Abstract
Vedvarende virus blir holdt i sjakk av spesifikke lymfocytter. De klonale T-cellereseptoren (TCR) repertoar mot Epstein-Barr-virus (EBV), når etablert etter primær infeksjon, viser en robust stabilitet over tid. Men determinanter som bidrar til dette langsiktig utholdenhet er fortsatt dårlig karakterisert. Å dra nytte av en
in vivo
klinisk setting hvor lymfocytt homeostase ble forbigående opprørt, vi studerte EBV antigen-spesifikke CD8 T-celler før og etter ikke-myeloablativ Lympho nedbrytende kjemoterapi av melanom pasienter. Til tross for mer avansert T celledifferensiering, pasienter T-celler viste klonal sammensetning sammenlignbar med friske personer, dele en preferanse for
TRBV20 Hotell og
TRBV29
gensegment bruk og flere co-dominant offentlige TCR clonotypes. Videre er våre data viste tilstedeværelsen av relativt få dominerende EBV-antigen-spesifikke T-celle clonotypes, som for det meste vedvarte etter transient Lympho-uttømming (TLD) og lymfocytt-gjenvinning, sannsynligvis relatert til fraværet av EBV reaktivering og
de novo
T-celle priming hos disse pasientene. Interessant, vedvarende clonotypes ofte co-uttrykt minne /homing-forbundet gener (
CD27
,
IL7R
,
EOMES, CD62L /SELL Hotell og
CCR5
) støtter forestillingen om at de er spesielt viktig for langvarige CD8 T-celle responser. Ikke desto mindre ble det klonal sammensetningen av EBV-spesifikke CD8 T-celler bevart over tid med tilstedeværelse av de samme dominerende clonotypes etter ikke-myeloablativ kjemoterapi. Den observerte clonotype utholdenhet demonstrerer høy robusthet CD8 T-celle homeostase og tilberedning
Citation. Iancu EM, Gannon PO, Laurent J, Gupta B, Romero P, Michielin O et al. (2013) Persistence of EBV Antigen-spesifikke CD8 T-Cell Clonotypes under homeostatiske immun Tilberedning hos kreftpasienter. PLoS ONE 8 (10): e78686. doi: 10,1371 /journal.pone.0078686
Redaktør: Derya Unutmaz, New York University, USA
mottatt: 1 august 2013; Godkjent: 15 september 2013; Publisert: 25 oktober 2013
Copyright: © 2013 Iancu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble sponset og støttet av den sveitsiske National Center of Competence i forskning (NCCR) Molecular Oncology og den sveitsiske National Science Foundation bevilger 32003B0-118123 og 310030-129670. P. O. Gannon er også mottaker av et fellesskap fra den kanadiske Institutes of Health Research (CIHR-IRSC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Primær Epstein-Barr virus (EBV) infeksjon er assosiert med massive virusreplikasjon. Til tross for genereringen av en sterk T-celle spesifikk immunrespons, EBV etablerer en latent infeksjon i B-celler [1]. Likevel sunne EBV-infiserte individer forblir asymptomatiske hele sitt liv på grunn av virus oppdemning av antigen-spesifikke minne CD8 T-lymfocytter [1-3]. Som økende oppmerksomhet er viet til å optimalisere terapeutiske vaksinestrategier mot kreft, representerer immun kontroll av kronisk EBV infeksjon en interessant modellsystem for å studere mekanismene som er involvert i produksjon og vedlikehold av livslang beskyttende immunresponser.
antigen-primet CD8 T-celle-basseng er meget heterogent og består av T-celle-subpopulasjoner med varierende grad av cellulær differensiering basert på deres fenotype, funksjon og anatomiske stedet, og dermed gjøre forskjell mellom «effektor» og «minne» cytolytiske T-celler utfordret [4- 6]. Vanligvis minne-T-celler som viser langvarig overlevelse og selvfornyelse egenskaper, høy proliferative potensial, og evnen til hurtig og effektivt produsere effektor-celler som respons på antigen gjen møte [7-9]. I motsetning til effektor-T-celler har evnen til å migrere til inflammasjonsstedet, for å drepe antigen-bærende målceller og utskiller forskjellige cytokiner (f.eks IFNy, TNFa) [10].
Enten minne celle responser opprettholdes for lengre perioder eller periodisk «fornyet» er fortsatt et spørsmål om debatt. Det er et spesielt vanskelig spørsmål å ta opp i mennesker, siden det krever inngående analyse av beskyttende immunresponser over lengre perioder. I denne forbindelse, T-cellereseptoren (TCR) er en utmerket markør som tillater antigen-spesifikke responser som skal følges langs T-celledifferensiering og over tid [11]. Grundige analyser av både virale og anti-tumor antigen-spesifikke CD8 T-celle-responser har vist at det antigen-spesifikke T-cellerepertoaret er generelt satt sammen av meget hyppig (også definert som dominant), så vel som mindre hyppig (definert som ikke-dominante) T-celle- clonotypes [12,13]. Gjennom en prosess kjent som TCR clonotype valg kan visse clonotypes bli mer dominerende langs T-celledifferensiering [14-16], eller gjennom hele tidsforløpet av infeksjon [17]. Persistens av humane virus-spesifikke T-celle clonotypes over flere år har blitt demonstrert på mennesker med forskjellige virale infeksjoner: influensa [18], herpes simplex virus [19,20], EBV [21], cytomegalovirus (CMV) [14] og human immunsviktvirus (HIV) [22]. Nylig Klarenbeek og kolleger [23] adressert spørsmålet om klonal repertoar som er etablert under den tidlige fasen av infeksjoner mot CMV og EBV opprettholdes over lengre perioder. De fant at immunresponsen var veldig stabil, og når etablert ikke utvikle seg i løpet av fem-års oppfølging [23]. Mens herpes virus-spesifikke T-celle responser avdekket en enestående stabilitet av TCR clonotype repertoar over tid etter primærinfeksjon, er mindre kjent om deres utholdenhet under vilkår av immunologisk stresset i asymptomatiske bærere.
I denne studien har vi undersøkte robusthet EBV antigen-spesifikke responser i en
in vivo
setting der balansen mellom virus og immunrespons kan bli midlertidig svekket etter forbigående Lympho-mangel (TLD). Nærmere bestemt, vurderte vi EBV-antigen-spesifikke CD8 T-celle-clonotype sammensetning og utholdenhet i melanomapasienter som ble behandlet med ikke-myeloablativ kjemoterapi, etterfulgt av adoptiv overføring celle (ACT) av autologe perifere blod mononukleære celler (PBMC) [24,25 ]. For å vurdere kvantitativt virus-spesifikke T-celle-responser, ble direkte
ex vivo
clonotypic analyser kombinert for å genekspresjon profilering av de enkelte antigen-spesifikke T-celler utførte [13]. Den anti-virus-T-celle responser hos pasienter var mer differensiert sammenlignet med friske personer, bestående av både minne og effektor CD8 T-celler. Dominerende TCR beta-kjeden clonotypes, inkludert flere offentlige TCR sekvenser, ble funnet å vedvare over tid hos friske individer og følge TLD og ACT blant pasientene. Vi studerte deretter T-celle clonotypes med varierende frekvenser følgende TLD og immun tilberedning, og observerte at clonotypes med økt frekvens gjennomført et flerfunksjonelt minne /homing genuttrykk profil (
CD27
,
IL7R
,
EOMES, CD62L /SELL Hotell og
CCR5
). Til sammen våre data tyder på at EBV-spesifikke T-celle repertoar vedvarer ikke bare under steady state, men også under forbigående immunologiske forstyrrelser.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
de kliniske studiene ble utformet og gjennomført i henhold til de relevante standarder, og godkjent av (i) den etiske kommisjonen ved University of Lausanne, (ii) LICR Protocol Review Committee, og (iii) den sveitsiske nasjonale reguleringsmyndighet (Swissmedic ). De har blitt registrert i NCI kliniske studier under nummeret NCT00324623 og EU20607 (www.clinicaltrials.gov). Alle blodprøver fra pasienter ble samlet inn ved skriftlig informert samtykke. Perifere blodprøver fra fire EBV-positive sunn givere BCI3, BCL4, BCL7 og BCL8, i alderen mellom 25 og 45 år, var samlet på to tidspunkter, i årene 2002 og 2006, og alle givere ga skriftlig informert samtykke.
melanompasienter og behandling
Blodprøver prøver~~POS=HEADCOMP fra fem EBV-positive melanom pasienter i alderen mellom 39 til 75 år, deltok i fase i kliniske studier ved Institutt for Oncology i Lausanne universitetssykehus (Sveits) , ble tatt ved forskjellige tidspunkter før og etter behandling. Etter samling av PBMC ved leukaferese (Leuka) fikk pasientene ikke-myeloablativ kjemoterapi bestående av enten busulfan på 2 mg /kg (pasienter LAU 618 og LAU 672) eller cyklofosfamid (CTX) på 30 mg /kg (LAU 1144 og første runde for LAU 1013) eller 60 mg /kg (LAU 936 og andre runde for LAU 1013) i to dager og fludarabin på 30 mg /m
2 for tre dager [24,25]. Tre dager etter den siste injeksjon med fludarabin, ble autologe PBMC reinfusert og peptid vaksinering med Melan-A-analoge peptid emulgert i ufullstendig Freunds «adjuvant ble gitt subkutant som tidligere beskrevet [24]. Pasient LAU 1144 fikk også en løselig LAG-3 protein som adjuvans.
antistoffnivåer mot EBV i melanomapasienter
Plasmaprøver ble tatt fra alle pasienter på flere tidspunkter før og etter Lympho nedbrytende behandling og analysert med hensyn på endringer i antistoffnivåer som er kjent for å være assosiert med en tilstand av EBV reaktive. Spesielt vi sammenlignet plasmaantistoffnivåer mot tre EBV uttrykte proteiner: EBNA-IgG (Epstein-Barr Nuclear Antigen), EA-IgG (tidlig Antigen), VCA-IgG og IgM (Viral kapsidantigen). EBV-spesifikke antistoffer ble analysert ved hjelp av Athena Multi-Lyte EBV testsystem (Zeus vitenskapelig, Sommerville, NJ, USA) på en Luminex 200 leser i henhold til produsentens instruksjoner. Resultatene ble uttrykt som vilkårlige enheter.
Cell fremstilling og flowcytometri
PBMC ble oppnådd ved tetthetssentrifugering ved hjelp av Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Uppsala, Sverige). CD8 T-lymfocytter ble positivt anriket fra cryopreserved PBMC ved bruk av anti-CD8-belagte magnetiske mikroperler (Miltenyi Biotech, Bergish Gladbach, Tyskland). PE-merkede HLA-A * 0201 /peptid-multimerer ble fremstilt som beskrevet tidligere [26] med HLA-A2 begrenset epitop GLCTLVAML (betegnet som A2 /GLC) avledet fra den EBV-proteinet lytisk BMFL1. Celler ble først farget med PE-merkede multimerer i 1 time ved romtemperatur (RT) i PBS, 0,2% BSA, 50 uM EDTA, og deretter med passende antistoffer (20 min ved 4 ° C). Cellene ble enten direkte analysert (LSR-II flowcytometer, BD Biosciences, San Diego, California) eller sortert i definerte populasjoner ved hjelp av en FACSVantage SE maskin (BD Biosciences). Følgende monoklonale Abs ble kjøpt fra BD Biosciences eller BD PharMingen; anti-CD28-FITC, anti-CD8-allofykocyanin /Cy7, anti-rotte-IgG CCR7 mAB, geit-anti-rotte-IgG-allofykocyanin, og CD3-AmCyan-A. Anti-CD45RA-PE-Texas Red mAb ble kjøpt fra Beckman Coulter (Marseille, Frankrike).
Generation av T-celle kloner og kultur
HLA-A2 /multimer
+ CD8
+ T-celle undergrupper ble definert som effektor-minne (EM) CCR7
-CD45RA
-CD28
+ (EM28
pos), CCR7
-CD45RA
-CD28
– (EM28
neg) og effektor CCR7
-CD45RA
+ CD28
– (Emra), og ble sortert ved flowcytometri direkte
ex vivo plakater (Figur S1) . Sorterte cellene ble klonet ved begrensende fortynning, og ekspanderes i RPMI 1640-medium supplementert med 8% humant serum (HS), 150 U /ml rekombinant humant IL-2 (rhIL-2, en gave fra GlaxoSmithKline), 1 mikrogram /ml fytohemagglutinin (PHA ; Sodiag, Losone, Sveits) og 1×10
6 /ml bestrålt allogene PBMC (3’000 rad) som mater celler. A2 /multimer
+ T-cellekloner ble ekspandert ved periodisk (hver 15. dag) restimulering i 24-brønners plater med PHA, bestrålte feeder-celler og hrIL-2.
Direkte ex vivo cellesortering, cDNA forsterkning og enkelt celle gen-spesifikke PCR
Enkle eller fem-celle prøver ble sortert direkte
ex vivo
fra T-celle undergrupper av interesse og cDNA-preparat og global cDNA-amplifisering utført som tidligere beskrevet [27,28]. Gene signatur av individuell T-celle ble identifisert ved gen-spesifikk PCR som beskrevet [28] og PCR-produkter visualisert etter elektroforese på en 2,5% agarosegel. Vi brukte følgende primere:
GAPDH
: 5′-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3 «; rev-5»-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3 «,
beta2 microglobulin
: 5′-CCAGCAGAGAATGGAAA GTC-3′; rev-5′-GATGCTGCTTACATGTCTCG-3 «,
CCR7
: 5′-CCAGGCCTTATCTCC AAGACC-3′; rev-5′-GCATGTCATCCCCACTCTG-3 «,
CD27
: 5′-ACGTGACAGAGTGCC TTTTCG-3′; rev-5′-TTTGCCCGTCTTGTAGCATG-3 «,
IL7R plakater (IL-7RA /CD127): 5′-ATC TTGGCCTGTGTGTTATGG-3′; rev-5′-ATTCTTCTAGTTGCTGAGGAAACG-3 «;
EOMES plakater (eomesodermin): 5′-AGCAGGCTGTGAACATTGG-3 «; rev-5»-TTGACTCCTGGG CCTAGTATC-3 «,
CCR5
: 5-TCAGCAGGAAGCAACGAAGG-3′; rev-5′-TCTTTGACTTG GCCCAGAGG-3 «,
KLRD1 plakater (CD94): 5′-GTGGGAGAATGGCTCTG CAC-3′; rev-5′-TGAGCTGTTGCTTACAGATATAACGA-3 «,
IFNg plakater (IFN): 5′-GCCAAC CTAAGCAAGATCCCA-3′; rev-5′-GGAAGCACCAGGCATGAAATC-3 «,
PRF1 plakater (perforin): 5′-TTCACTGCCACGGATGCCTAT-3′; rev-5′-GCGGAATTTTAGGTGGCCA-3 «,
GZMB plakater (granzyme B): 5′-GCAGGAAGATCGAAAGTGCGA-3′; rev-5′-GCATGCCAT TGTTTCGTCCAT-3 «,
SELL plakater (CD62L): 5′-CCGTCTGTGAATTGGACCAT-3′; REV-5′-AAC AGCAAAACCCCCAAACT-3 «.
TCR spectratyping, sekvensering og TCR clonotyping
TCR spectratyping [14] ble brukt til å identifisere alle TCR clonotypes, som ble klassifisert i henhold til de Immunogenetics (IMGT) nomenklatur foreslått av Lefranc og kolleger (http : //imgt.org/) [29]. For å raskt identifisere TRBV segment bruk, cDNA bassenger av EBV antigen-spesifikke CD8 T-celler ble først utsatt til individuelle PCR hjelp av et sett av tidligere validerte fluorescensmerkede fremover primere som er spesifikke for 22 TCR
BV: underfamilier og en umerket revers primer spesifikk for den konstante region av beta-kjeden til TCR [30]. Dette TRBV-CDR3 spectratyping analyse representerer en prescreening skritt som gjør at du sparer tid og reagenser (data ikke vist). Når positive TRBV underfamilier ble identifisert, individuell cDNA-prøvene ble generert fra enten
ex vivo
sorterte enkeltcelleprøver (n = 477) og 5-celleprøver (som representerer den tilsvarende 300-450 EBV-spesifikke CD8 T-celler per frisk donor eller melanom pasient) eller fra
in vitro
generert T-celle kloner (friske donorer, n = 530 kloner, melanom pasienter, n = 779 kloner) ble utsatt for TRBV-spesifikke PCR. Separasjon og deteksjon av amplifiserte PCR-fragmenter som inneholdt hele CDR3-segmentet ble utført i nærvær av fluorescerende størrelsesmarkører på en ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (AppliedBiosystems /Life Technologies Corporation, Zug, Sveits) og dataene ble analysert med Genescan 3.7.1 ( AppliedBiosystems). I det siste trinnet, ble PCR-produktene av interesse direkte renset og sekvensert med revers primer (Fasteris SA, Geneva, Switzerland). Flertallet av PCR produktene ble sekvensert, men for flere dominerende TCR clonotypes (n = 8 for HDS; n = 10 pasienter), unike primere som tilsvarer
CDR3
gensegment ble utformet og brukt for clonotyping PCRs som tidligere beskrevet [15]. Alle
ex vivo
enkelt celle, 5-celle, og
in vitro
generert T-celle klone cDNA prøver fra friske donorer og melanom pasienter ble behandlet i samme strenge tilnærming.
Statistiske analyser
Som antydet i teksten, ble Kruskal-Wallis ikke-parametrisk, enveis ANOVA og Spearmans korrelasjoner utføres med Prism 5.0 (La Jolla, California, USA) og
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Co-uttrykk kakediagrammer ble sammenlignet med hverandre ved hjelp 10’000 permutasjoner beregnet med programvaren SPICE 5,2 (NIH, Bethesda, USA).
Resultater
Forbedret effektor celle differensiering av EBV antigen-spesifikke CD8 T-celler etter forbigående Lympho-uttømming og immun tilberedning
Nye immunterapi studier har vist at Lympho-uttømming indusert av ikke-myeloablativ kjemoterapi begunstiget påfølgende utvidelse av adoptivt overført T-celler ved homeostatiske mekanismer ([31]; figur 1A). For ytterligere å avgrense denne strategien, hadde vi tidligere analysert effekten av tre ulike ikke-myeloablative conditioning kjemoterapiregimer på Lympho-uttømming og tilberedning i melanom pasienter [24,25]. De tre kjemoterapikurer indusert betydelig forbigående utarming av lymfocytter, etterfulgt av effektiv utvinning av totalt lymfocytt [24,25] og CD8 T-celler (figur 1B, venstre panel) teller til normalt nivå fire uker etter adoptiv celle overføring (post-ACT).
A. Skjematisk fremstilling av ikke-myeloablating Lympho nedbrytende behandling etterfulgt av ACT av PBMC for melanom pasienter. Blodprøver ble analysert for alle pasienter ved leukaferese tidspunkt (Leuka) før TLD kjemoterapi og post-ACT (time-punkt T1), som tilsvarte dag 32 (pasient LAU 1144), dag 45 (LAU 1013), eller dagen 60 (LAU 618, LAU 936 og LAU 672). B. Venstre panel; totaltellinger av CD8 T-celler fra fem melanom pasienter ved Leuka og post-ACT. Høyre panel; fenotype av totale CD8 T-celler som viser andelen av tidlig differensiert (EM28
pos; CCR7
negCD45RA
negCD28
pos) og sen differensiert (bestående av EM28
neg; CCR7
negCD45RA
negCD28
neg og Emra; CCR7
negCD45RA
posCD28
neg) undergrupper fra fire friske donorer (HDS) og fra fem melanom pasienter på Leuka og post-ACT. C. Venstre panel; totaltellinger av EBV-spesifikke CD8 T-celler i perifert blod fra fem melanom pasienter ved Leuka og post-ACT tidspunkter. Høyre panel; fenotype av EBV-spesifikke CD8 T-celler som viser andelen av tidlig differensiert (EM28
pos; CCR7
negCD45RA
negCD28
pos) og sen differensiert (bestående av EM28
neg; CCR7
negCD45RA
negCD28
neg og Emra; CCR7
negCD45RA
posCD28
neg) undergrupper fra fire friske donorer og fra fem melanom pasienter ved Leuka og post-ACT. D. EBV-spesifikke antistoffnivåer målt i plasmaprøver fra fem melanom pasienter på ulike tidspunkter før og etter Lympho reduserende behandling. Dag 0 på x-aksen representerer den dagen ACT. Resultatene er representert som vilkårlige enheter på en relativ skala indeks. Plasmanivå evolusjon er vist separat for hver anti-EBV-antistoff (anti-VCA IgM og IgG, anti-EBNA IgG og anti-EA IgG), og det grå feltet representerer cut-off mellom negativ og positiv status for hver markør.
Vi analyserte CD8 T-celler spesifikke for EBV lytisk protein BMFL1 fra fem pasienter med stadium IV melanom før og etter TLD (figur S1) og fra fire friske donorer. Den totale andelen av EBV antigen-spesifikke T-celler før og etter behandling forble uendret (figur 1C, venstre panel;
P
= 0,625, Kruskal-Wallis). Sammenlignet med friske individer, BMFL1 spesifikke CD8 T-celler fra melanom pasienter viste mer avansert effektor celledifferensiering med økte prosenter av EM28
neg (definert som CCR7
negCD45RA
negCD28
neg) og Emra ( definert som CCR7
negCD45RA
posCD28
neg) undergrupper allerede før behandling (dvs. på tidspunktet for leukaferese) (figur 1C, panel til høyre). Disse undergrupper økt ytterligere og ble dominerende post-ACT. Hos friske donorer, er slike avanserte effektor-celledifferensiering vanligvis ikke observert i løpet av EBV-spesifikke CD8 T-celler, som ligner mer tett til CMV-spesifikke T-celle-responser [14,32]. Til en svakere grad, ble avansert effektor celledifferensiering også observert i total CD8 T-celle basseng (figur 1B; panel til høyre), noe som tyder på at foregående historier av tumorprogresjon og fikk behandlinger, for eksempel cellegift og immunterapi, kan ha påvirket CD8 T cellerommet.
Transient Lympho-uttømming resulterer ikke i EBV reaktive
for å undersøke muligheten av EBV-antigen-spesifikke CD8 T-cellerespons for å styre viral aktivitet i løpet av situasjoner med redusert immun kontroll, vi fastslått hvorvidt ikke-myeloablativ kjemoterapi kan ha resultert i EBV reaktive. Plasmaantistoffnivåer for viralt kapsid-antigen (VCA) IgG og IgM, Epstein-Barr-atom antigen (EBNA) IgG, og tidlig antigen (EA) IgG ble målt før og etter TLD og ACT-behandlinger (figur 1D) [33]. EBV-spesifikke antistoffer var stabile i flere måneder etter behandling i alle pasienter. Dette er konsistent med en latent EBV-infeksjon uten reaktivering av virus, selv om sistnevnte ikke kan være helt utelukket. EBV DNA kopiere numre per million PBMC var under nivået for påvisning av real-time PCR reaksjon i blodprøver før og etter TLD (data ikke vist).
The ex vivo EBV antigen-spesifikke CD8 T-celle repertoar følgende transient Lympho-uttømming avslører clonotype utholdenhet til tross for frekvenssvingninger
Vi har tidligere utviklet en strategi for global cDNA forsterkning på 5-cellenivå egnet for direkte
ex vivo
vurdering av individuell TCR BV-CDR3beta (TRBV) gensegment bruk [14,34]. I korthet ble cDNA bassenger av EBV epitop-spesifikke CD8 T-celler ble opprinnelig generert og anvendt som en skjerm for tilbakevendende TRBV familier. Deretter ble dominans av hver TRBV familien bestemmes ved å teste hver enkelt 5-celleprøve, omfattende bassenget for de positive TRBV familier, og som representerer den tilsvarende 300 til 450 virus-spesifikke CD8 T-celler per individ. De forsterkede TRBV-CDR3-JB gensegmenter ble til slutt sekvensert eller PCR-clonotyped å identifisere den unike TCR signaturen til hver T-celle clonotype, som beskrevet i materialer og metoder. Ved hjelp av denne tilnærmingen, vi først sammen TCR clonotype repertoar av direkte
ex vivo
sortert fem-celle av EBV-spesifikke T-celler med at single T-celler som genereres av
in vitro
begrensende fortynning kulturer . Sammenlign andeler av individuell TCR clonotype signaturer ble funnet ved hjelp av
ex vivo
sortert fem-celle og
in vitro
T-celle klonings tilnærminger (Figur S2A), i samsvar med tidligere studier [14 , 15,28]. Videre, uavhengig av hverandre utførte
ex vivo
sortering eksperimenter på enkelt virus antigen-spesifikke T-celler, viste tilsvarende relative frekvensene av dominante T-celle clonotypes (fig S2B). Til sammen disse resultatene tyder på at vår direkte
ex vivo
tilnærmingen gjør den høyoppløselige molekylær karakterisering av clonotype repertoar
in vivo
i veldefinerte antigen-spesifikke undergruppene.
neste fastsatte utholdenhet av EBV BMFL1-spesifikke T-celle clonotypes i friske individer over tid. Flertallet av clonotypes var til stede på både tidlige og sene tidspunkter (Figur 2A). Videre en sammenheng viste en statistisk signifikant sammenheng mellom frekvensene av clonotypes oppdaget over en periode på 4 år (figur 2B; Rho = 0,739,
P
0,001, Spearmans korrelasjon). Vi kunne observere utseendet på nye clonotypes over tid, men disse nyoppdagede clonotypes var av lave frekvenser (
5%) (figur 2B). Sammen utgjør disse resultatene er i tråd med det som tidligere er rapportert av vår gruppe [14] og andre [23], og tyder på at når etablert hos friske voksne, den klonal sammensetning ved kronisk herpes virus infeksjon holdes stabilt i minst flere år.
A og C. TRBV clonotype sammensetning av EBV-spesifikke CD8 T-celler i PBMC fra to friske donorer (A) ved tidlig (2002) og sen (2006) tidspunkter, og i PBMCer fra fire melanompasienter ( C) ved Leuka tidspunktet, og post-ACT. Hver clonotype er representert ved sin spesifikke TRBV familie og sitt kodenummer (clono). Clonotype frekvenser beregnes ved tilstedeværelse av hver clonotypic sekvens mellom individuelle 5-celleprøver (friske givere, n = 142, melanom pasienter, n = 344), sortert direkte
ex
vivo
. Av notatet, frekvenser bare fra enten nye «øke» eller «fallende» clonotypes er avbildet. B og D. Korrelasjon av individuelle clonotype frekvenser hentet fra
ex
vivo
sortert fem-celleprøver (B) mellom blodprøver på tidlige (2002) og sen (2006) tidspunkter fra to friske donorer og (D) mellom Leuka og etter ACT fra fem melanomapasienter (Spearmans korrelasjon). Innfellinger viser sammenhengen mellom TCR clonotypes med frekvenser under 10% for friske donorer og 20% for pasientene.
Vi vurderte ytterligere EBV antigen-spesifikke TCR repertoar i fem melanom pasienter for å bestemme utvinningspotensialet dominerende T celle clonotypes følgende TLD og ACT (figur 2C). I likhet med de friske givere, generell TCR repertoar vedvarte etter TLD og ACT med det store flertallet av clonotypes være påviselig før og etter behandling (figur 2C). Med unntak av pasient LAU 936, de clonotypes at enten forsvant eller ble vist var av lav frekvens (mindre enn 5%), som kan være relatert til følsomheten av teknikken mer enn selve utseendet eller forsvinningen av en spesifikk clonotype. Likevel fant vi flere svingninger i frekvensene av påvise clonotypes blant pasienter sammenlignet med friske donorer, som var spesielt tydelig for de clonotypes med frekvenser 20% (figur 2D). Kollektivt, våre data viser at den klonale sammensetningen av EBV-spesifikke CD8 T-celler ble opprettholdt over hele verden i melanompasienter som gjennomgår TLD og etterfulgt av immun rekonstituering, til tross for fluktuasjoner i frekvenser innenfor bestemte pasienter og for clonotypes detekterbare ved lavere frekvenser.
EBV antigen-spesifikke clonotypes bærer offentlige TRBV sekvenser blir ofte delt mellom friske donorer og melanom pasienter
En stor likhet i EBV epitop spesifikke CD8 T-celler mellom friske voksne og pasienter var fortrinnsrett
in vivo
utvalg av dominerende clonotypes med TRBV kjeder som tilhører
TRBV14
,
TRBV20 Hotell og
TRBV29
familier (figur 2). Vi har også identifisert minst fjorten offentlige TRBV sekvenser, med to CDR3 motiver RDxTGNGY og VGxGGTNEKL, som ble overrepresentert og delt i friske individer og melanom pasienter (figur 3A). Offentlige clonotypes er definert ved tilstedeværelsen av den samme identiske TRBV-CDR3-BJ sekvens funnet i minst to ubeslektede individer. I tråd med tidligere rapporter [35], flere av de offentlige TRBV clonotypes identifisert i denne studien ble kodet av to eller tre forskjellige nukleotidsekvensvariasjoner. Når vi sammenlignet frekvensene av offentlige TRBV clonotypes innenfor de overordnede EBV-spesifikke CD8 T-celle responser, en tredjedel av dem representerte dominerende clonotypes (med frekvenser 5%) (figur 3B). Mellom 35 til 48% av EBV-antigen-spesifikke clonotypes ble funnet ved lave frekvenser (mellom 1 og 5%), mens omtrent en fjerdedel ble funnet bare én gang i friske donorer eller pasienter. Sammen våre data viste bevis for en høy grad av likhet i EBV BMFL1 spesifikke CD8 T-celler mellom melanom pasienter og friske personer, som illustrert ved (i) deling av hyppige offentlig TRBV sekvenser og (ii) utholdenhet av disse offentlige TRBV clonotypes med tid og følge TLD.
Å. Utarbeidelse av de 14 offentlige aminosyre TCR beta-domene-sekvenser oppdaget blant tre friske personer og fem melanom pasienter. Hver TCR p-kjede clonotype er beskrevet av TRBV segment, CDR3-beta-sekvensen, TRBJ segment, antall nukleotid-sekvens-varianter som er identifisert for hver aminosyre-sekvens, samt andelen av friske donorer og pasienter som hver sekvens ble identifisert. B. Fordelingen av fellessekvenser innenfor den samlede EBV-spesifikke CD8 T-celler i friske donorer og pasienter i henhold til deres relative frekvens; dominerende clonotypes (med frekvens 5%) er representert i svart, lav dominant (1-5%) i grå og unike sekvenser i hvitt.
Forbedret genuttrykk polyfunksjonalitet av individuell EBV antigen-spesifikke CD8 T-celler etter forbigående Lympho-uttømming og immun tilberedning
For ytterligere å undersøke effekten av TLD og ACT, preget vi utviklingen av EBV-epitop-spesifikke CD8 T-cellerespons hos pasienten LAU 1013 som gjennomgikk to suksessive sykluser med TLD og immun tilberedning (figur 4A), uten å vise tegn på EBV reaktivering (figur 1D). Frekvensen av EBV-spesifikke tidlige differensiert «minne-like» EM28
POS og sen differensiert EM28
neg /Emra CD8 T-celler var sammenlignbare mellom de to Leukaferese tidspunktene (Leuka I og Leuka II) ( Figur 4B). I tråd med de data som er vist i figur 1, observerte vi forbedret effektor-celledifferensiering av de EBV-spesifikke T-celler før (ved Leuka I) og følgende Lympho-uttømming (Leuka II), sammenlignet med virus-spesifikke T-celler fra friske donorer .
A. Tidsplan for behandlingsregimet for pasienten LAU 1013, som fikk to runder med TLD (avbildet som grå bokser). De grå piler indikerer leukaferese (Leuka jeg og Leuka II) og reinfusjon av PBMC, henholdsvis. Blodprøver ble tatt på dag 45 (post-Leuka I) og på dag 15/22 (post-Leuka II) etter reinfusjonen. B. Phenotype av EBV BMFL1 spesifikke CD8 T-celler (venstre panel) og total CD8 T-celler (panel til høyre) viser andelen av tidlig differensiert (EM28
pos; CCR7
negCD45RA
negCD28
pos) og sen differensiert (bestående av EM28
neg; CCR7
negCD45RA
negCD28
neg og Emra; CCR7
negCD45RA
posCD28
neg) undergrupper i PBMC hentet fra pasient LAU 1013 ved Leuka i (n = 2) og Leuka II (n = 3) tidspunkter. Feilfelt (gjennomsnitt +/- SD) representerer uavhengige eksperimentelle replikater. C. Direkte
ex
vivo
kumulative uttrykk for minne /homing knyttet gener (
CD62L /SELL
,
CCR5
,
IL7R
,
CD27 Hotell og
EOMES
) og effektor relaterte gener (
PRF1
,
KLRD1 /CD94
,
IFNg
og
GZMB
). Enkelt EBV-spesifikke CD8 T-celler ble sortert fra tidlig differensiert EM28
pos og sen differensiert Emra på Leuka I (n = 266) og Leuka II (n = 162) tidspunkter og behandlet for global cDNA forsterkning som beskrevet i materialer og metoder.
P
-verdier ble utført av enveis ANOVA test; ns, ikke signifikant.
