Abstract
Mål
Genistein er soyaisoflavoner som har antitumor aktivitet både in vitro og in vivo. Det har vist seg at genistein hemmer mange typer av kreft inkludert prostata cancer (PCA) ved å regulere en rekke cellesignalveier og microRNAs (mirnas). Nyere studier tyder på at de lange ikke-kodende RNA (lncRNAs) er også involvert i mange cellulære prosesser. I dag er det ingen rapporter om forholdet mellom gensitein, mirnas og lncRNAs. I denne studien har vi fokusert på mirnas, lncRNA som er regulert av genistein og undersøkt deres funksjonelle rolle ved PCA.
Metode
Microarray (SurePrint G3 Menneskelig GE 8 × 60K) ble brukt til uttrykk profilering av genistein behandlet og kontrollere PCA celler (PC3 og DU145). Funksjonell analyse (celle spredning, migrasjon, invasjon, apoptose og cellesyklus analyser) ble utført med PCA cellelinjer, PC3 og DU145. Både in vitro og in vivo (naken mus) modeller ble anvendt for vekstmålinger. Luciferaserapportørplasmid analyser ble brukt til binding av MIR-34a til hotair.
Resultater
LncRNA profilering viste at hotair ble sterkt regulert av genistein og dens uttrykk var høyere i kastreringsresistent PCA cellelinjer enn i normale prostataceller. Knockdown (siRNA) av hotair redusert PCa celleproliferasjon, migrasjon og invasjon og indusert apoptose og cellesyklus arrest. MIR-34a var også oppregulert av genistein og kan direkte rettet mot hotair både PC3 og DU145 PCA celler.
Konklusjoner
Våre resultater indikerer at genistein hemmet PCa cellevekst gjennom nedregulering av onkogene hotair som også målrettet av tumor suppressor MIR-34a. Disse funnene øke forståelsen av hvordan genistein regulerer lncRNA hotair og MIR-34a ved PCA
Citation. Chiyomaru T, Yamamura S, Fukuhara S, Yoshino H, Kinoshita T, Majid S, et al. (2013) Genistein hemmer prostatakreft cellevekst ved Targeting MIR-34a og onkogene hotair. PLoS ONE åtte (8): e70372. doi: 10,1371 /journal.pone.0070372
Redaktør: Arun Rishi, Wayne State University, USA
mottatt: 23 april 2013; Godkjent: 17 juni 2013; Publisert: 01.08.2013
Copyright: © 2013 Chiyomaru et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av Nasjonalt Senter for Forskningsressurser av National Institutes of Health gjennom Grant Antall R01CA160079, R01CA138642, T32DK007790 og VA Merit omtale og VA Program Project. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Genistein er et kosttilskudd soyaisoflavoner. Dets struktur er lik den til human 17-β-østradiol forårsaker østrogen og /eller anti-østrogene effekter [1]. Genistein er også et protein-tyrosinkinase-inhibitor [2] og har antitumor-effekter in vitro og in vivo. Det har vist seg at genistein hemmer mange typer av kreft inkludert prostata cancer (PCA) [3], [4] ved regulering av en rekke cellesignalveier som Wnt, Akt og JAK /STAT trasé [5] – [8].
Nyere bevis tyder på at ikke-koding RNA (ncRNAs) er involvert i mange cellulære prosesser. microRNAs (mirnas), klasse av små ncRNAs ca 22 nukleotider i lengde, funksjon som negative regulatorer av målet mRNA transcriptionally og post-transcriptionally [9]. Det er kjent at mirnas regulere opp til to tredjedeler av det humane genom [10] og spiller viktige roller i en rekke biologiske prosesser, inkludert utvikling, differensiering, proliferasjon, angiogenese, metabolisme og pluripotency [11], [12]. Det har blitt rapportert at genistein øket ekspresjon av tumor suppressor MIR-146a, forårsaker inhibering av EGFR og NF-kB veien [13], [14]. MIR-27a har blitt rapportert å være en onkogene miRNA regulert av genistein og regulerer VEGF signalering ved å målrette ZBTB10 [15], [16]. Våre tidligere studier viste at genistein behandling signifikant nedregulert uttrykk for onkogene MIR-151 som direkte retter seg mot SOX17 og ARHGDIA [17]. SOX17 ble rapportert å være et tumorsuppressorgen som hemmer WNT /β-catenin signalisering ved å målrette både β-catenin og T-celle-faktor (TCF) /lymfoide forsterker faktor (LSF) proteiner [18] – [20]. ARHGDIA regulerer negativt Rho familien av GTPases (Rho, Rac, og Cdc42) [21] som er involvert i Wnt signalveien [22]. Vi fant også at genistein ned-regulerer Rac1 og EP300 gener som er viktige regulatorer av VEGF-mediert angiogenese [23], [24] og EGFR-genet med opp regulerende MIR-574-3p [25].
NcRNAs er delt inn i to store klasser basert på karakterutskriften størrelse; liten ncRNAs og lang ncRNAs (lncRNAs). lncRNAs er generelt definert som RNA gener som er større enn 200 nukleotider som ikke har noen protein-kodende potensiale. Storskala sekvensering av cDNA bibliotek og neste generasjons sekvensering viser at lncRNAs hos pattedyr nummer i titusener. Så langt har bare 126 menneske lncRNAs blitt funksjonelt annotert i lncRNA data base [26]. Dermed er det ingen rapporter om forholdet mellom gensitein og lncRNAs.
HOX transkripsjon antisense RNA (hotair) genet ligger innenfor Homeobox C (HOXC) genet klynge på kromosom 12 og koder s 2,2 kb lncRNA molekyl. Dette gen blir transportert fra kromosom 12 til kromosom 2 av en komponent av Polycomb Undertrykkende Complex 2 (PRC2) og undertrykker transkripsjon av homeobox D (HOXD) gener [27]. Hotair samhandler med både PRC2 og lysin bestemt demetylase 1 (LSD1) komplekser og par histon H3 lysin 27 metylering og lysin 4 demetylering for epigenetisk stanse av ikke bare HOXD gener, men også mange andre gener [28]. Dette genet er sterkt uttrykt i en rekke kreftformer som bryst, kolorektal, lever, bukspyttkjertel, og strupekreft [29] – [33]. Høy uttrykk for hotair i brystkreft er en prediktor for metastasering og dårlig resultat [29]. Hotair er også antatt å være en potensiell biomarkør for eksistensen av lymfeknutemetastaser i leverkreft [34]. Hotair er en negativ faktor prognostisk og fungerer som et onkogen i bukspyttkjertelkreft både in vitro og in vivo [32]. Derfor i denne studien, har vi fokusert på lncRNA hotair som er regulert av genistein og undersøkt sin funksjonelle rolle ved PCA.
Resultater
Effekt av Genistein behandling på spredning, apoptose og cellesyklusen ved PCA celler
for å verifisere svulst undertrykkende funksjonene genistein, gjennomførte vi funksjonsanalyse. MTS-analyse viste at celleformering ble redusert ved behandling genistein i begge PC3 og DU145-celler (Fig. 1A). Apoptose-analysen viste at genistein signifikant induserte apoptose av DU145-celler (Fig. 1B). Imidlertid ble ingen signifikant effekt av apoptose observeres i PC3-celler. Cellesyklus analyse viste at behandling med genistein forårsaket G2 /M fase cellesyklus arrest i både PC3 og DU145 cellene (Fig. 1C).
(A) Genistein hemmer cellenes levedyktighet betydelig. Cellenes levedyktighet ble analysert ved MTS-celleproliferasjonsanalyse etter 4 dagers behandling (25 uM). **, P 0,0001. *, P 0,01. Data er presentert som gjennomsnitt ± SE. (B) Apoptose-analyse ved hjelp av flow cytometri. Representative kvadrant figurer av kontroll og genistein (25 mm) behandlede celler i PC3 (til venstre) og DU145 (høyre) celler. P 0,05. (C) Den typiske tall på cellesyklusanalyse av kontroll, eller genistein (25 uM) behandlede celler er vist. Stolpediagrammet er vist på høyre side av hvert tall representerer prosentandelen av cellene i G0 /G1, S eller G2 /M fase som indikert. * P 0,05
Identifikasjon av målgener og molekylære stier reguleres av Genistein ved PCA
For å identifisere gener og stier målrettet av genistein i PCA celler, vi utførte genuttrykk profilering bruker. genistein og kjøretøy (kontroll) behandlet PC3 og DU145 cellene. Uttrykket av 918 gener ble signifikant nedregulert i begge PCA cellelinjer (gjennomsnittlig log2 ratio -0.5, Tabell S1). Disse genene ble tildelt Kyoto Encyclopedia of gener og genomer (KEGG) merknader som bruker entall berikelse analyse av GeneCodis. Betydelig beriket trasé i KEGG ble identifisert som «Pathways i kreft «,» Cell syklus «,» Regulering av aktin cytoskjelettet «og» Jak-STAT signalveien «(P 0,05, Tabell S2). Vi fokuserte på KEGG «Pathway i kreft «og genene i denne veien er markert i kartet KEGG (Fig. S1).
For å bestemme genuttrykk i PCA kliniske prøver, vi utførte uttrykk analyser for alle kandidat målrette gener involvert i «Pathways i kreft» ved hjelp av microarray expression data, som ble godkjent av Gene Expression Omnibus (GEO). Uttrykket nivåer av disse gener ble undersøkt i 47 PCa og 47 normale prøver, som vist i varmen kartet diagrammet i fig. S2. Gener oppregulert ved PCA er vist i rødt, nedregulert genene er vist i blått, mens hvite linjer indikerer gener som uttrykkes på samme nivå i begge. Fra denne analysen ble flere viktige genet målene identifisert, inkludert histondeacetylase 1 (HDAC1), protein hemmer av aktivert STAT, 3 (PIAS3), tropomyosin 3 (TPM3), transkripsjonsfaktor 7-lignende 2 (T-celle spesifikt, HMG boks) (TCF7L2), aryl hydrokarbon reseptor atom Translocator 2 (ARNT2), CREB bindende protein (CREBBP), krysset plakoglobin (JUP), og v-akt murine thymom viral onkogen homolog 2 (akt2).
identifisering av lncRNAs regulert av Genistein ved PCA
SurePrint G3 Menneskelig GE 8 × 60K microarray plattform omfatter også prober for lincRNAs. For å identifisere de lncRNAs regulert av genistein i PCA celler, utførte vi genuttrykk profilering. Fem lncRNAs ble nedregulert i begge PCA cellelinjer (gjennomsnittlig log2 ratio -1,0, Tabell 1) med lncRNA hotair viser størst effekt. For å bestemme relative uttrykk nivåer av hotair i prostataceller, vi utført kvantitativ real-time PCR ved hjelp av ubehandlede PCA cellelinjer og sammenlignet dem med normal prostata epitelceller (RWPE-1). Vi observerte at hotair ekspresjon var signifikant oppregulert i kastrerings-resistente cellelinjer PCA (PC3 og DU145) sammenlignet med RWPE-1 celler (PC3 3,35-fold, DU145 6,47-fold) (Fig. 2A). For å bekrefte microarray data, vi utførte TaqMan kvantitativ real-time PCR-analyse og observerte at hotair uttrykk var signifikant nedregulert med genistein behandling (Fig. 2B). Dermed har vi fokusert på hotair fordi mange etterforskere har rapportert at hotair har en onkogen funksjon i flere andre kreftformer (bryst, lever, bukspyttkjertel, kolorektal kreft og strupe plateepitelkarsinom) [29] -. [33]
( A) uttrykk for hotair i PCA cellelinjer (LNCaP, PC3 og DU145) og normale prostata epitelceller (RWPE-1). Real-time PCR viste at uttrykket nivåer av hotair ble oppregulert i kastreringsresistent PCA cellelinjer (PC3 og DU145). Data er presentert som gjennomsnitt ± SE. *, P 0,05. (B) Expression nivåer av hotair etter behandling med genistein (25 mm). Hotair uttrykk redusert med 30-40% i genistein behandlede celler sammenlignet med kontroller. Hotair uttrykk ble normalisert til GAPDH. *, P 0,05. (C) Uttrykk for MIR-34a i PCA cellelinjer (PC3 og DU145) og normal prostata epitelceller (RWPE-1). Real-time PCR viste at uttrykket nivåer av MIR-34a ble nedregulert i kastreringsresistent PCA cellelinjer (PC3 og DU145). MIR-34a uttrykk ble normalisert til RNU48. (D) Expression nivåer av MIR-34a etter behandling med genistein (25 mm) i DU145 celle. P . 0,05
Regulering av hotair Expression i PCA cellelinjer av MIR-34a
Nylig ble det rapportert at noen mirnas regulerer uttrykket av lncRNAs [35] – [37]. Hvis du vil søke etter potensielle mirnas som regulerer hotair, brukte vi miRcode algoritme. I flere kandidat mirnas målretting hotair, fokuserte vi på MIR-34a siden vår lab har tidligere blitt rapportert fungerer som en tumor suppressor og er nedregulert i PCA vev [38]. For å bestemme de relative uttrykk nivåer av MIR-34a i prostata celler, utførte vi kvantitativ real-time PCR ved hjelp av PCA cellelinjer (PC3 og DU145) og sammenlignet dem med normale prostata epitelceller (RWPE-1). Vi observerte at MIR-34a ekspresjon ble betydelig nedregulert i kastrerings-resistente cellelinjer PCA (PC3 og DU145) sammenlignet med RWPE-1 celler (PC3 0,22-fold, DU145 0,14-fold) (Fig. 2C). For å søke etter effekten av genistein i Mir-34a uttrykk, utførte vi TaqMan kvantitativ real-time PCR-analyse og observerte at Mir-34a uttrykk var signifikant oppregulert med genistein behandling i DU145 cellene (1,36 ganger) (Fig. 2D) .
for å bekrefte bindingen av MIR-34a til hotair, utførte vi luciferaserapportørplasmid analyser. Hotair har en spådd bindingssete for MIR-34a (fig. 3A) som vi klonet inn i en luciferase reporter analysen vektor. Luciferase reporter-analyser viste at MIR-34a reduserte relative luciferase-aktivitet av villtype-vektor (Fig. 3B). Mutasjon av de antatte MIR-34a bindingssteder også redusert respons på MIR-34a indikerer at Mir-34a binder direkte til hotair. Kvantitativ real-time PCR-analyse viste at uttrykket nivåer av hotair i PC3 og DU145 ble undertrykt i Mir-34a transfektanter sammenlignet med kontrollene (fig. 3C).
(A) Antatte MIR-34a bindende og muterte steder i hotair. (B) luciferaserapportørplasmid analyser ved hjelp av vektorer som koder antatte bindingssteder. PC3 og DU145-celler ble transient transfektert med Pre-MIR miRNA forløper eller negativ kontroll, fulgt av transient transfeksjon med grunnleggende vektor eller villtype rapportør plasmider eller muterte plasmider i 24 timer. Reporter-aktivitet ble målt ved hjelp av luciferase-analysen og normalisert til aktiviteten av Renilla luciferase. Data er presentert som gjennomsnitt ± SE. *, P 0,05. (C) Ekspresjonsnivået av varmluft ble bestemt ved kvantitativ real-time PCR-analyser etter transfeksjon med MIR-34a etterligner og negativ kontroll i PCA-cellelinjer (PC3 og DU145). Hotair uttrykk ble normalisert til GAPDH. *, P . 0,05
In vitro og in vivo Effekt av hotair på PCa celleproliferasjon, migrasjon og invasjon
For å undersøke den funksjonelle rollen hotair, vi utførte taps of-funksjon studier med si-RNA knockdown med PC3 og DU145 cellene. Vi innledningsvis begrenset at ekspresjon av varmluft ble markert undertrykket i si-RNA-transfektantene sammenlignet med kontroller (fig. 4A). Celleproliferasjon (fig. 4B) og sårheling assay (fig. 4C) viste signifikant inhibering i si-hotair transfektanter i både PC3 og DU145-celler sammenlignet med kontroll transfektanter. Invasjon assay (Matrigel) viste også at antallet av invaderende celler ble signifikant redusert i Si-hotair transfektanter sammenlignet med sine motparter kontroll (fig. 4D). For å bekrefte effekten av hotair på tumorigenicity in vivo, ble hotair siRNA og si-kontroll-transfekterte DU145 cellene subkutant injisert i nakne mus. Vi observerte at knock-down av hotair uttrykk hemmet DU145 celletumordannelse in vivo (fig. 4E). Disse resultatene tyder på at hotair spiller en viktig rolle ved PCA celle progresjon.
(A) hotair uttrykk nivåer i PCA cellelinjer (PC3 og DU145) ble bestemt ved real-time PCR 96 timer etter transient transfeksjon av siRNA . Genekspresjon ble normalisert til GAPDH. Data er presentert som gjennomsnitt ± SE. **, P 0,0001. *, P 0,0005. (B) knockdown av hotair hemmer celle levedyktighet betydelig. Cellenes levedyktighet ble analysert ved MTS-celleproliferasjonsanalyse 96 timer etter forbigående transfeksjon. (C) knockdown av varmluft inhiberer cellemigrering betydelig. Etter transfeksjon (48 timer), ble et sår dannet ved skraping og måles etter 24 timer. Representative bilder av sårtilheling analyse er vist 200 × forstørrelse. **, P 0,0001. (D) knockdown av varmluft betydelig redusert celle invasjon. Representative bilder av invasjonen analysen er vist 200 × forstørrelse. **, P 0,0001. (E) Representative bilder av svulster i nakne mus 5 uker etter subkutan injeksjon av transfekterte hotair siRNA DU145 cellelinjer eller kontrollcellelinjer og tidsforløpet av tumorvekst.
hotair Påvirker Cellular apoptose og Cell Cycle i PCA Cells
apoptose analysen viste at knock-down av hotair betydelig indusert apoptose i både PC3 og DU145 celler (fig. 5A). Cellecyklus-analyse viste at knock-down av varmluft forårsaket G2 /M-fase cellesyklusarrest i PC3-celler (fig. 5B), mens DU145-celler transfektert hadde en signifikant økning i S-fasen av cellesyklusen.
( A) Apoptose-analyse ved hjelp av flow cytometri. Representative kvadrant figurer av kontroll og si-hotair behandlede celler i PC3 (øverst) og DU145 (lavere) celler. **, P 0,005. *, P 0,05. (B) Typiske tall for cellesyklusanalyse av kontroll, eller Si-hotair behandlede celler er vist. Stolpediagrammet er vist på høyre side av hver figur representerer prosentandelen av cellene i G0 /G1, S eller G2 /M fase som indikert. **, P 0,001. *, P . 0.005
Diskusjoner
proteinkodende gener utgjør bare en liten del av genomet, og resten består av ncRNAs, introner og /eller andre sekvenser som ingen funksjoner har ennå blitt tildelt [39]. NcRNAs (mirnas og lncRNAs) har blitt vist å spille en avgjørende rolle i regulering av cellulære prosesser som cellevekst og apoptose i normale og maligne celler. Rollene som mirnas i kreft har blitt grundig undersøkt og nylig, har mange lncRNAs vært forbundet med utvikling og progresjon av kreft. Uttrykket av lncRNAs endres ofte i løpet av malign transformasjon og ncRNAs er fremstår som viktige molekyler i kreft hos mennesker, med potensial til å tjene som en roman markører og terapeutiske mål. Men til dags dato den rollen bare noen få lncRNAs har vært preget ved PCA. High-throughput-sekvensering viste at prostata cancer-assosiert ncRNA transkripsjon 1 (PCAT-1) er en prostata-spesifikt regulator av celleproliferasjon i PCa og et mål av PRC2 [40]. Prostatakreft genuttrykk markør 1 (PCGEM1) polymorfisme kan bidra til PCa risiko [41]. Uttrykk for PlncRNA-en er betydelig høyere ved PCA og dette lncRNA regulerer celleproliferasjon og apoptose gjennom målretting androgen reseptor [42]. I denne studien har vi fokusert på lncRNAs regulert av genistein i PCA celler og identifisert hotair i uttrykket profilen til disse lincRNAs.
I denne studien fant vi høy uttrykk for hotair i kastreringsresistent PCA cellelinjer. Våre funksjonelle analyser viste at knockdown av varmluft redusert PCa celleproliferasjon in vitro og in vivo, og induserte apoptose. Derfor hotair kan spille en funksjonell rolle i tumorcellevekst i PCa. Økende bevis tyder på at hotair regulerer viktige veier i kreft invasjon og metastasering. Hotair økt brystkreft invasivitet og metastase ved å fremkalle positive regulatorer av kreft metastase (ABL2 SNAIL, LAMB3 og LAMC2) på en måte avhengig av PRC2 [29]. Høy hotair uttrykk er en risiko for tilbakefall etter hepatectomy i leverkreft og kan regulere MMP9 og VEGF gener [34]. Våre funksjonelle analyser viste at knockdown av hotair redusert PCa celle migrasjon og invasjon. Våre mRNA array-data og bioinformatiske analyse viste også at genistein er rettet mot MMP9 og VEGF-gener som er komponenter i KEGG «Pathway i kreft «. Disse resultatene indikerer at varmluft kan spille en viktig rolle i progresjon PCa.
Som genet regulatorer, mirnas binder seg til 3’UTR av mRNA, og kan målrette et antall av protein-kodende gener. Imidlertid er det fortsatt ikke bestemt om mirnas kan også målrette lncRNAs. Nylig har noen studier beskrevet samspillet mellom mirnas og lncRNAs. MIR-29 indirekte regulerer uttrykket av tumor suppressor lncRNA, mordyret uttrykt 3 (MEG3) ved å handle på sin metylering i hepatocellulær kreft [35]. MIR-671 dirigerer spalting av en antisense avskrift av lillehjernen degenerasjon relaterte protein 1, 34 kDa (CDR1), som fører til en samtidig reduksjon i CDR1 [37]. I denne studien, så vi for å se om MIR-34a konsekvenser lncRNA uttrykk. Vår luciferase reporter analysen og real-time PCR resultater viste at Mir-34a binder seg til hotair mRNA sekvens og nedregulerer hotair uttrykk i PCA cellelinjer. Derfor denne studien er den første til å vise at MIR-34a rettet direkte hotair både PC3 og DU145 PCA celler.
I konklusjonen, våre resultater viser at genistein hemmer PCa cellevekst gjennom nedregulering av onkogene hotair som er målrettet av tumor suppressor MIR-34a. Disse funnene forbedre vår forståelse av hvordan genistein samhandler med lncRNA ved PCA og indikerer flere potensielle mål for PCa terapi.
Materialer og metoder
Cell Kultur
Menneskelig PCA cellelinjer, LNCaP, PC3 og DU145 og en ikke-ondartet epithelial prostatacellelinje, RWPE-en, ble kjøpt fra The American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). PCA-cellelinjene ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) i en fuktet atmosfære av 5% CO2 og 95% luft ved 37 ° C. RWPE-1-cellelinjen ble dyrket i keratinocytt-vekstmedium supplert med 5 ng /ml human rekombinant epidermal vekstfaktor og 0,05 mg /ml bovint hypofyseekstrakt (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Subkonfluente celler (60% -70% konfluent) ble behandlet med genistein (25 mikromol /L, Sigma, St. Louis, MO, USA) og celler behandlet med kjøretøy (dimetylsulfoksyd) fungerte som kontroll. Celle media og genistein ble endret hver dag og cellene ble dyrket i 4 dager.
RNA Utvinning
Total RNA ble ekstrahert fra PCA cellelinjer og en ikke-ondartet epithelial prostatacellelinje ved hjelp av et miRNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
Mikromatrise
for microarray, ble total RNA hentet fra PC3 og DU145 celler behandlet med genistein ved hjelp av en miRNeasy Mini Kit . SurePrint G3 Menneskelig GE 8 × 60K Mikromatrise (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) ble brukt til uttrykk profilering av genistein behandlet og kontrollceller. De nåværende microarray data ble godkjent av GEO, og ble tildelt GEO tiltredelse antall GSE47657.
Kvantitativ Real-time PCR
Hentet total RNA ble revers transkribert til enkelttrådet cDNA ved hjelp av en iScript cDNA syntese Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) og en TaqMan mikroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Kvantitativ real-time PCR-analyse ble utført med en Applied Biosystems Prism7500 rask rekkefølge Detection System bruker TaqMan universell PCR Master Mix i henhold til produsentens protokoll (Applied Biosystems). Nivåer av RNA uttrykk ble bestemt å bruke 7500 Fast System SDS programvareversjon 1.3.1 (Applied Biosystems). PCR-parametrene for sykling var som følger: 95 ° C i 20 sekunder, 40 sykluser med PCR ved 95 ° C i 3 sekunder og 60 ° C i 30 sekunder. Alle reaksjoner ble gjort i en 10-mL reaksjonsvolumet i tre eksemplarer. Dataene ble analysert med delta-deltaet Ct metode for å beregne fold-endring. TaqMan prober og primere for varmluft (analyse ID: Hs03296680_s1), GAPDH (analyse ID: Hs02758991_g1), MIR-34a (analyse ID: 000 426), og RNU48 (Assay ID: 001 006) ble oppnådd fra Applied Biosystems. GAPDH og RNU48 ble brukt som intern kontroll
Transfeksjon
hotair siRNA (SASI_Hs02_00380445 og SASI_Hs02_00380446, Sigma) og negativ kontroll siRNA (D-001810-10;. Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ble anvendt i tap-av-funksjon eksperimenter. Pre-MIR miRNA forløper og negativ kontroll (Applied Biosystems) ble anvendt i gain-of-funksjon eksperimenter. PC3 og DU145 cellene ble transient transfektert hjelp Lipofectamine 2000 transfeksjon reagens (Invitrogen), i henhold til produsentens anbefalinger.
Cell Proliferation, migrering og invasjon Analyser
Celleproliferering ble målt ved hjelp av en CellTiter 96 vandige løsning Cell Proliferation Assay (MTS) kit (Promega, Madison, WI, USA) utført i henhold til produsentens instruksjoner. Celleformering ble bestemt ved absorbansmålinger ved 490 nm ved bruk av Spectramax 190 (Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, USA). Cellemigrering aktivitet ble evaluert ved sårhelende analysen. Celler ble sådd ut i seks-brønners skåler, og cellemonolagene ble skrapet ved anvendelse av en P-20 mikropipette spissen. Bredden av det første gap (0 h), og det gjenværende gap 24 timer etter at såret ble beregnet fra mikrofotografier. Celle invasjon analysen ble utført ved å bruke modifisert Boyden kamre som består av Transwell-forbelagt Matrigel membranfilterinnsatser med åtte mikron porer i 24-brønners vevskulturplater (BD Biosciences, Bedford, MA, USA). Minimum essential medium inneholdende 10% FBS i det nedre kammer tjente som kjemoattraktant, som tidligere beskrevet [43]. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer.
In vivo tumorvekst
Alle dyr omsorg ble i samsvar med retningslinjene i San Francisco Veterans Affairs Medical Center og studien ble godkjent av San Francisco VA IACUC (protokoll nummer~~POS=HEADCOMP: 11-008-01). Animal brukere har fullført opplæringsprogrammer for å håndtere og arbeide med mus gjennom AALAS (American Association for Laboratory Animal Science) før dyreforsøk. For subkutan xenograft mus modell, DU145 celler (5 × 10
6) som ble transient transfektert med SI-hotair eller si-kontroll ble suspendert i 100 mL RPMI 1640 medium og subkutant injisert i venstre og høyre back flankene av kvinnelige nakne mus, henholdsvis. (Stamme BALB /c nu /nu; Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA, USA, 5 uker gamle). Totalt 4 nakne mus ble anvendt og tumorvekst ble undersøkt i løpet av 35 dager. Tumorvolumet ble beregnet på basis av bredde (x) og lengde (y):. X
2y /2, der x y
apoptose og cellesyklus Assays
Fluorescence- aktivert cellesortering (FACS) analyse for apoptose ble utført 96 timer etter transfeksjon, ved hjelp av en Annexin V-FITC /7-AAD Kit (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Cellesyklus analyse ble utført 96 timer etter transfeksjon. Cellene ble høstet, vasket med kald PBS og suspendert på nytt i den kjernefysiske flekk 49,6-diamidino-2-fenylindol (Beckman Coulter). Fargede celler ble umiddelbart analysert med et strømningscytometer (Cell Lab Quanta SC, Beckman Coulter).
Identifikasjon av Genistein Regulert målgener og bioinformatiske analyse
For å søke etter gener som er regulert av genistein, vi utførte microarray. For å identifisere de biologiske prosesser eller som potensielt regulert av genistein, utførte vi GeneCodis analyse [44], [45] med alle kandidatgener. Så, for å identifisere nettverkene blant genistein og deres mål gener, vi analysert og preget disse genene i GO biologisk prosess og KEGG pathway kategorier. Disse data ble brukt for å undersøke genistein regulerte molekylære nettverk i menneskeceller. Vi utførte genuttrykk analyser av alle kandidatgener involvert i hver av banene ved hjelp av microarray expression data, som ble godkjent av GEO og ble tildelt GEO deponeringsnummer (GSE29079). I Affymetrix Menneskelig Exon 1,0 ST Array (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) datasett, undersøkte vi 47 PCA vev og 47 normale prostata vev, som alle ble samlet inn fra pasienter som ikke hadde blitt utsatt for neo-adjuvant radio-, cytotoxic- eller endokrin terapi før operasjonen. Dataene ble normalisert og analysert med GeneSpring (Agilent Technologies). Statistiske analyser ble utført med Mann Whitney U-test med cut-off P. 0,05, og resultatene er vist som et varmekart diagram
Plasmid Bygg og Dual-luciferaserapportørplasmid Analyser
for å søke etter miRNA mål for hotair brukte vi miRcode algoritmen (slipp 6.2, https://www.mircode.org/). MiRcode gir menneskelige miRNA målet spådommer basert på omfattende GENCODE genet merknaden [46], inkludert 10.000 lange ikke-kodende RNA gener. For luciferase reporter analysen ble PmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Ekspresionsvektor brukes (Promega). Oligonukleotid-sekvensene (villtype) som brukes er vist i tabell S3. Vi har også konstruert muterte oligonukleotider for hver av de villtype oligonukleotider (tabell S3). I et totalvolum på 25 ul, 1 pl av hver av 100 uM forover- og revers oligonukleotid, 2,5 ul 10 x annealing-buffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M NaCl og 10 mM ethylendiamintetraeddiksyre) og 20,5 pl vann var inkubert ved 95 ° C i 3 minutter og deretter plassert ved 37 ° C i 15 min. Oligonukleotidene ble ligert inn i PmeI-XbaI stedet pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Ekspresionsvektor. For luciferase reporter analysen, PCA celler ble ko-transfektert med Pre-MIR miRNA forløper og pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target ekspresjonsvektorer bruker Lipofectamine 2000 (Invitrogen) og X-tremeGENE HP DNA Transfeksjon Reagens (Roche diagnose, Basel, Sveits, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Luciferase reporter analysen ble utført ved hjelp av Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem (Promega) 24 timer etter transfeksjon.
Statistical Analysis
Forholdet mellom to variabler og de numeriske verdiene oppnås ved real-time RT -PCR ble analysert ved anvendelse av parametriske Mann-Whitney U-test. Alle analyser ble utført ved anvendelse av Statview Expert (versjon 4, SAS Institute Inc.). Data er vist som middelverdier ± standardfeil. I sammenligningen mellom tre variabler, en nonadjusted statistisk signifikansnivå på P 0,05 tilsvarer en Bonferroni justert nivå på P . 0,0167
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1. Antatte genistein regulert gener i «Pathway i kreft». Den antatte genistein regulerte gener (uthevet i rødt) som definert av Kyoto Encyclopedia of gener og genomer (KEGG) sti og fastsatt gjennom GENECODIS analyse
doi:. 10,1371 /journal.pone.0070372.s001 plakater (TIF)
Figur S2. Varmen kart diagram av de «Pathways i kreft». Analyse viser prostata kreft vev (n = 47) og normal prostata prøver (n = 47). Hver rute representerer ekspresjonsnivået av et gitt gen i en enkelt prøve. Rød representerer økt ekspresjon og blå representerer redusert ekspresjon i forhold til den normaliserte ekspresjon av genet i alle prøvene
doi:. 10,1371 /journal.pone.0070372.s002 plakater (TIF)
tabell S1. Gener nedregulert av genistein
doi:. 10,1371 /journal.pone.0070372.s003 plakater (XLS)
Tabell S2.
