Abstract
Bakgrunn
Patologisk angiogenese spiller en avgjørende rolle i tumor aggressivitet og fører til ugunstig prognose. Målet med denne studien er å oppdage potensielle rolle Retinoblastoma bindende protein 2 (RBP2) i svulsten angiogenese av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC).
Metoder
Immunhistokjemisk farging var anvendt for å detektere ekspresjon av RBP2, hypoksi-induserbar faktor-1α (HIF-1α), vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og CD34. To par siRNA sekvenser og pcDNA3-HA-RBP2 ble brukt til å ned-regulere og up-regulere RBP2 uttrykk i H1975 og SK-MES-1 celler. En endotelceller tube-analysen, VEGF enzymbundet immunosorbent analyse, real-time PCR og Western blotting ble utført for å avdekke mulige mekanismer mediert av RBP2 i tumor angiogenese.
Resultater
Av 102 stadium I NSCLC prøvene analysert, høy RBP2 protein uttrykk er nært forbundet med tumorstørrelse (P = 0,030), høy HIF-1α uttrykk (P = 0,028), høy VEGF uttrykk (P = 0,048), økt tumor angiogenese (P = 0,033 ) og dårlig prognose (P = 0,037); høy MVD ble forbundet med høy HIF-1α uttrykk (P = 0,034), høy VEGF uttrykk (P = 0,001) og dårlig prognose (P = 0,040). Multivariat analyse indikerte at RBP2 hadde en uavhengig innflytelse på overlevelse av pasienter med stadium I NSCLC (P = 0,044). Ved å modulere ekspresjon av RBP2, våre funn antydet at RBP2 proteinmangel redusert HUVECs rør formasjonen ved å nedregulere VEGF i et kondisjonert medium. RBP2 stimulert oppregulering av VEGF, som var avhengig av HIF-1α, og aktiveringen av HIF-1α via fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt signalveien. Videre økte VEGF aktiveringen av Akt regulert av RBP2.
Konklusjoner
RBP2 protein kan stimulere HIF-1α uttrykk via aktivering av PI3K /Akt signalveien etter normoxia og deretter stimulere VEGF uttrykk. Disse funnene tyder på at RBP2 kan spille en avgjørende rolle i tumor angiogenese og tjene som en attraktiv terapeutisk mål mot tumor aggressivitet for tidlig stadium NSCLC
Citation. Qi L, Zhu F, Li Sh, Si Lb, Hu Lk, Tian H (2014) Retinoblastoma Binding Protein 2 (RBP2) Fremmer HIF-1α-VEGF-angiogenese av ikke-småcellet lungekreft via Akt Pathway. PLoS ONE 9 (8): e106032. doi: 10,1371 /journal.pone.0106032
Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children Hospital Medical Center, USA
mottatt: 9 april 2014; Godkjent: 27 juli 2014; Publisert: 27 august 2014
Copyright: © 2014 Qi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Prosjektet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (No. 30571844), Stiftelsen Science and Technology Development i Shandong-provinsen (No . 2009GG10002007), og Natural Science Foundation National Shandong-provinsen (No. ZR2009CM090). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er blant de vanligste kreftformer som fører til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis [1]. Til tross for mange forbedringer i kirurgiske teknikker og adjuvant kjemoradioterapi for NSCLC de siste tiårene, er fortsatt prognosen relativt dårlig [2]. En rekke nye molekylære markører og mulige nye mål har blitt funnet å behandle sykdommen. Imidlertid er tumorprogresjon en flertrinns prosess og den molekylære mekanismen som ligger til grunn lunge karsinogenese er i stor grad uklar.
patologisk angiogenese er et forholdsvis tidlig begivenhet i karsinogenese, og øket tumor angiogenese er korrelert med invasiv tumorvekst og metastase og en dårlig prognose [3], [4]. Det har blitt foreslått at vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og hypoksi-induserbar faktor-1α (HIF-1α) spiller avgjørende roller i tumor angiogenese. VEGF, som er det mest omfattende karakterisert endotelcelle-spesifikt angiogene faktor, som fører til øket vaskulær permeabilitet og spiller en viktig rolle i fysiologisk og patologisk angiogenese [5], [6]. Samle bevis har vist at HIF-1α, et heterodimere protein sammensatt av HIF-1α og HIF-1β subenheter, er assosiert med ulike aspekter av mobilnettet og fysiologisk prosess. Under normoxia, er HIF-1α prolyl-hydroksylert, ubiquitylated og nedbrutt i proteasomer ved binding til von Hippel Lindau (VHL) kompleks. Etter stabilisering hypoksi, binder HIF-1α til HIF-1β i kjernen og initierer transkripsjon av målgener via den hypoksi-responsive element [7], [8], [9]. I de senere år har mange studier antydet at HIF-1α også kan føre til forhøyet ekspresjon av forskjellige gener som er involvert i forskjellige biologiske funksjoner i henhold normoxia, inkludert celle proliferasjon, apoptose, migrasjon, invasjon og angiogenese [10], [11].
Retinoblastoma protein 2 (RBP2), et medlem av den Jarid familien av proteiner, er en kjernefysisk fosfoprotein med demetylase aktivitet for lysin 4 av histon H3 (H3-K4) [12], [13], [14 ]. Det viste seg at RBP2 utøver sin funksjon delvis ved å undertrykke transkripsjon av målet gener som er involvert i differensiering og at binding til retinoblastom protein (pRB) konverterer RBP2 fra en transkripsjonen repressor til en transkripsjonen aktivator [15], [16]. Nyere forskning på lungekreft har fastslått at RBP2 er korrelert til tumor migrasjon og invasjon av direkte binding til inte β1 (ITGB1) arrangører [17]. En annen studie viste at RBP2 opp-regulerer uttrykket av N-cadherin og sneglen via aktivering av Akt signalisering [18]. Videre er ITGB1 og Akt signale signifikant korrelert med tumor angiogenese [19], [20], [21], [22]. Samlet utgjør disse resultatene tyder på en onkogen rolle for RBP2 i tumor angiogenese og progresjon.
I denne studien ble RBP2 uttrykk funnet økt hos NSCLC cellelinjer så vel som i de NSCLC vev fra pasienter. For ytterligere å undersøke mulige roller RBP2 i tumor angiogenese, gir vi bevis som viser at høy RBP2 uttrykk hos NSCLC cellelinjer fremmer tumor angiogenese betydelig og belyse mekanismen involvert i aktiveringen av Akt signalering, induksjon av HIF-1α akkumulering av proteiner og VEGF uttrykk henhold normoxia.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble godkjent av etikkomiteen av Qilu Hospital. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient å publisere tilfelle detaljer, og oppkjøpet av vevsprøver ble utført som foreskrevet av de institusjonelle retningslinjer.
Pasienter
Totalt 102 pasienter (71 menn og 31 kvinner, gjennomsnittsalder 62 ± 3,56 år) med stadium i NSCLC som gjennomgikk komplett tumorreseksjon (lobektomi eller pneumonectomy) med regional lymfeknute disseksjon mellom januar 2006 og desember 2008 ved avdeling for Thoracic Surgery, Qilu Hospital, ble inkludert i studien. Den histologisk undersøkelse og grad av kreft celledifferensiering var basert på klassifikasjonssystemet av Verdens helseorganisasjon revidert i 2004 og TNM staging system for UICC 2009. I tillegg 3 pasienter (2 tilfeller med stor celle kreft og en sak med adenosquamous kreft ) gjennomgikk komplett tumorreseksjon i løpet av denne perioden ble ekskludert på grunn av for liten utvalgsstørrelse. De kliniske kjennetegn ved de 102 pasientene er vist i Tabell 1.
Immunohistochemistry
Immunhistokjemisk farging for RBP2, HIF-1α, VEGF og CD34 ble utført ved hjelp av streptavidin-peroksidase metode . I korte trekk, ble 4-mikrometer tykke seksjoner kuttet fra parafininnstøpte blokker, og lysbildene ble inkubert med primære antistoffer mot RBP2 (Bethyl, Montgomery, TX, USA, fortynning 1:100), HIF-1α (BD Biosciences, Pharmingen , Lexington, MA, USA, fortynning 1:100), VEGF (A-20, Santa Cruz Bioteknologi, CA, USA, fortynning 1:150) og CD34 (sc-19621, Santa Cruz Bioteknologi, CA, USA, fortynning 1: 100) over natten ved 4 ° C. Deretter ble biotinylerte sekundære antistoff og peroksidase-konjugert streptavidin kompleks reagens påført, etterfulgt av kontra med Mayers hematoksylin. Positive og negative kontroller ble inkludert i hvert trinn. Ekspresjon av RBP2 protein ble bedømt ved å beregne en total farging poengsum som produktet av både stillingen intensitet (0, negativ farging, 1, svak farging, 2, moderat farging, 3, sterk farging) og andel score (0, ingen; 1, 10%; 2, 10-50%, 3, 51-80%, 4, 80%). Dermed blir total score varierte fra 0 til 7. De immun lysbilder ble evaluert av to uavhengige etterforskere i en blindet mote og revurderes ved disse etterforskerne under et multihode mikroskop i uharmoniske tilfeller å komme til en enighet. For evaluering av positiv farging av RBP2 ble minst 3 seksjoner eller områder fra hver prøve scoret.
For tumor-assosiert angiogenese kvantifisering, ble microvessel tetthet (MVD) evaluert ved å telle CD34-positive immunfargete endotelceller. CD34-positive endotelialceller samt klynger av endotelceller som var klart atskilt fra tilstøtende microvessels ble målt som tellbar microvessels [23], [24], [25]. For å kvantifisere MVD ble fem svært vaskulære områder skannet på lav effekt for å identifisere «hot spots» og telles mikroskopisk i høy effekt (200 × forstørrelse) felt. Den gjennomsnittlige teller til ti synsfeltene ble registrert som den endelige MVD (to observatører og fem vaskulære hot spots hver).
Verdien cutoff for RBP2 og MVD ble bestemt på grunnlag av en heterogenitet verdi måles gjennom en log rang statistisk analyse med hensyn på total overlevelse [26]. Den endelige farging score på fire ble valgt som cutoff punkt for diskriminering mellom høy og lav RBP2 uttrykk. Derfor, ble svulster med en sluttfarging poengsum ≥4 definert som overuttrykker den RBP2 protein. Svulster med microvessels ≥57 ble klassifisert som høy MVD; svulster med microvessels 57 ble klassifisert som lav MVD. HIF-1α ble ansett overexpressed når 1% av kjerner var positive som beskrevet tidligere [27]. Svulster med en endelig flekker poengsum ≥3 ble definert som overuttrykker VEGF protein [28].
cellelinjer, kultur betingelser, Transfeksjon og små interfererende RNA Behandling
Den menneskelige lunge adenokarsinom cellelinjer A549 , SPCA-1og H1975 ble kjøpt fra National Cancer Institute (Bethesda, Maryland, USA). Den humane lunge-skvamøs cellelinje SK-MES-1 og human bronkial epitelcellelinje BEAS2B ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Menneskelige umbilical vein endotelceller (HUVECs) ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). De BEAS2B, A549, SPCA-1 og H1975-celler ble dyrket i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium (Hyclone, Logan, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; Gibco, Gaithersburg, USA). SK-MES-1-celler ble dyrket i MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) supplert med 20% FBS. HUVECs ble dyrket i endotelial cellevekstmedium M199 supplementert med 15% FBS, 1 mg /ml serum lav vekst kosttilskudd og 2 mM glutamin. Alle celler ble inkubert i 5% CO
2 ved 37 ° C. RBP2 ble overexpressed hjelp pcDNA3-HA-RBP2, en sjenerøs gave fra W.G Kaelin [12], og siRNA for RBP2 ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Plasmidet pcDNA3-HA-HIF-1α ble kjøpt fra Addgene (Plasmid 18949) [29], og siRNA for HIF-1α (ONTARGET pluss SMART basseng, L-004018) ble kjøpt fra Dharmacon RNA Technologies (Chicago, IL, USA) . Plasmidet pcDNA3 Myr HA akt1 ble kjøpt fra Addgene (Plasmid 9008) [30]. For den lille interfererende RNA (siRNA) behandling, ble celler inkubert i 6-brønners plater (3,0 x 10
5 /brønn) over natten og deretter transfeksjon ble utført ved anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Følgende siRNA sekvenser ble brukt i denne studien: RBP2 siRNA1 5′-UUGUGUACUCGUCAAACUCUACUCC-3 «; RBP2 siRNA2 5»-UUAACAUGCCGGUUAUCCAGGCUCU-3 «; kontroll siRNA 5»-UUCUCCGAAGGUGUCACGUTT -3 «.
Utarbeidelse av kondisjonert medium
RBP2-siRNA1 H1975 celler, RBP2-siRNA2 H1975 celler og kontroll-siRNA H1975 celler ble dyrket under serumfritt forholdene i RPMI 1640 medium for henholdsvis 24 timer,. Supernatanten ble deretter samlet, sentrifugert, filtrert gjennom et 0,22 mm filter (Millipore, Billerica, USA) og lagret ved -20 ° C inntil bruk i enzymbundet immunosorbent analyse (ELISA) og rør-analysen.
endotelcelle tube Formation assay
røret-analysen ble utført som beskrevet tidligere [31]. I korte trekk HUVECs (1 x 10
4 /brønn) ble sådd ut i 96-brønners plater belagt med Matrigel (50 ul) og deretter inkubert ved 37 ° C i 1 time for å polymerisere. HUVECs (1 × 10
4 celler) ble sådd i brønner med forskjellig kondisjonert medium fra RBP2-siRNA1 H1975 celler, RBP2-siRNA2 H1975 celler og kontroll-siRNA H1975 celler. En VEGFR-inhibitor (sunitinibmalat, 2,5 uM) [32] ble tilsatt til det kondisjonerte medium av styre siRNA H1975-celler og rekombinant human-VEGF-165 (rhVEGF165, Millipore, Billerica, MA, USA, 2 ng /ml) ble tilsatt til den kondisjonerte mediet av RBP2-siRNA2 H1975 celler. 96-brønners plater ble inkubert i 6 timer, og rør-dannelse ble så fotografert under en invertert mikroskop. Røret formasjon evne ble kvantifisert ved å telle det totale antall komplette rør, og gjennomsnittet av tre tilfeldige × 200 felt per brønn ble registrert som verdien per brønn.
VEGF Enzyme-Linked immunosorbent assay (ELISA)
VEGF nivåer i de ulike kondisjonert medium ble bestemt ved hjelp av en ELISA kit (R 0,05
Resultater
1. Korrelasjon av RBP2 protein og MVD med clinicopathologic faktorer
Immunhistokjemi med RBP2 (Fig. 1A og 1B fig.) Og HIF-1α (fig. 1D og fig. 1E) antistoffer viste en positiv reaksjon i kjernen, og VEGF-antistoffer (fig. 1F og 1G fig.) viste en positiv reaksjon i cytoplasma av tumorceller. RBP2 ble detektert som å være overuttrykt i 52 (51%) av 102 NSCLC-prøver i henhold til de ovennevnte kriterier. Relasjoner mellom RBP2 protein uttrykk og clinicopathologic faktorer ble undersøkt av chi-kvadrat test og våre data viste at RBP2 overekspresjon var assosiert med tumorstørrelse (
P
= 0,030), høy HIF-1α uttrykk (
P
= 0,028) og høy VEGF uttrykk (
P
= 0,048). Men det var ingen statistisk signifikans i forholdet mellom RBP2 uttrykk og andre clinicopathologic variabler (
P
0,05, tabell 1)
(A) Høy RBP2 protein uttrykk i plateepitelkreft. ; (B) høy RBP2 protein uttrykk i adenokarsinom; (C) negative RBP2 protein uttrykk i NSCLC; (D) høy HIF-1α uttrykk i plateepitelkreft; (E) høy HIF-1α protein uttrykk i adenokarsinom; (F) høy VEGF uttrykk i plateepitelkreft; (G) høy VEGF i adenokarsinom; (H) høy CD34 uttrykk i plateepitelkreft; (I) høy CD34 ekspresjon i adenocarcinoma.
intratumoral MVD ble kvantifisert ved telling av CD34-positive endotelialceller i den samme serie av lungekreft vev (fig. 1 H og 1I fig.), Og den gjennomsnittlige antall av mikrokar i ti felter ble regnet som et mål for MVD for hver prøve. Gjennomsnittlig antall microvessels av MVD i hvert tumorprøve varierte bredt, fra 6,4 til 102. Som beskrevet tidligere, svulster med microvessels ≥57 ble klassifisert som høy MVD, og 46 tilfeller (45,1%) viste høy MVD. Chi-kvadrat-test viste at høy MVD ble forbundet med høy HIF-1α uttrykk (
P
= 0,034) og høy VEGF uttrykk (
P
= 0,001), men ble ikke observert noen signifikante korrelasjoner mellom MVD og andre faktorer clinicopathologic (
P
0.05, tabell 1).
Immunohistokjemisk farging av seriesnitt av kreftvev viste at median MVD var 59,6 i høy RBP2 uttrykket gruppe (7,8 til 102) og 35,4 i den lave RBP2 uttrykket gruppe (6,4 til 94). Videre vårt statistisk analyse viste at høy MVD ble påvist oftere i svulster med RBP2 protein overekspresjon enn i de uten overekspresjon (
P
= 0,033, Mann-Whitney U test, Fig. 2A). Disse dataene antyder at RBP2 kan fremme patologisk angiogenese i NSCLC progresjon.
(A) Sammenheng mellom RBP2 uttrykk og MVD for stadium I NSCLC. NSCLC med høy RBP2 protein uttrykk viste signifikant høyere intratumoral MVD enn at med lav RBP2 protein uttrykk (
P
= 0,033, Mann-Whitney U-test). (B) Kaplan-Meier-kurver for total overlevelse viste en dårlig 5-års generell overlevelse hos pasienter med RBP2 protein overekspresjon (53,8% versus 72,0%,
P
= 0,037). (C) Kaplan-Meier-kurver for total overlevelse viste en dårlig 5-års generell overlevelse hos pasienter med høy MVD (52,2% versus 71,4%,
P
= 0,040).
en Kaplan-Meier analyse av total overlevelse viste også en dårlig 5-års generell overlevelse hos pasienter med RBP2 protein overekspresjon (53,8% versus 72,0%,
P
= 0,037, fig. 2B) og høy MVD ( 52,2% mot 71,4%,
P
= 0,040, fig. 2C). Alle statistisk signifikante variabler evaluert i de univariate analysene ble inkludert i en Cox proporsjonal hazard regresjonsmodell. Den multivariate analysen indikerte at bare RBP2 hadde en uavhengig innflytelse på overlevelsen av pasienter med stadium I NSCLC (
P
= 0,044, Tabell 2).
2. RBP2 er overuttrykt i humane NSCLC-cellelinjer
Proteininnholdet av RBP2 ble oppregulert i lungekreft cellelinjer SK-MES-1, A549, SPCA-en og H1975 i forhold til den menneskelige bronkial epiteliale cellelinje BEAS2B (fig. 3A). Ekspresjonsnivået av RBP2 i H1975 cellene var høyere enn i BEAS2B, SK-MES-1, SPCA-1 og A549-celler.
(A) RBP2 er overuttrykt i humane NSCLC-cellelinjer SK-MES-1 , A549, SPCA-1 og H1975 i forhold til de humane bronkiale epitel cellelinje BEAS2B celler. (B) Effekter av RBP2 siRNA1, RBP2 siRNA2 og pcDNA3-HA-RBP2 på uttrykk for RBP2 protein.
To stykker av sirnas og pcDNA3-HA-RBP2 målretting RBP2 ble ansatt for en funksjonell analyse i H1975 og SK-MES-1 celler. Som vist på fig. 3B viser resultatene viste at RBP2-siRNA1 og RBP2-siRNA2 kunne gi en betydelig ned-regulere ekspresjonen av proteinet i RBP2 H1975 celler. I tillegg er de to sirnas viste nesten den samme RNAi effekter, mens den negative kontroll siRNA ikke i vesentlig grad påvirker ekspresjonen av RBP2. I mellomtiden, pcDNA3-HA-RBP2 signifikant oppregulert uttrykk for RBP2 i SK-MES-1 celler, mens pcDNA3-HA ikke i vesentlig grad påvirker RBP2 uttrykk. Derfor ble RBP2-siRNA1, RBP2-siRNA2 og pcDNA3-HA-RBP2 valgt for å studere funksjonene i RBP2 proteinet in vitro.
3. Utarming av RBP2 protein minsker HUVEC tube dannelse indusert av kondisjonert medium
For å evaluere den funksjonelle betydningen av RBP2 i tumor angiogenese, ble RBP2 slått ned i H1975 cellelinjer. Resultatene viste at antall komplette rør indusert av det kondisjonerte medium av RBP2-siRNA1 H1975 celler (12,33 + 3,06) og RBP2-siRNA2 H1975 celler (9,67 + 1,53) ble betydelig redusert i forhold til den for kontroll siRNA H1975-celler (38,67 2,52, figur 4 A-D,
P
0,01)
Tube-analysen.. (A) kontroll-siRNA H1975 celler; (B) RBP2-siRNA1 H1975 celler; (C) RBP2-siRNA2 H1975 celler. (D) Kvantitativ analyse av røret formasjonen ved HUVECs indusert av kondisjonert medium; (E) nedregulering av den RBP2 proteinet redusert uttrykket nivåer av VEGF i kondisjonert media. (F) Røret dannelse indusert av kondisjonert medium av kontroll siRNA H1975 celler ble blokkert av VEGFR inhibitor (sunitinibmaleat, 2,5 mm). (G) Den reduserte rør dannelse indusert av kondisjonert medium fra RBP2-siRNA2 H1975 celler ble reddet ved å legge VEGF-165 (2 ng /ml).
4. Nedregulering av RBP2 protein reduserer uttrykket nivåer av VEGF i kondisjonert medium
Gitt det faktum at høy MVD ble forbundet med høy VEGF uttrykk (chi-kvadrat test,
P
= 0,001, Tabell 1), vi neste utforsket sammenhengen mellom RBP2 og VEGF proteinnivåene i kondisjonert medium ved hjelp av en ELISA-analysen. Resultatene viste at VEGF protein nivåer i det kondisjonerte medium av RBP2-siRNA1 (0,99 ± 0,11 ng /ml) og RBP2-siRNA2 (0,94 ± 0,14 ng /ml) H1975-celler var signifikant lavere enn i kontroll siRNA H1975-celler (1,87 ± 0,10 ng /ml), (figur 4E,
P
. 0,01). I tillegg viser våre resultater antydet at røret formasjonen indusert av det kondisjonerte medium av styre siRNA H1975-celler ble blokkert med tillegg av en VEGFR-inhibitor (sunitinibmalat, 2,5 uM, 10,33 + 2,22,
P
. 0.01, figur 4F); det reduserte rør dannelse indusert av det kondisjonerte medium av RBP2-siRNA2 H1975-celler ble reddet ved tilsetningen av VEGF-165 (2 ng /ml, 41,03 + 3,25,
P
0,01, figur 4G.).
5. RBP2 stimulerer HIF-1α og VEGF mRNA og protein uttrykk
HIF-1α er en viktig Transkripsjonsfaktor og spiller en avgjørende rolle i tumor angiogenese. Dessuten regulerer transkripsjonsfaktoren HIF-1α ekspresjonsnivået av forskjellige hypoksi-responsive gener, inkludert VEGF [11]. Vi neste undersøkt om RBP2 kan påvirke uttrykket av HIF-1α i ektopiske RBP2-uttrykke SK-MES-1 celler. Som vist på fig. 5A, den håndheves ekspresjon av RBP2 opp-regulert ekspresjon av HIF-1α protein i en tidsavhengig måte i henhold til normoksisk betingelser, og toppverdien av HIF-1α ekspresjon først ved 36 timer etter transfeksjon ble utført. Men HIF-1α var ustabil og degradert av proteasomer henhold normoxia [9], og våre resultater antydet at HIF-1α uttrykk redusert etter transfeksjon ble utført 48 timer. Derfor, for å undersøke mulig regulering av tumor angiogenese ved RBP2, vi undersøkte uttrykk for transkripsjonsfaktorer HIF-1α og VEGF i RBP2-overekspresjon og -depleted NSCLC celler i henhold normoxia 36 timer etter transfeksjon. Som vist på fig. 5B og fig. 5C, nedregulering av RBP2 i H1975-celler førte til redusert ekspresjon av HIF-1α og VEGF, mens ektopisk RBP2 ekspresjon i SK-MES-1-celler ved pcDNA3-HA-RBP2 førte til oppregulering av HIF-1α og VEGF.
(A) RBP2 oppregulert den HIF-1α protein i en tidsavhengig måte i henhold til normoksisk betingelser. (B) Nedbryting av RBP2 redusert uttrykk av HIF-1α og VEGF i H1975 celler. (C) opp-regulering av RBP2 øket ekspresjon av HIF-1α og VEGF i SK-MES-1 celler. (D) Sanntid RT-PCR viste at mRNA-ekspresjonsnivåene av HIF-1α og VEGF ble signifikant redusert i RBP2-utarmet H1975-celler sammenlignet med kontrollceller. (E) Real-time RT-PCR viste at mRNA uttrykk nivåer av HIF-1α og VEGF ble betydelig økt i RBP2-overekspresjon SK-MES-1 celler.
mRNA uttrykk nivåer av HIF -1α (
P
siRNA1 = 0,006,
P
siRNA2 = 0,001) og VEGF (
P
siRNA1 = 0,000,
P
siRNA2 = 0.000) var signifikant redusert i RBP2-utarmet H1975 celler. Videre HIF-1α (
P
= 0,001) og VEGF (
P
= 0,000) ble øket i RBP2-overekspresjon SK-MES-1-celler sammenlignet med kontrollcellene (fig. 5D og fig. 5E). Disse resultatene antydet at RBP2 spiller en viktig rolle i prosessen med tumor angiogenese gjennom oppregulering av HIF-1α og VEGF.
6. RBP2 induksjon av VEGF er avhengig av HIF-1α
For å bekrefte rollen RBP2 i å regulere HIF-1α i NSCLC celler, vi modulert HIF-1α uttrykk ved trans celler med en siRNA spesifikt mot HIF-1α (si -HIF-1α) og et plasmid pcDNA3-HA-HIF-1α, og evaluert ekspresjon av VEGF etter 36 timer. Som vist på fig. 6A og fig. 6B, knockdown av HIF-1α ekspresjon i ektopiske RBP2-uttrykkende SK-MES-1 celler førte til nedregulering av VEGF sammenlignet med krypterings ikke-spesifikt kontroll siRNA; oppregulering av HIF-1α ekspresjon i RBP2-utarmet H1975-celler førte til oppregulering av VEGF. Resultatene indikerte at RBP2-mediert tumor angiogenese av NSCLC celler kan delvis reguleres gjennom aktivering av HIF-1α.
(A) Nedbryting av HIF-1α med en siRNA spesifikt mot HIF-1α i RBP2- overekspresjon SK-MES-1 celler førte til nedregulering av VEGF sammenlignet med krypterings uspesifikk kontroll siRNA. (B) oppregulering av HIF-1α uttrykk i RBP2-siRNA2 H1975 celler førte til oppregulering av VEGF.
7. RBP2 aktiverer HIF-1α via PI3K /Akt signalveien
En fersk studie antyder at RBP2 regulerer N-cadherin og sneglen gjennom aktivering av Akt signalisering [18]. I tillegg, i henhold til normoksisk forhold, kan ekspresjon og aktivitet av HIF-1α og de etterfølgende utskilte angiogene faktorer i kreft være unormalt oppregulert ved forskjellige signalveier [34], [35], [36] som involverer Akt og nedstrøms effektorer [20], [22]. Derfor hypotese vi at RBP2 regulerer HIF-1α gjennom aktivering av Akt signalering, og vi videre søkt å påvise signalmekanismer involvert i RBP2-mediert tumor angiogenese. Våre resultater viser at å kneble RBP2 uttrykk med enten RBP2-siRNA1 eller RBP2-siRNA2 i H1975 cellene betydelig redusert fosforylering av Akt, mens tvunget uttrykk for RBP2 med pcDNA3-HA-RBP2 i SK-MES-1 celler økte aktiviteten til Akt (fig. 7A). Dessuten, når en konstitutivt aktiv form av Akt i RBP2-siRNA2 H1975-celler ble uttrykt, ekspresjonen av HIF-1α og VEGF ble øket sammenlignet med kontroll; den PI3K /akt-inhibitor LY294002 vesentlig hemmet ekspresjon av HIF-1α og VEGF i pcDNA3-HA-RBP2 SK-MES-1-celler (fig. 7B). Disse dataene tyder på at RBP2 fremmer tumor angiogenese gjennom aktivering av PI3K /akt-signalreaksjonsveien i NSCLC-cellelinjer.
(A) Dempe RBP2 ekspresjon i H1975 cellene betydelig redusert fosforylering av Akt, og den tvungne ekspresjon av RBP2 i SK-MES-1-celler økte aktiviteten av Akt. (B) Når Akt ble konstitutivt aktivert i RBP2-siRNA2 H1975, ble ekspresjon av HIF-1α og VEGF øket sammenlignet med kontrollen. Den PI3K /Akt inhibitor LY294002 vesentlig hemmet uttrykk for HIF-1α og VEGF i pcDNA3-HA-RBP2 SK-MES-1 celler. (C) Westernblots som viser tidsforløpet for Akt-fosforylering i RBP2-siRNA2 H1975-celler på grunn av VEGF-165 (25 ng /ml). (D) I nærvær av rekombinant human-VEGF-165 stimulering, ble aktivering av Akt økt i RBP2-siRNA2 H1975 celler og RBP2-overekspresjon SK-MES-1-celler (25 ng /ml, 30 minutter).
VEGF er blitt vist å være en potent aktivator av Akt i noen tilfeller [37]. Vi neste undersøkt om VEGF kunne aktivere Akt. Som vist på fig. 7C, behandling av RBP2-siRNA2 H1975-celler med rekombinant human-VEGF-165 (25 ng /ml) økte aktiveringen av Akt i løpet av 15 til 30 minutter. Som vist på fig.
