholdsvis: 199bLuc-en, Ctrl-Luc-4 infisert med mock AdV5, og Ctrl-Luc-4 infisert med en MIR-199B-5p AdV5. E) Hele hjernen av dyr og injeksjonsstedet (hvit pil). Hematoxylin /eosin farging av lillehjernen; svart pil, åsted for initiering av tumorigenesis. F) BLI av injiserte mus som for D, etter en måned av tumorvekst. Forskjellene mellom gruppene er statistisk signifikante. G) BLI to valgte mus som viser utvikling av tumorbyrde med Ctrl-Luc4-AdV5-Mock # 7, og reduksjon med Ctrl-Luc4-AdV5-199b # 3 over tid (0-8 uker). H) Hematoxylin-eosin farging av cerebellum fra AdV5-Mock # 2 og AdV5-199b # 3 dyr på 10 uker etter orthotopic injeksjon, viser svulster celler som omgir ytre kornet lag og innenfor IV ventrikkel (hvit stjerne). I blå, DAPY flekker, sammen med GFP deteksjon. Forstørrelse som angitt.
For ytterligere å undersøke muligheten av MIR-199B-5p å regulere MB vekst, vi injisert 199bSC1 stabil klone orthotopically inn i fjerde ventrikkel av nakne mus ved 5 ukers alder (Fig . 4D, E). Etter fire ukers
in vivo
ikke-invasiv tumorvekst overvåkning av BLI, i mus injisert med 199bSC1 klone tumorveksten var betydelig lavere enn det som ble observert i kontrollgruppen (CTL)-cellene injiseres side. Som en ytterligere bekreftelse på disse effektene, vi også injisert CTL celler infisert med et adenovirus som koder for MIR-199B-5p: i overensstemmelse med tidligere funn, disse musene viste også redusert BLI etter 4 uker (Fig 4F.). Ytterligere BLI kjøp etter 8 uker fra implantering av cellene er vist i figur 4G. På dette tidspunkt ble to mus avlivet og ytterligere analysert for histopatologi. Hematoxylin-eosin farging av frosne vev viste tumormasse i lillehjernen av AdV5-Mock # 2 og AdV5-199b # 3 injisert dyr. Seriell Parallell frosne histologiske snitt ble undersøkt ved fluorescens-mikroskopi for endogen grønn fluorescens protein (GFP) uttrykt av adenovirus-infiserte celler. Deretter evalueres vi HES1 protein uttrykk ved immunhistokjemi farging av andre parafininnstøpte vev, ved hjelp av en anti-HES1 antistoff. Total, vurderte vi nivåene av persistens av adenovirus ekspresjon i infiserte celler, som nedregulering av HES1 ekspresjon på grunn av miR199b bærer adenovirus ekspresjonen, og dermed følgende tumorvekst over tid av BLI se figur 4 G-H, og antistoffer farging fig S4L -M (Hes1, Ki67, Gabra6, nestin, Math-3, se detaljer i tekst S1 informasjon). Deretter to ekstra naken mus (AdV5-Mock # 7; AdV5-199b # 5) gjennomgikk PET-CT-studier ved 12 uker etter injeksjon, for å vurdere svulst proliferativ aktivitet (Fig. 5A, B). Tilleggs BLI data sammen med to filmer (Movie S1 og Movie S2) som viser 3D rekonstruksjon av orthotopic engraftment er beskrevet i tekst S1 informasjon og viste i figur S6. Disse analysene viste signifikant reduksjon av tumormasse i AdV5-199b # 5 dyr, sammenlignet med de AdV5-Mock # 7 kontrollmus, med PET-CT-analyser også gi tumorvolumer (0,024 cm
3 versus 0,044 cm
3), slik det er beskrevet i tekst S1. Samlet er disse dataene indikerer en gunstig effekt av over-uttrykk for miR199b-5p, som en negativ regulator av tumorvekst av MB celler i denne orthotopic xenograft nude-mus modell.
PET-CT-fusion bilder av AdV5- mock # 7 (A) og AdV5-199b # 5 (B) mus 12 uker etter kirurgi og injeksjon, med 3D volumgjengivelse og samtidig visning av områder av FLT opptak (blå-grønne, hvite piler). Et bredere bein defekt i bakhode-parietal del av skallen er tydelig i AdV5-Mock # 7 mus. Under:. Tabell over målinger (cm
3) av tumormasse foretatt med PET-CT oppkjøp (som beskrevet i tekst S1)
Uttrykk av MIR-199B-5p i humane medulloblastoma svulster
for å finne ut om MIR-199B-5p effektivt uttrykt i sunn menneskelig pediatrisk cerebella, brukte vi 13 kontrollprøver hentet fra NICHD Brain og Tissue Bank for Developmental Disorders, ved University of Maryland, USA. Vi målte MIR-199B-5p uttrykk, sammenligner fem lillehjernen prøver tatt 0-1 år gamle barn med seks 13-16-år gamle barn (Fig. 6A). MiR-199B-5p viste større uttrykk i explants fra de yngre friske kontroller (Mann-Whitney test,
P
= 0,006).
A) Box-plot av uttrykk nivåer av speil 199B-5p sunt menneske cerebella i de to aldersspredningen er angitt. MiR-199B-5p viste høyere uttrykk i explants fra yngre kontroller (Mann-Whitney test,
P
= 0,006). B) MiR-199B-5p sterkt uttrykker tilfeller er det meste M0
P
= 0,001 (Pearson Chi-Square test). C) Kaplan-Meier overlevelses estimatene sammenligne pasienter med lave
versus
høy (i forhold til median) nivåer av MIR-199B-5p uttrykk (45 pasienter med tilgjengelige oppfølgingsdata). D) MiR-199B-5p-ekspresjon ved sanntids-PCR i et panel på fem MB cellelinjer ubehandlet eller behandlet med 5-Aza-C (DAC – /+); Som vist på fig.
