Abstract
Formål
MAGE-A3 er et potensielt mål for immunterapi på grunn av sin tumor-spesifikke natur og ekspresjon i flere tumortyper. Kliniske data på MAGE-A3 immunterapi har reist mange spørsmål som bare kan løses ved hjelp av dyremodeller. I denne studien ble ulike aspekter av murine anti-tumor immunresponser indusert av en rekombinant MAGE-A3 protein (recMAGE-A3) i kombinasjon med ulike immunstimulerende (AS01, AS02, CpG7909 eller AS15) undersøkt.
eksperimentell design og resultater
Basert på cytokin-profil analyser og beskyttelse mot utfordring med MAGE-A3-uttrykkende tumor, ble kombinasjonen recMAGE-A3 + AS15 utvalgt for videre eksperimentelt arbeid, spesielt for å studere mekanismene for anti -tumor svar. Ved å bruke MHC klasse I-, MHC klasse II-, perforin-, B-celle- og IFN–y- knock-out mus og CD4
+ T celle-, CD8
+ T celle- og NK celle- utarmede mus, viste vi at CD4
+ T-celler og NK-celler er de viktigste antitumor effektorer, og at IFN-γ er en stor effektor-molekyl. Denne musen svulst modellen også etablert behovet for å gjenta recMAGE-A3 + AS15 injeksjoner for å opprettholde effektive antitumorrespons. Videre våre resultater viste at effekten av svulst avvisning av fremkalte anti-MAGE-A3 svarene avhenger av andelen av tumorceller som uttrykker MAGE-A3.
Konklusjoner
recMAGE-A3 + AS15 cancer immunoterapi effektivt induserte en antigen-spesifikke, funksjonell og langvarig immunrespons i stand til å gjenkjenne og eliminere MAGE-A3-uttrykkende tumorceller opptil flere måneder etter den siste immunisering i mus. Dataene understreket betydningen av det immunitetsstimulerende middel for å indusere en Th1-type immunrespons, så vel som nøkkelrollen spilles av IFN-γ, CD4
+ T-celler og NK-celler i den anti-tumoral virkning.
Citation: Gérard C, Baudson N, Ory T, Louahed J (2014) Tumor Mouse Model Bekrefter MAGE-A3 Cancer Immun som en effektiv induktor av langvarig anti-tumor Responses. PLoS ONE 9 (5): e94883. doi: 10,1371 /journal.pone.0094883
Redaktør: Ramon Arens, Leiden University Medical Center, Nederland
mottatt: 21 januar 2014; Godkjent: 20 mars 2014; Publisert: May 15, 2014
Copyright: © 2014 Gérard et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. De bevilgende myndighet hadde rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. GlaxoSmithKline Biologicals SA var finansieringskilde og var involvert i alle faser av studien oppførsel og analyse. GlaxoSmithKline Biologicals SA også finansiert alle kostnader forbundet med utvikling og publisering av foreliggende manuskript. JL var involvert i studien tilsyn i alle ledd. Alle forfatterne var involvert i studiedesign, gjennomgang av studierapporter, dataanalyse og tolkning. NB og TIL gjennomført undersøkelsen og var involvert i datagenerering. Alle forfatterne var involvert i utarbeidelse og godkjenning av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Jeg har lest journalen politikk og har følgende konflikter: CG, NB, TO, JL er ansatte i GlaxoSmithKline vaksiner. CG og JL erklære lager eierskap i GlaxoSmithKline-gruppen av selskaper. CG og JL er også oppfinner på patenter som eies av GlaxoSmithKline-gruppen av selskaper (WO /2013/096430). Dette endrer ikke vår tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Helt siden William Coleys observasjoner i det 19. århundre at kreft kan behandles ved å mobilisere pasientens eget immunsystem , den endelige mål for kreft immunologer har vært på reproduserbar måte å oppnå dette på pasienter. De muterte avvikende proteiner, re-aktivert eller over-uttrykt i tumorceller, representerer potensielle «tumorantigener» som kan bli målrettet av immunsystemet [1] – [3].
Aberrant genet promoter demetylering er en viktig mekanisme ved hjelp av hvilken ekspresjon av normalt tause gener blir aktivert i tumorceller. Dette er tilfellet for
MAGEA
familie av gener som er normalt uttrykt under embryonal liv [4] og i morkaken [5], [6], men er tause i normale voksne vev, unntatt i germline celler i testis [5].
MAGE-A3, et medlem av MAGE-A-familien, er en attraktiv tumorantigen, som i) det er nesten utelukkende uttrykt i tumorer, og eliminerer risikoen for montering av en aktiv immunrespons mot normalt vev (basillceller i testiklene er de eneste normale celler som uttrykker MAGE-A3, men de er blottet for klassisk HLA klasse i-II-molekyler og dermed ikke ha noen antigenet presentasjonsmuligheter, som utelukker utviklingen av immun-relaterte toksisitet på MAGE-A3 immunoterapi), ii) det uttrykkes i mange forskjellige krefttyper, og iii) det er naturlig immunogene, som CD8
+ T-lymfocytter som er spesifikke for MAGE-A3 ble funnet å infiltrere tumor områder i melanomapasienter [ ,,,0],. 7]
Kliniske data generert i løpet av det siste tiåret ved hjelp av ulike immunterapeutiske tilnærminger viste at å levere MAGE-A3 som et renset rekombinant protein formulert med en immunstimulerende kan være en lovende tilnærming [8] – [11]. Ikke desto mindre, til tross for oppmuntrende resultater, mange problemer gjenstår å bli løst for å ytterligere forbedre MAGE-A3-spesifikke immunterapi. Spesielt forbedre MAGE-A3-immunostimulant kombinasjon for å fremkalle langvarig anti-tumor immunresponser forblir vesentlig. I tillegg er de nøyaktige mekanismene og viktige immun effektorer som fører til svulsten avvisning ikke kjent, og ingen klar immun korrelat for klinisk effekt er ennå ikke bestemt. Det er heller ikke kjent i hvilken utstrekning det sentrale mønster av MAGE-A3-ekspresjon i en svulst kan begrense klinisk effekt. Slike spørsmål og hypoteser ikke med rimelighet kan adresseres i kliniske studier, på grunn av lang varighet og begrenset antall pasienter. Derfor pre-kliniske studier er fortsatt viktig for å lede den kliniske utviklingen av MAGE-A3-spesifikk immunterapi.
Vi adressert noen av disse spørsmålene i denne studien. I en første serie forsøk ble mus immunisert med rekombinant MAGE-A3 (recMAGE-A3) formulert med forskjellige immunstimulerende: AS01, AS02, AS15 eller CpG7909. AS15 ble valgt fra denne panel for videre undersøkelser, på grunn av sin kapasitet til å drive immunsystemet mot en Th1-type immunrespons og den resulterende anti-tumor aktivitet mot MAGE-A3-uttrykkende tumorceller. Mus ble derfor immunisert med den valgte recMAGE-A3 + AS15 formuleringen i en annen serie eksperimenter for å evaluere i) de sentrale effektorene som er involvert i anti-tumoraktivitet, ii) påvirkning av boosterinjeksjoner og iii) virkningen av tumor heterogenitet -i.e. andelen av tumorceller som uttrykker MAGE-A3 på denne anti-tumor aktivitet.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Forsøk ble utført i GlaxoSmithKline Vaksiner laboratorier eller ved GlaxoSmithKline ansatte ved Armand Frappier Institute (IAF – Canada). Dyrestudier beskrevet i dette manuskriptet ble etisk gjennomgått og godkjent av GlaxoSmithKline Vaksiner «belgiske etisk komité for forsøk med dyr eller av Etisk komité for IAF. De ble utført i samsvar med EU-direktiv 2010/63 /EU, CCAC standarder (Canadian Council for Animal Care), og GlaxoSmithKline Vaksiner Holdning til Care, velferd og behandling av dyr. Både GlaxoSmithKline vaksine anlegget og IAF er AAALAC (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) akkreditert. Alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelse: svulster som overstiger en maksimal tillatt størrelse på 17 mm × 17 mm, sårdannelse, tumor nekrose, kramper, sykelighet og sirkle oppførsel var tilstander som krever aktiv dødshjelp ved intra-peritoneal injeksjon med barbituric-derivat (overdose)
Antigen Beskrivelse, produksjon og rensing
fusjonsprotein ProtD-MAGE-A3-Hans, også forkortet recMAGE-A3, inneholder de første 127 rester av protein D avledet fra
Haemophilus influenzae
ved dets N-terminus for å forbedre protein-ekspresjon i et bakterielt system, og en sekvens av histidinrester ved sin C-terminale ende for å lette fusjonsproteinrensing.
Fremstillingen av recMAGE-A3 ble utført i
Escherichia coli
stamme AR58, som beskrevet tidligere [11]. En annen rekombinant MAGE-A3-proteinet, som består av de første 314 aminosyrer av MAGE-A3 etterfulgt av 6 histidinrester, ble produsert i baculovirus [11]. Dette protein, betegnet som bacMAGE-A3, ble anvendt i overvåkingen av immunresponsen.
Beskrivelse av de Immunstimulanter
AS02 består av en olje-i-vann-emulsjon inneholdende 3-
O
-desacyl-4′-monofosforyllipid A (MPL, GlaxoSmithKline Vaksiner, Rixensart, Belgia), en Toll-like receptor (TLR) -4 agonist, og QS-21 (
Quillaja saponaria
Molina fraksjon 21, Antigenics Inc, et heleid datterselskap av Agenus Inc., Lexington, MA, USA), som er et molekyl av saponin familien [12]. AS01 er en adjuvant system inneholdende MPL, QS-21 og liposom. AS15 inneholder MPL, QS-21, liposomer, og TLR-9 ligand CpG7909 (syntetiske oligodeoksyribonukleotider [ODNs] inneholder unmethylated CpG motivene, her omtalt som CpG).
musestammer og Vaksinasjoner
C57BL /6 eller CB6F1 (hybrid mellom C57BL /6 og BALB /c) hunnmus (6-8 uker gamle) ble kjøpt fra Harlan (Horst, Nederland) og holdt i patogenfrie forhold.
mus var vanligvis injisert 2 eller 4 ganger intramuskulært ved 2-ukers intervaller med 1 eller 10 mikrogram av recMAGE-A3 i 50 mL av immunstimulerende.
for å studere langtidsbeskyttelse, mus fikk 2 injeksjoner av enten recMAGE-A3 + AS15 eller fosfat-bufret oppløsning (PBS) i 2-ukers intervaller. Åtte uker etter den andre immunisering, ble dyrene utfordret med en TC1-MAGE-A3 tumor (se beskrivelse av kreftceller under;
tumormodeller og utfordringer
). På dag 150, 80 dager etter tumor utfordring, ble tumorfrie dyr fra recMAGE-A3 + AS15 gruppe randomisert og fordelt til to grupper. En gruppe fikk fire booster-injeksjoner av recMAGE-A3 + AS15 ved en 4-ukers intervall og den andre gruppen fikk injeksjoner av PBS å følge samme plan. Tretti dager etter siste injeksjon, mus gikk en svulst utfordring i samme flanke, og tumorvekst ble overvåket i løpet av 46 dager (opp til dag 319). I tillegg ble tumorceller injisert i en gruppe på ti PBS-immuniserte mus, som en positiv kontroll for tumorvekst.
For å vurdere rollen til IFN-γ, perforin og MHC klasse I eller II molekyler i tumor beskyttelse følgende MAGE-A3 immunterapi, ble immunsvikt mus brukes med de samme vaksinasjonsprogrammene som beskrevet ovenfor. Følgende stammer ble kjøpt fra Jackson Institute: IFNy-slått ut (KO) mus (B6.129S7-Ifngtm1Ts /J), MHC klasse I-KO (B6.129P2-b2mtm1Unc), MHC klasse II-KO (B6.129S2 -H2-dIAb1-Ea00451), B-celle-KO (B6.129S2.IgHmTm1Cgn) og perforin-KO-mus (C57BL /6-Prf1 tm1Sdz /J).
for å vurdere den potensielle rolle T-celler, recMAGE-A3-immunisert C57BL /6 mus ble tømt for CD4
+ eller CD8
+ T-celler ved å injisere 0,5 mg rotte anti-mus antistoffer (GK1.5 [TIB-207 fra ATCC] og 2,43 [TIB- 210 fra ATCC], henholdsvis) en uke før tumoren utfordringen, og deretter hver uke i løpet av eksperimentet. NK-celle uttømming ble oppnådd ved å injisere den anti-asialo GM1-antistoff (Cedarlane) to ganger i uken starter på dag 49 (dvs. 7 dager før tumor utfordring) og til slutten av forsøket (0.1 ml pr injeksjon). Nedbryting ble verifisert av flowcytometri (data ikke vist). Kontroll antistoffer med liknende isotypes til reduserende antistoffer ble brukt som negative kontroller.
tumormodeller og utfordringer
TC1-MAGE-A3 celler er murine tumorceller genmodifiserte for å uttrykke menneskelige MAGE-A3. TC1 tumorceller (hentet fra Dr T. Wu, John Hopkins University) er interessant som de rekapitulere de ulike trinnene som fører til tumorigent cellelinje. Opprinnelig ble TC1 svulst cellelinje generert fra C57BL /6 primære lunge epitelceller udødeliggjort av transfeksjon av
HPV-16 e6 Hotell og
e7
gener, og transformert med en aktivert
Ras
onkogen [13]. Disse cellene ble transfektert med en pcDNA3 plasmid som inneholder
MAGEA3
cDNA og
zeocin
utvalg genet. Kloner som er resistente mot behandling zeocin ble testet for
MAGEA3
-ekspresjon ved RT-PCR og for MHC klasse I ekspresjon ved strømningscytometri (data ikke vist). Den beste klon som viser reproduserbar tumorgenisitet i mus ble valgt.
For hver utfordring, dyrene mottok en subkutan injeksjon av 2 x 10
6 TC1-MAGE-A3-celler (200 ul i den flanke). Individuelle svulstveksten ble målt to ganger i uken ved å måle produkt av 2 hoved diametrene av tumoren i løpet av overvåkningsfasen, og starter 7 dager etter dagen for utfordring. Mus ble ofret i løpet av studien når svulsten størrelse nådde 289 mm
2. I et slikt tilfelle, er verdien av den siste målingen foretas forut for ofre ble båret frem til neste gang punkt (er).
For å avgjøre om en terskel prosentandel av MAGE-A3-uttrykkende kreftceller er nødvendig for å lokke fram svulst avvisning av immunsystemet, ble PBS-skinn-immuniserte mus og mus immunisert med recMAGE-A3 + AS15 utfordret med TC1 parentale celler (100% MAGE-A3-negative celler), TC1-MAGE-A3-celler (100% MAGE- A3 uttrykke celler), eller ulike prosenter av TC1 /TC1-MAGE-A3. dvs. 10/90, 50/50 eller 90/10%, henholdsvis
cytokinproduksion
Isolerte musesplenocyter ble dyrket i nærvær av 1 pg /ml bacMAGE-A3. Etter 72 timer ble konsentrasjonene av IL-2, IL-4, IL-5, IFN-γ og TNF-α i supernatantene ble målt ved cytometrisk kulegruppe (CBA, Pharmingen katt n ° 551 287), i henhold til produsentens instruksjoner .
Intracellulær Cytokine Farging og Flow Cytometry
Perifere blod mononukleære celler isolert fra immuniserte dyr ble stimulert
in vitro
i 96-brønns plater rundbunnede med enten medium (uten stimulering ) eller et basseng på femti-syv 15 meren peptider som overlapper med 10 aminosyrer, som dekker hele sekvensen av MAGE-A3 (1 ug /ml for hvert peptid), i et sluttvolum på 200 ul av RPMI, 5% føtalt kalveserum (FCS) inneholdende kanin-anti-muse-anti-CD49d og anti-CD28-antistoffer (Becton Dickinson, BD n ° 553154 og 553295 n ° henholdsvis; sluttkonsentrasjon: 1 pg /ml hver). Etter 2 timers inkubering ved 37 ° C, ble sekresjon av cytokiner blokkert ved tilsetning av 50 ul Brefeldin (Golgi stikkontakt, BD n ° 555 029: 1/1000 i RPMI 5% FCS). Celler ble overført til en 96-brønns plate konisk bunn, sentrifugert og vasket med 250 pl PBS inneholdende 1% FCS (FACS-buffer). Cellepelletene ble inkubert i 10 minutter ved 4 ° C i nærvær av rotte-anti-mus CD16 /CD32 (2.4G2, BD n ° 553 142; 0,5 mg /ml) for å blokkere Fcy-reseptorer. CD4
+ og CD8
+ T-celler ble farget i 30 minutter ved 4 ° C ved tilsetning av 50 ul fykoerytrin-merket rotte anti-mus CD4 monoklonalt antistoff (BD n ° 556 616) eller peridinin klorofyll protein-merket rotte anti -mouse CD8 monoklonalt antistoff (BD n ° 553036). Etter et vasketrinn ble cellene fiksert i 200 ul cytoFix-cytoPerm løsning (BD n ° 554 722) i 20 min ved 4 ° C og permeabilisert ved tilsetning permWASH oppløsning (BD n ° 554 723). Etter sentrifugering ble cellene inkubert i 2 timer ved 4 ° C med 50 pl av en blanding av allofykocyanin-merket anti-IFN-γ (BD n ° 554 413). Cellene ble vasket, sentrifugert og resuspendert i FACS-buffer før strømningscytometri-analyse (LSR2 fra BD). Gating ble gjort på T-celler, og totalt ca 20 000 CD4
+ T-celler ble kjøpt. Dataene ble uttrykt som prosentandeler av MAGE-A3-spesifikke IFN-γ-produserende CD4
+ eller CD8
+ T celler blant den totale befolkningen i CD4
+ eller CD8
+ T-celler, henholdsvis etter subtraksjon av kontroll middels verdi.
Statistiske analyser
Cytokin analyser ble utført ved hjelp av en ANOVA med gruppen som faktor etter log-transformasjon av dataene. For andre analyser, den statistiske modellen var et gjentatt ANOVA med gruppen, tid og gruppe-for-time samhandling som faktorer; korrelasjonen mellom to målinger fra den samme mus antas å være autoregressiv, dvs. korrelasjoner avta eksponentielt med tiden. Avvik ble antatt å være forskjellig på tvers av grupper, men identisk på tvers av tidspoeng. Sammenligninger av gjennomsnitts tumor størrelser ble gjort i siste tidspunkt.
Resultater
Immun og anti-tumor respons i mus immunisert med recMAGE-A3 Kombinert med ulike Immunstimulanter
etter fire vaksinasjoner av C57BL /6 mus med recMAGE-A3, alene eller formulert med en immunostimulant (AS01, AS02, CpG eller AS15) ble begge humorale og cellulære immunresponser vurdert. Antistoffresponsen var lav etter immunisering med recMAGE-A3 alene, sammenlignet med immunisering med recMAGE-A3 formulert med en immunstimulerende (figur S1). Den humorale responser indusert ved recMAGE-A3 formulert med forskjellige immunstimulerende midler ble betraktes som tilsvarende, uavhengig av immunostimulant. Tilsvarende ble det ikke store forskjeller mellom de immunstimulerende i deres evne til å indusere T-celle responser som vurderes av Lympho-spredningsforsøk (figur S2).
I kontrast, ble relevante forskjeller mellom immunstimulerende observert når
in vitro
cytokinproduksjon med splenocytter isolert fra immuniserte dyr ble målt ved CBA i kultursupernatantene (figur 1). Til tross for det lave antall mus (n = 2 eller 3) i hver gruppe, og resultatene viste at AS15 induserer en klar forskyvning mot en Th1-profil, karakterisert ved høyere IFN-y /IL-5 og TNF-a /IL-5-forhold , relativt til AS01, AS02 og CpG. Denne observasjonen var assosiert med en høyere produksjon av IL-2 indusert ved AS15 relativt til de andre immunstimulerende.
Musene ble immunisert på dag 0, 14, 28 og 42 med recMAGE-A3 (10 ug antigen) alene eller recMAGE-A3 formulert med ulike immunstimulerende, og re-stimulert
in vitro
av bacMAGE-A3. Cytokin produksjon ble målt ved cytometrisk perle array (CBA) etter 72 timer med kultur. Hver prikk representerer en mus, og barer er geomeans. N, ikke gjort.
Etter 4 vaksinasjoner med PBS eller recMAGE-A3 formulert med ulike immunstimulerende, ble musene utfordret subkutant med TC1-MAGE-A3 tumorceller og
in vivo
tumorvekst ble fulgt under 4 uker. I mus behandlet med PBS, ble en progressiv vekst av tumorene sett (figur 2). Forskjellige resultater ble observert for mus immunisert med recMAGE-A3, avhengig av den tilknyttede immunostimulant. Musene ble ikke beskyttet mot tumorvekst når AS02 ble brukt og ble dårlig beskyttet med AS01 eller CpG. Men tumorvekst ble kontrollert i mus immunisert med recMAGE-A3 + AS15. Ikke bare ble tumorstørrelse redusert i denne gruppen, men 3/5 mus var svulst fritt når svulster ble vurdert fire uker etter at svulsten utfordring.
mus (n = 5) ble immunisert med recMAGE-A3 ( 10 ug antigen) formulert med forskjellige immunstimulerende og utfordret med TC1-MAGE-A3-celler. På dag 84, er standardfeil av middelverdien vist, og det antall mus gjenværende tumorfri er indikert for hver gruppe. På dag 84 ble recMAGE-A3 + AS15 gruppe funnet forskjellig fra alle andre gruppen (p 0,01). Også ble tumorvekst sank i recMAGE-A3 + AS15 gruppen, sammenlignet med de andre gruppene (p 0,01).
Spesifisiteten av denne anti-tumorrespons ble etablert ved å vise at mus immunisert med recMAGE + AS15 var ikke i stand til å utrydde TC1 celler transfektert med et irrelevant antigen (TC1-HER2 /neu) injisert i de samme vilkår som TC1-MAGE-A3 celler (data ikke vist). Vi observerte også at AS15 måtte være til stede i hver injeksjon for å effektivt stimulere anti-MAGE-A3 immunitet (data ikke vist).
Basert på hele sett av data som sammenligner de ulike immunstimulanter, valgte vi AS15 for alle følgende eksperimenter med recMAGE-A3, som det induserte en Th1-immunrespons forspent og var den mest effektive mot vekst av MAGE-A3-uttrykkende tumorceller.
Immunisering med recMAGE-A3 + AS15 utløser Long-term beskyttelse
et viktig aspekt i generering av en anti-tumor immunrespons er dannelse av langsiktig immune minne som er i stand til å gi langvarig beskyttelse mot tilbakefall av tumorer. I preliminære eksperimenter i mus, observerte vi at en økning av antallet recMAGE-A3 + AS15 injeksjoner var nødvendig for å bedre beskytte mus mot tumoren utfordring, noe som tyder på at opprettholde immunresponsen ved gjentatte injeksjoner kan være nødvendig for forbedret effektivitet (data ikke vist) .
Vi setter opp et eksperiment for å vurdere om immunisering med recMAGE-A3 + AS15 var i stand til å fremkalle en slik langsiktig immunhukommelse og om boosters var nødvendig (figur 3A). For dette formål, ble mus immunisert på dagene 0 og 14 med enten PBS eller recMAGE-A3 + AS15. Immunisering med recMAGE-A3 + AS15 induserte IFN-γ-produserende antigen-spesifikke CD4
+ og CD8
+ T-celler (figur 4). Etter utfordring med TC1-MAGE-A3-tumorceller, alt PBS-immuniserte mus utviklet en tumor og ble avlivet, mens 52 av 60 recMAGE-A3 + AS15-immuniserte mus forkastet tumoren og forble tumorfri i minst to måneder ( Figur 3A).
A. Studiedesign og utvalgsstørrelse (CB6F1 mus) på de ulike trinnene er vist. Immuniseringer ble foretatt med 1 ug antigen. B. Etter den andre tumor utfordringen, ble tumorvekst fulgt i 46 dager. Ved slutten av forsøket (dag 319), standardfeil av middelverdien er vist og antallet tumorfrie mus er indikert for hver gruppe.
CB6F1 mus ble behandlet som vist i figur 3A . Kort fortalt mus var tumor-utfordret etter to vaksinasjoner med recMAGE-A3 + AS15 eller PBS (kontroll 1). Mus av MAGE-A3 + AS15 gruppe gjenværende kreftfrie mottok enten PBS boosters eller recMAGE-A3 + AS15 boosters. En ny kontrollgruppe mottok PBS (kontroll 2). Blodprøver ble tatt på dag 21 (7 dager etter den andre immunisering) og på dag 166 (7 dager etter den første booster injeksjon). Blodprøver ble samlet og mengdene av MAGE-A3-spesifikke IFN-y γ produserende CD4
+ og CD8
+ T-celler ble bestemt ved intracellulær farging og strømningscytometri. Data er uttrykt som prosentandel av total CD4
+ og total CD8
+ T-celler etter subtraksjon av kontrollmediet verdier, som representerte omkring 0,02% ved måling av CD4
+ T-celler, og 0,1% når man måler CD8
+ T-celler, respektivt; hvert punkt er en pool av 3 prøver på dag 21 og hvert punkt er en pool av 5 prøver på dag 166. *** = p. 0,001
På dette stadiet, 50 av 52 svulst -fri mus ble tilfeldig fordelt til to grupper. En gruppe fikk PBS og den andre gruppen recMAGE-A3 + AS15. Immunresponser ble evaluert ved dag 166, 7 dager etter første booster. I gruppen som har mottatt en PBS booster, CD4
+ og CD8
+ T-celle responser ved dag 166 (5 måneder etter at de første to vaksinasjoner med recMAGE-A3 + AS15) var lavere enn svarene på Day 21 (en uke etter de første to vaksinasjoner med recMAGE-A3 + AS15) (figur 4). Dette illustrerer reduksjonen i immunresponser over tid. I motsetning til dette var tilstrekkelig til å heve nivået av cytokin-produserende CD4
+ T-celler opp til i det minste de nivåene målt på dag 21. I tillegg er en enkelt recMAGE-A3 + AS15 booster-injeksjon, vil nivået av CD8
+ T-celler ble øket opp til 5 ganger sammenlignet med nivåene målt en uke etter at de første to immuniseringer (figur 4) og MAGE-A3-spesifikke CD8
+ T-celler som produserer IFN-γ representert opptil 20% av CD8
+ T-celle basseng.
Etter fire månedlige boosters, de 50 musene var tumor-utfordret. På dette stadiet ble en tredje gruppe på 10 mus som mottok bare PBS innført som en kontroll for tumorvekst. Ingen IFN-γ-produserende antigen-spesifikke CD4
+ og CD8
+ T-celler ble detektert i denne kontrollgruppen.
I gruppen som fikk boostere av PBS, bare lave nivåer av IFN- γ-produserende antigen-spesifikke CD4
ble det ikke observert + T-celler (rest fra de to første MAGE-A3 + AS15 injeksjoner gitt 9 måneder tidligere). Imidlertid 19 av disse 25 mus forble tumorfri etter utfordringen, noe som indikerer at en langtidsimmunhukommelse hadde blitt hevet, og at musene ble fortsatt beskyttet nesten ett år etter den siste immunisering. I gruppe mus økte månedlige med recMAGE-A3 + AS15 alle 25 mus forble tumor-fri (Figur 3B). Disse data tyder på at det var en fordel å gi vaksinasjoner med recMAGE-A3 + AS15, selv om en langvarig og effektiv immunrespons ble indusert ved første vaksinasjon.
I en påfølgende langsiktig eksperiment, vi fastslått at AS15 var nødvendig i hver booster å optimalt beskytte dyrene mot tumorvekst (data ikke vist).
CD4
+ T celler, NK-celler, IFN-γ og MHC klasse II er Cell subpopulasjoner og Molecular effektor involvert i recMAGE-A3 + AS15-indusert tumor Protection
i et forsøk på å identifisere cellene eller effektor mekanismene som kan være ansvarlig for beskyttelse mot svulsten, ble en serie eksperimenter utført i mus enten KO eller tømt for spesifikke celletyper. De ulike gruppene av mangelfull mus fikk to eller fire vaksinasjoner av recMAGE-A3 + AS15 på en to-ukers intervall før de ble utfordret med TC1-MAGE-A3 celler. Som vist i figur 5, forble B-celle-KO, MHC klasse I-KO og perforin-KO mus beskyttet med recMAGE-A3 + AS15 immuniseringer. I motsetning til dette ble tumor beskyttelse påvirket på NK og CD4
+ T-celle-fratatte mus, og i IFN-γ-KO og MHC klasse II-KO mus. Disse resultatene identifisert CD4
+ T-celler og NK-celler som viktige cellepopulasjoner i svulsten avvisning mekanisme. IFN-γ ble også identifisert som et kritisk molekyl effektor. Selv om den eksakte kilden for IFN-γ ikke er kjent, understreker det videre viktigheten av å indusere en Th1-forspent anti-tumor immunrespons.
I-celleutarming eksperimenter, kontroll isoptypes (Ig) tilsvarende til antistoffet benyttet til å utarme T-celle eller NK-celler ble anvendt. Antallet dyr per gruppe er angitt i hvert diagram tittel. Den røde pilen indikerer tiden av tumor utfordring. På det siste tidspunkt, er standardfeil av middelverdien som er vist og antallet tumorfrie mus er indikert for hver gruppe. Den midlere tumorstørrelse i hver gruppe ble statistisk sammenlignet med den for recMAGE-A3 + AS15 gruppe på det siste tidspunkt (* = p 0,01, ** = p 0,001; NS = ikke signifikant).
tumorvekstinhibitering Avhenger Andel MAGE-A3-uttrykkende celler i svulsten
uttrykk for MAGE antigener er ikke nødvendigvis homogen i en svulst, som viser fokus flekker i immunhistokjemi [14], sannsynligvis fordi ikke alle celler som uttrykker MAGE-A3 på samme tid og på samme nivå. Ettersom dette fenomenet er forventet å ha en innvirkning på effekten av recMAGE-A3 + AS15 immunisering, vi vurdert om recMAGE-A3 + AS15 var i stand til å beskytte mus mot en svulst som ikke består av 100% MAGE-A3-uttrykkende celler.
Etter immunisering med PBS eller recMAGE-A3 + AS15, ble mus utfordret med forskjellige forhold mellom TC1 foreldre tumorer og TC1-MAGE-A3-uttrykkende celler (0-10-50-90 og 100%) (figur 6). Resultatene viste at alle tumorblandinger vokste jevnt i mus sham-immunisert med PBS. Likeledes fremveksten av en MAGE-A3-negativ svulst ble ikke påvirket av recMAGE-A3 + AS15 immunisering. I motsetning til dette, recMAGE-A3 + AS15 immunisering beskyttet mot tumorvekst i løpet av de 25 dager etter tumor-utfordring, selv når bare 10% av TC1 cellene uttrykte MAGE-A3. Det samme gjelder når 50% av cellene, og utover, uttrykt MAGE-A3. Imidlertid, mens alle mus utfordret med 100% MAGE-A3-uttrykkende celler forble tumorfri opp til 57 dager etter utfordringen, tilbakefall ble observert hos musene utfordret med tumorer som inneholdt MAGE-A3-negative celler. Intensiteten av fenomenet var avhengig av prosentandelen av MAGE-A3-negative celler i utfordrende tumor. I gruppen utfordret med 90% MAGE-A3-uttrykkende celler, 2/9 mus viste et tilbakefall. Den midlere tumorstørrelse i denne gruppen var ikke signifikant forskjellig fra den for gruppen som fikk 100% MAGE-A3-uttrykkende celler TC1. I motsetning til dette, i gruppen utfordret med 50% av MAGE-A3-uttrykkende celler, hadde 6/9 mus som fikk tilbakefall på dag 112, og i gruppen utfordret med 10% av MAGE-A3-uttrykkende celler, tilbakefall ble observert i 7 /9 mus ved dag 112. den midlere tumorstørrelse i disse gruppene var statistisk forskjellig fra den gruppen som fikk 100% av MAGE-A3-uttrykkende celler TC1, med den høyeste bety tumorstørrelsen hos alle dyr som fikk tilbakefall observert hos mus utfordret med 10% MAGE-A3-uttrykkende celler.
mus immunisert med recMAGE-A3 + AS15 (1 mikrogram av antigen) ble fulgt opp til dag 112. på Days 77 og 112, er standardfeil av middelverdien vist og antall tumorfrie mus er indikert for hver gruppe. Statistiske sammenligninger av den midlere tumorstørrelse i hver gruppe med at TC1-MAGE-A3 (100%) gruppe på dag 77 og 112 er vist (* = p 0,01, ** = p 0,001; NS = ikke signifikant). Rød pil. Dagen utfordring
Diskusjoner
I denne studien, vurderte vi potensialet i recMAGE-A3 formulert med ulike immunstimulerende midler. Begge de induserte immunresponsen og deres evne til å hemme tumorvekst ble analysert. For de funksjonelle forsøk ble anti-tumor potensialet av MAGE-A3-immuniseringer evaluert på en profylaktisk miljø med ikke-tumorbærende mus i stedet for en terapeutisk setting for å nærmere etterligne den kliniske situasjonen for adjuvant behandling av kreftpasienter. Faktisk, i adjuvant pasientene først gjennomgå en operasjon, og anses fri for svulst når de mottar vaksinasjon. Selv om musemodeller kan ikke helt gjenspeile den menneskelige situasjon, dels på grunn av iboende forskjeller mellom de to immunforsvar [15] og fordi mus ikke er primet av en primærtumor, injeksjon av TC1-MAGE-A3-celler ble valgt som en tumormodellen å karakterisere virkningen av immunresponser som er indusert av recMAGE-A3-baserte immunisering. Med denne modellen, kan de forskjellige immunstimulerende midler evalueres og i det minste en del av mekanismene for tumor avvisning kan bli avslørt.
Vårt første og reproduserbar observasjon var at injeksjon av recMAGE-A3 alene induserte ikke beskyttende immunresponser , recMAGE-A3 er svakt immunogent i seg selv.
