Abstract
Wilms «tumor suppressor gen (WT1) har blitt identifisert som et onkogen i mange ondartede sykdommer som leukemi, brystkreft, mesothelioma og lungekreft. Men rollen som WT1 i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) kreftutvikling er fortsatt uklart. I denne studien har vi sammenlignet WT1 mRNA nivåer i NSCLC vev med paret tilsvarende tilstøtende vev og identifisert betydelig høyere uttrykk i NSCLC prøver. Cell spredning av tre NSCLC cellelinjer positivt korrelert med WT1 uttrykk; Dessuten ble disse forbindelser funnet i begge cellelinjer og en xenograft musemodell. Videre har vi vist at opp-regulering av Cyclin D1 og fosforylert retinoblastom protein (p-pRb) ble mekanistisk relatert til WT1 akselererende celler i S-fase. I konklusjonen, våre funn viste at WT1 er et onkogen og fremmer NSCLC celleproliferasjon med opp regulerende Cyclin D1 og p-pRb uttrykk
Citation. Xu C, Wu C, Xia Y, Zhong Z, Liu X Xu J et al. (2013) WT1 Fremmer Cell Proliferation i ikke-småcellet lungekreft cellelinjer gjennom Up Regulerende Cyclin D1 og p-pRb In vitro og in vivo. PLoS ONE åtte (8): e68837. doi: 10,1371 /journal.pone.0068837
Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 28 desember 2012; Godkjent: 04.06.2013; Publisert: 01.08.2013
Copyright: © 2013 Xu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Natural Science Foundation National Kina [81170158] (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft fortsetter å være et stort folkehelseproblem i både menn og kvinner, det er for øyeblikket den krefttypen med høyest dødelighet på verdensbasis. Forekomsten har økt raskt på grunn av omfattende tobakksrøyking [1] – [3], og i Kina har det vært en 26,9% økning hos menn og 38,4% for kvinner i løpet av de siste fem årene [4]. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) omfatter flere histologiske undergrupper, adenokarsinom, squamous celle, og storcelle karsinom, som utgjør 80-85% av den totale forekomst, mens de resterende tilfeller omfatte mer distinkt gruppe av små-celle lungekreft ( SCLC) [2], [5] – [7]. I denne studien har vi fokus på rollen WT1 i utvikling og kreftutvikling av NSCLC.
Wilms tumor gen (WT1) som ligger på 11p13q, koder for et 52-54 kDa protein som inneholder fire sink finger transkripsjonelle faktorer og ble først identifisert som et tumorsuppressorgen i nefroblastom eller Wilms «tumor, en pediatrisk nyrekreft [8], [9]. Overekspresjon av dette genet ble også oppdaget i flere leukemier og faste tumorer, som brystkreft, lungekreft og mesothelioma, og det ble antatt at dette genet spiller en rolle oncogent [10], [11]. Oji Y et al antydet at WT1 spiller en viktig rolle i veksten av normale lungeceller; overekspresjon av WT1 forstyrre vekst og differensiering av normal lungeceller og, i henhold til sine funn, føre til lungekreft [11]. WT1 har vist seg å spille en rolle i reguleringen av celleproliferasjon og apoptose i mange biologiske og patologiske mekanismer. Nylig har det blitt undersøkt som et potensielt mål for immunterapi i mange krefttyper, inkludert NSCLC og mesothelioma [12].
Signal sensorer og aktivatorer av transkripsjon 3 (STAT3) har blitt rapportert å være overuttrykt i mange humane maligniteter og aktiveres av forskjellige cytokiner og vekstfaktorer i løpet av kreftutvikling og progresjon [13], [14]. Det har blitt demonstrert at STAT3 fremmer kreftcellevekst via opp-regulering av gener som koder for apoptose-inhibitorer, slik som MCL-1 og Bcl-XL og celle-syklus regulatorer, inkludert de cykliner D1 /D2 og c-Myc [13] – [17 ]. Interessant Rong et al viste holdepunkter for at WT1enhanced den transkripsjonelle aktivitet av fosforylert STAT3 (p-STAT3) som fører til synergistisk oppregulering av nedstrøms gener inkludert cyklin D1 og Bcl-xL, i musefibroblaster, melanoma og hepatiske celler, så vel som humane embryonale nyre celler [18]. Imidlertid WT1 har ikke tidligere blitt rapportert i lungecancercellelinjer.
I denne studien vi forsøkte å identifisere ekspresjon av WT1-proteinet i NSCLC-prøvene sammenlignet med tilstøtende vev, undersøke spredning fremme funksjon av WT1 in vitro og in vivo og identifisere sitt forhold til p-STAT3 transcriptional aktivering.
Materialer og metoder
Pasienter
NSCLC og tilsvarende tilstøtende vev inkludert i denne studien ble hentet fra 85 år på rad pasienter som hadde de novo sykdom og gjennomgått kirurgisk reseksjon. De ble tatt mellom desember 2010 og april 2011 kl First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University (Nanjing, Kina). Riktig diagnose ble vurdert av en erfaren patolog og iscenesettelse av NSCLC etter en klinisk onkolog i henhold til den internasjonale foreningen for studier av lungekreft (IASLC) syvende TNM-klassifisering. Nærliggende vev var lokalisert innenfor 3 cm fra kanten av svulstvev.
RT-PCR
RNA ble hentet fra snap-frosne vev og NSCLC cellelinjer ved hjelp Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA , USA) etter fremgangsmåten til fremstilling protokoll. RNA-konsentrasjoner og kvaliteter ble undersøkt ved Beckman Coulter DU800 spektrofotometer (Beckman, Brea, CA, USA). cDNA ble syntetisert med et Primescript ™ RT reagenssett (Takara, Japan). 12 ul av total-RNA blandet med 8 ul Primescript-buffer og 20 ul DEPC-behandlet vann ble inkubert ved 37 ° C i 15 min, 85 ° C i 5 s og lagret ved 4 ° C inntil bruk.
QRT -PCR
ABI Prism7500 Sequence Detector System (ABI, USA) ble anvendt for å bestemme det relative nivået av mRNA i tumorvev og tilstøtende vev. Kvantitativ real-time polymerase chain reaction (QRT-PCR) analyse for WT1 og β-aktin ble utført med SYBR® Premiks ExTaq ™ (Takara, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. PCR ble utført ved anvendelse av 10 ul 2 x Premix-buffer, 0,5 ul av hver 5 «og 3» primer, og 1 ul prøver eller destillert vann til et sluttvolum på 20 ul. Hver ampulle ble denaturert ved 95 ° C i 1 min. denaturert ved 95 ° C i 15 sek, glødet ved 60 ° C i 15 sek og forlenget ved 72 ° C i 30 sek ved å bruke de følgende primere: WT1 forover primer, 5’GCTATTCGCAATCAGGGTTACAG3 «; WT1 revers primer, 5’TGGGATCCTCATGCTTGAATG3 «. β-aktin fremover primer, 5’CCCAGCACAATGAAGATCAAGATCAT3 «; p-aktin reverse primer: 5’ATCTGCTGGAAGGTGGACAGCGA3 «; ved enden av forlengelsesfasen, ble fluorescensdeteksjon utført. Å diskriminere spesifikk fra ikke-spesifikke cDNA-produkter, ble et smeltekurve oppnådd ved slutten av hver kjøring.
Cell Culture
A549, H1299, H1650 og 293T cellelinjer (ATCC) ble anvendt for denne studien. A549, H1299 og H1650 ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), mens 293T ble dyrket i DMEM høy glukose-medium supplert med 10% føtalt bovint serum. Alle celler ble opprettholdt i en fuktet 37 ° C inkubator med 5% CO
2.
Lentivirus Produksjon og Transduksjon
WT1A (-17aa-KTS isoform) genet, ble syntetisert (innkjøpt fra GenScript, Piscataway, NJ) med restriktiv fordøyelse ved hjelp Mlu i og subklonet PLV-GFP plasmid (gave fra D. Beicheng Sun, Universitetet i Nanjing Medical University, Kina), og er oppkalt PLV-GFP-WT1. For å generere plasmid som uttrykker WT1-shRNA, ble dobbelt-strandet oligonukleotider klonet inn pLL3.7 vektor (gave fra D. Yun Chen, Universitetet i Nanjing Medical University, Kina) og er oppkalt pLL3.7-WT1-shRNA. Sekvensene av WT1-shRNA brukes er aac TCAGGGTTACAGCACGGTC ttcaagaga GACCGTGCTGTAACCCTGA tttttt c. De store bokstaver representerer WT1 bestemt rekkefølge og små bokstaver representerer hårnål sekvenser. Rekombinant lentivirus ble generert fra 293T-celler ved bruk av kalsiumfosfat utfelling. A549, ble H1299, H1650 transfektert med lentivirus ved hjelp av polybren (8 ug /ml). Representative bilder av villtype og transfekterte celler er vist i figur S1.
Western-blotting-analyse
Proteiner ble ekstrahert fra dyrkede celler og muse vev, kvantifisert ved anvendelse av en proteinanalyse (BCA-metoden, Beyotime, Kina). Proteiner ble fraksjonert ved hjelp av SDS-PAGE, overført til PVDF-membran, blokkert i 4% tørrmelk ved romtemperatur i 1 time, og immunfarget med primære antistoffer ved 4 ° C over natten ved anvendelse av anti-WT1 (1:1000, 6F-H2, Millipore, USA), anti-STAT3 /p-STAT3 (1:2000, Cell Signal Technology, Beverly, MA, USA), anti-cyclin D1 (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Delaware Avenue, CA, USA), anti-p -pRb (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), anti-caspase3 (1:3000, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-BCL-2L (1:1000, Abcam, Cambridge, MA , USA) og anti-GAPDH (1:1000, Kangchen, Kina). Resultatene ble visualisert via en kjemiluminescerende deteksjonssystem (Pierce ECL Underlag Western blot deteksjonssystem, Thermo, Pittsburgh, PA, USA) og eksponert i Molecular Imager ChemiDoc XRS System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
Celletelling leder-8 (CCK-8) Assay
celler ble sådd ut i 96-brønns plater (6,0 x 10
3 celler /brønn). Celleviabilitet ble vurdert av CCK-8 analysen (Beyotime Institutt for bioteknologi, Kina). Absorbansen for hver brønn ble avlest på et spektrofotometer (Thermo, Pittsburgh, PA, USA) ved 450 nm (A450). Tre uavhengige eksperimenter ble utført i quintuplicate.
flowcytometrisk analyse
flowcytometrisk analyse ble tatt for å oppdage apoptose og cellesyklus status. Cellene ble høstet, vasket to ganger og resuspendert i 100 ul PBS inneholdende 3 mL av annexin V og 3 mL av PI (KeyGen, Kina) i henhold til produsentens anbefaling. Den apoptose datainnsamling og analyse ble utført av flowcytometri anlegget (BD Biosciences, San Jose, California).
Cellesyklus analyse ble vurdert av DNA innholdet som ble oppdaget ved hjelp av flowcytometri anlegget (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Etter å ha oppsamlet ved trypsinering ble cellene suspendert med 70% etanol og oppbevart ved 4 ° C i 30 minutter. Filtrert gjennom mesh, og DNA-innhold av de fargede kjerner ble analysert. Alle forsøkene ble utført tre ganger for å sikre resultater Faktisitet.
tumorigenicity i hårløse mus
For å undersøke effektene av WT1 på tumorvekst in vivo, vi etablerte xenograft modell i 4-uke- gamle Balb /c
nu /nu mus. Vi ansatt 90 Balb /c
nu /nu mus (kjøpt fra modell dyreforsøk sentrum av Nanjing University i Kina) i denne studien, og delte dem inn i 5 grupper tilfeldig (n = 6 per gruppe) for hver cellelinje (A549 /H1299 /H1650). Alle celler ble tripsinized og resuspendert med 100 ul av PBS (inneholdende 50 ul Matrigel) henholdsvis og subkutant injisert i armhulen av hver naken mus (5 x 10
6 celler per mus). En uke etter injeksjon, ble tumorer dimensjoner målt hver 4. dag, og etter en måned alle musene avlivet og tumorene ble oppnådd (fig S2). Volumet ble beregnet ved hjelp av følgende formel: volum = lengde × bredde
2 × 0,5
Immunohistochemistry
Vev ble fiksert i 4% paraformaldehyde og kuttet fra parafin blokk til 5 mikrometer tykkelse.. Etter awoksing med xylen og rehydratisering med en gradert serie av etanol, ble platene oppvarmet i en autoklav i tre minutter ved bruk av citrat-buffer (pH 6,0) og inkubert med primært antistoff WT1 (1:100, 6F-H2, Millipore, USA), p-STAT3 (1:400, Cell Signal Technology, Beverly, MA, USA), cyclin D1 (01:50, Santa Cruz Biotechnology, Delaware Avenue, CA, USA) og p-pRb (1:100, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) ved 4 ° C over natten. Blokkering serum eller antistoff-fortynningsbuffer ble fremstilt som negative kontroller. De primære antistoffene som ble brukt var de samme som for Western blot-analyse. Bildene er tatt av microcope (Nikon, ECLIPSE 50i) og programvare NIS-Elements v4.0. Gjennomsnittlige verdier av integrert optisk tetthet (IOD) ble hentet fra fem tilfeldige felt per lysbilde ved hjelp av Image-Pro Plus-programvare (v5.0). Alle data ble påvist tre ganger minst.
Statistical Analysis
Data ble presentert som gjennomsnitt ± SD basert på tre adskilte eksperimenter. Den t-test, ANOVA og tosidig Fisher eksakte test ble anvendt for å evaluere den statistiske signifikans av forskjellene i alle relevante forsøk. En verdi på P 0,05 ble ansett som statistisk signifikans, og P 0,001 ble vurdert som svært viktig. Alle statistiske analyser ble analysert ved hjelp av SPSS programmet v17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA).
Resultater
1. WT1 mRNA nivåer ble overuttrykt i NSCLC Prøver
Vi har undersøkt 85 par av NSCLC og tilsvarende tilstøtende prøver ved hjelp av immunhistokjemi og real-time PCR. De kliniske karakteristika for pasientene er vist i tabell S1. WT1 uttrykk i tumorer var betydelig høyere i forhold til tilstøtende vev. Representative bilder er vist i figur 1A. Statistisk analyse av IOD verdier av 85 objektglass farget med WT1 er vist i histogrammet på figur 1B (* p 0,05). Som vist på figur 1C, ble mRNA nivået av WT1 betydelig overuttrykt i NSCLC-prøver (** p 0,001). I tillegg våre funn indikerte at WT1 mRNA nivået var forbundet både med tumor mot normalt og med tumor stadium, se tabell S1 (** p 0,001). Samlet utgjør disse resultatene er i samsvar med tidligere funn som viser at høyere uttrykk av WT1 er assosiert med NSCLC.
A, Immunhistokjemisk farging av WT1 i tumor (til venstre) og tilstøtende (høyre) prøver. B, Gjennomsnittlig verdi av integrert optisk tetthet (IOD) ble vurdert ved å analysere fem felt per lysbilde og registrert i histogrammet. C, Real-time PCR-analyse av WT1 mRNA nivå i svulsten og tilstøtende vev i forhold til p-aktin. Data er representert som gjennomsnitt ± SD.
* P 0,05,
** P. 0,001
2. WT1 uttrykk Fremmes levedyktighet av NSCLC cellelinjer in vitro
For å finne en WT1-shRNA som kunne effektivt ned-regulere uttrykket av WT1 hos NSCLC cellelinjer, tre kandidat WT1-shRNA (tabell S2) ble syntetisert og testet ved hjelp av Western-blot analyse og real-time PCR. Vi fant ut at WT1-shRNA3repressed uttrykk for WT1 i A549 /H1299 /H1650 med maksimal effektivitet (Figur 2A). Da vi har oppdaget at ekspresjonen av WT1 i alle cellelinjer for å bekrefte lentivirus ved Western-blot-analyse og real-time PCR. Vi fant at uttrykket av WT1 i A549 /H1299 /H1650 transduced med pLL3.7-WT1-shRNA var mye lavere i forhold til kontrollene; samtidig uttrykk for WT1 i A549 /H1299 /H1650 transduced med PLV-GFP-WT1 var mye høyere sammenlignet med kontrollene. Vi har også funnet at de to vektorer (pLL3.7-WT1 og PLV-GFP) hadde ingen effekt på ekspresjonen av WT1 (figur 2A og figur S3). Deretter gjennomførte vi CCK-8-analyse for å teste levedyktighet; Resultatene indikerte at overekspresjon av WT1 forbedret celle-levedyktighet, mens nedregulering av WT1 oppviste den motsatte effekt og avviket var stadig tydeligere over tid (figur 2B). Derfor er disse funnene indikerte at WT1 fremmet NSCLC celleviabilitet in vitro.
En WT1 uttrykk for NSCLC villtype celler og NSCLC celler transfektert med lentivirus inneholder pLL3.7 (GFP1), PLV-GFP (GFP2), pLL3.7-WT1-shRNA (WT1-shRNA1, WT1-shRNA2, WT1-shRNA3) og PLV-GFP-WT1 (WT1) ved western-blot. B, Levedyktigheten til NSCLC-celler, ble vurdert ved CCK-8-analyse: overekspresjon av WT1 fremmer cellelevedyktigheten mens hemming av WT1 uttrykk reduserer effekten. Data er representert som gjennomsnitt ± SD.
* P 0,05,
** P. 0,001
3. WT1 uttrykk Akselerert S-fase Entry of Cell Cycle av Up regulerende Cyclin D1 og p-pRb Protein
For å undersøke mekanismen som WT1 fremmet NSCLC celleproliferasjon studerte vi effekten av WT1 uttrykk på cellesyklus via flowcytometrisk analyse. Resultatene viste at andelen av S-fase i WT1 overekspresjon gruppen var høyere sammenlignet med kontrollen, mens den WT1 knockdown gruppen var lavere (figur 3A 0,05,
** P . 0,001
For ytterligere å belyse mekanismen, vi har oppdaget at ekspresjonen av Cyclin D1 og p-pRb, fordi denne aktiviteten er påkrevet for cellesyklus G1 /S overgangen ved Western-blot. Som illustrert i figur 3D, Cyclin D1 og p-pRb protein ble både økt i WT1 overekspresjon celler og redusert i WT1 nedregulert celler. Basert på WT1, forsterket transkripsjonen aktivitet av p-STAT3, og andre funn ved Rong et al, vi har oppdaget aktiviteten til STAT3 og p-STAT3 (S727 og Y705) og funnet ut at fosforylering av både S727 og Y705 ble overexpressed i alle cellelinjer . Men til dags dato er det ingen rapporter som har undersøkt hvorvidt WT1 er forbundet med fosforylering av STAT3. I tillegg har vi også oppdaget apoptose og ikke finner noen effekt av WT1 (figur 3C 3D). Til sammen våre funn tyder på at WT1 akselererer S-fase oppføring av cellesyklusen med inntil regulerende Cyclin D1 og p-pRb protein uttrykk.
4. WT1 uttrykk fremmet Vekst av tumorxenotransplantater in vivo
For å avgjøre om WT1 påvirket NSCLC progresjon in vivo, vi etablert en xenograft tumor modell ved hjelp Balb /c
nu /nu mus. Mus ble subkutant injisert med stabilt PLV-GFP-WT1 og pLL3.7-WT1-shRNA infiserte A549 /H1299 /H1650 celler på et enkelt område, henholdsvis med tomt plasmid og villtype WT1 som kontroller. Som illustrert i figur 4A, fant vi at det var ingen signifikante forskjeller mellom villtype celler og celler transduced med PLV-GFP og pLL3.7-GFP; Dette indikerte at svulsten vekstkurve i cellene transduced med PLV-GFP-WT1 ble markert økt sammenlignet med kontroll, mens svulsten vekstkurve i celler transduced med pLL3.7-WT1-shRNA var betydelig hemmet. Tumorvev hentet fra nakne mus ble presentert i sterkt lys (figur 4B venstre) og in vivo fluorescens bildesystem (figur 4B høyre). Betydelige økninger i tumorvolumet ble funnet ved celler ble transdusert med PLV-GFP-WT1 sammenlignet med villtype-celler; i motsetning til dette tumorvolum av celler transdusert med pLL3.7-WT1-shRNA var betydelig redusert. I tillegg har vi oppdaget at ekspresjonen av WT1-proteinet i tumorer som oppnås fra nakne mus ved Western-blot-analyse. Vi fant at det var det ingen endring i forhold til celler in vitro (figur 2A til høyre og figur 4C). Disse resultatene tyder på at WT1 fremmer vekst av subkutant implantat tumor in vivo.
A, Tumor volum av Balb /c
nu /nu nakne mus 31 dager etter NSCLC-celler injeksjon. B, Tumor vev oppnådd fra nakne mus som presenteres i sterkt lys (venstre) og in vivo fluorescens bilde system. C, WT1 uttrykk i tumorvev fra nakne mus ved Western-blotting-analyse. Data er representert som gjennomsnitt ± SD.
* P 0,05,
** P. 0,001
5. WT1 påvirket Uttrykk for cyclin D1 og p-pRb in vivo
I vivo, vi ytterligere validert våre in vitro resultater der WT1 akselerert S-fase oppføring av cellesyklusen med inntil regulerende Cyclin D1 og p-pRb . Vi undersøkte ekspresjonen av STAT3, p-STAT3 (S727), Cyclin D1 og p-pRb i tumorer som oppnås fra nakne mus via immunhistokjemisk farging og Western-blot-analyse. Som vist på figurene 5A og 5B, er Cyclin D1 og p-pRb nivåene ble øket i WT1 overekspresjon vev i forhold til WT1 nedregulert vev. I mellomtiden, p-STAT3 (S727) ble overuttrykt i begge vev. Statistisk analyse av IOD verdier av tumorvev er vist i histogrammet (figur 5A, p 0,05). Avgjørende Disse funnene tyder på at WT1 fremmer vekst av tumor in vivo, og også avhenger av oppregulering av ekspresjonen av Cyclin D1 og p-pRb.
A, Immunohistokjemisk farging av WT1, p-STAT3 (s727) , Cyclin D1 og p-pRb i WT1 overexpressed (WT1) tumorvev og WT1 nedregulert (WT1-shRNA) tumorvev in vivo. Gjennomsnittsverdien for integrert optisk tetthet (IOD) ble oppnådd som beskrevet ovenfor, viste at ekspresjon av Cyclin D1 og p-pRb var signifikant oppregulert. B, Vest-blotting analyse av uttrykk for WT1, STAT3, p-STAT3 (S727 og Y705), cyclin D1, p-pRb i angitt svulster. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. Data er representert som gjennomsnitt ± SD.
* P. 0,05
6. WT1 uttrykk påvirket Uttrykk for cyclin D1 og p-pRb i NSCLC Prøver
Vi har evaluert sammenhengen mellom WT1 uttrykk og nivået av Cyclin D1 og p-pRb med 85 parafin innebygde menneskelige NSCLC vev glir videre. To tilfeller med forskjellige WT1-ekspresjonsnivåer er vist i figur 6: Tilfelle 1 (sterk positiv) og Tilfelle 2 (svakt positiv). Nivået av Cyclin D1 og p-pRb ble oppregulert i Tilfelle 1 sammenlignet med Tilfelle 2. Som ventet ble p-STAT3 (S727) sterkt farget i både Tilfelle 1 og Tilfelle 2. Dette resultatet støtter hypotesen om at WT1 kan øke ekspresjonen av Cyclin D1 og p-pRb og regulerer cellesyklusen.
Immunohistokjemisk farging av WT1, p-STAT3 (s727), Cyclin D1 og p-pRb in WT1 overekspresjon (sak 1) tumorvev og WT1 lav uttrykk (sak 2) tumorvev in vivo. Gjennomsnittsverdien for integrert optisk tetthet (IOD) ble oppnådd som beskrevet ovenfor, viste at ekspresjon av Cyclin D1 og p-pRb var signifikant oppregulert. Data er representert som gjennomsnitt ± SD.
* P. 0,05
Diskusjoner
I løpet av de siste tiårene, selv om noen studier har undersøkt hvilken rolle WT1 i NSCLC, dens funksjon er ikke fullstendig klarlagt. I denne studien fant vi at uttrykket av WT1 gen og protein i NSCLC prøvene var markert oppregulert sammenlignet med tilstøtende vev; WT1 fremmet spredning av NSCLC-celler in vitro og in vivo, og WT1 uttrykk påvirket nivået av Cyclin D1 og p-pRb som akselerert celleformering i NSCLC-celler og kliniske prøver. Med alle funn tatt sammen, hypotese vi at WT1 spiller potensielt en onkogen rolle i å fremme kreftutvikling og progresjon av NSCLC.
WT1 ble opprinnelig identifisert som en tumor suppressor genet i Wilm tumor, og ble senere funnet å være overuttrykt i en rekke faste tumorer [19]. Men fortsatt er forholdet mellom uttrykk og karsinogenese av WT1 i NSCLC kontroversielt. Oji et al. foreslått at WT1 kunne forstyrre vekst og differensiering av normale lungeceller og bidrar til onkogenesen av lungekreft [11]. Flere nylig, Hayashi S et al rapporterte at lav WT1 genuttrykk hos NSCLC tumorer var en negativ prognostisk tegn og var også assosiert med lymfeknutemetastase [20]. Dessuten ble det vist at WT1 tap indusert alderdom og redusert spredning av lungekreftceller på nedstrømssiden av onkogene signaliserings KRAS [21] .STAT3 er konstitutivt aktivert i mange humane tumorer så som prostata, lunge, hjerne, bryst og bukspyttkjertel [13], [15], [22], [23]. Nedstrøms gener inkludert Cyclin D1, c-myc, og BCL-xL av STAT3, er potensielt oppregulert ved fosforylert STAT3. Cyclin D1 er en cellesyklus-regulator som fremmer celler fra G1-fase til S-fase, og fosforylerer pRb protein [24], som er et kjernefysisk fosfoprotein som regulerer cellevekst i G1-fase. Hypofosforylerte pRb på S780 frigjør deretter E2F fra en inhiberende komplisert og gjør det mulig å fremme den transkripsjon som er nødvendig for progresjon til sen G1-fase og S-fase [24] – [26]. Det har blitt rapportert at Cyclin D1 og cyklin-avhengige kinase-4 (CDK4) fosforylert pRb og som pRb mistet sin evne til å binde til E2F [27]. Så når Cyclin D1 er oppregulert ved STAT3 det kan fosforylere pRb og fremme cellevekst ved å slippe E2F.
Rong et al har rapportert at funksjonen av WT1 som tumor suppressor eller onkogen var først og fremst avhengig av aktivitetene av STAT3. Følgelig når STAT3 ble aktivert, WT1 fungert som en tumor suppressor, men når STAT3 ble deaktivert, WT1 fungerte som et oncoprotein [18]. De foreslo også at WT1 og STAT3 synergi fremmet celleproliferasjon av up-regulere gener som Cyclin D1 og BCL-XL. Basert på disse resultatene, hypotese vi at WT1 kunne fungere som et onkogen i NSCLC.
I denne studien har vi vist at WT1 ble overuttrykt i NSCLC vev sammenlignet med tilstøtende vev. WT1 oppviste en effekt på proliferasjonen av NSCLC-celler in vitro og vivo: overekspresjon av WT1 fremmet cellevekst, mens nedregule inhiberte proliferasjonen av NSCLC-celler. Vi har også oppdaget uttrykk for STAT3 hos NSCLC prøver og celler, i tråd med Fernandes et al som fant STAT3 overexpressed i lungekreft vev [23]. Våre resultater viste at WT1 akselerert S-fase celle oppføring; således, vurderte vi cellesyklus regulatoriske gener som Cyclin D1 og p-pRb og vi har funnet at ekspresjonen av Cyclin D1 og p-pRb ble faktisk oppregulert som vist i figur 3D. Tatt i betraktning våre resultater og tidligere funn av Rong et al, fant vi at WT1 og STAT3 synergi fremme veksten av NSCLC celler med opp-regulerer cellesyklus regulatorer cyclin D1 og p-pRb. I tillegg fant vi at WT1 uttrykk ble forbundet både med lymfeknutemetastaser og tumorstadium. Dette resultatet indikerer at WT1 uttrykk kan være relevant for tumorinvasjon og metastasering. Epitelial til mesenchymale overgang (EMT) er regnet som en viktig prosess for metastasering av kreft og spredning av kreftceller fra den primære svulsten og migrasjon til forskjellige steder av kroppen [28]. Interessant, WT1 kan potensielt drive EMT via EMT-relaterte mål som sneglen, Slug og E-cadherin [29] – [31]. Dette vil kreve ytterligere undersøkelser for å bestemme funksjonen av WT1 i tumorinvasjon og metastasering.
Uventet, vi fant ikke at WT1 hadde noen effekt på apoptose av NSCLC celler ifølge flowcytometer analysen og også ved Western -blot analysen; dette er forskjellig fra Rong Y et al funn som viste WT1 økt uttrykk av Bcl-xL [18]. Det ble også rapportert at WT1 er nødvendig for inhibering av apoptose i brystkreft og rhabdoid kreft ved å redusere Bcl-2-mRNA og proteinnivåene [32], [33]; imidlertid andre rapporter tydet på at WT1 negativt regulert Bcl-2 promoteren i prostata cellelinje [34]. Vincent S et al. rapporterte at de ikke påvise noen forskjell i respons til WT1 uttømming hos NSCLC cellelinjer [21], som var i samsvar med våre funn. Årsaken til disse forskjellene er ikke kjent, men ytterligere forklaring, av hvorfor WT1 og STAT3 synergistisk fremme graden av Cyclin D1, men har ingen effekt på nivået av Bcl-2L i NSCLC, er berettiget. Den nylig identifiserte transkripsjonen WT1 ko-faktorer, slik som BASP1 (hjerne syre-løselig protein 1) og WTIP (WT1 samspill protein) kan delta i disse forskjellene i WT1-formidlet transkripsjonsregulering av målgener slik som Bcl-2L [35] – [37].
Som konklusjon i denne studien, har vi funnet en signifikant høyere WT1 ekspresjonsnivået i NSCLC-prøvene sammenlignet med tilstøtende ikke-cancer vev, vi demonstrert spredning fremme funksjon av WT1 in vitro og in vivo og vi identifisert sitt onkogent rolle i NSCLC via amplifikasjon av den transkripsjonelle aktivitet av p-STAT3 som oppregulerer nedstrøms gener, inkludert Cyclin D1 og hypo-fosforylert retinoblastom protein (p-pRb). Dermed WT1 potensielt tjene som et terapeutisk mål for behandling av NSCLC.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
bilde av NSCLC villtype celler og andre transfektert med lentivirus i sterkt lys (øverst) og i grønt lys (lavere). NSCLC-villtype-celler omtalt som kontroll; celler transduced med pLL3.7 og PLV-GFP omtalt som GFP1 og GFP2; celler transduced med pLL3.7-WT1-shRNA omtalt som WT1-shRNA og omformet med PLV-GFP-WT1 omtalt som WT1 i figuren
doi:. 10,1371 /journal.pone.0068837.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Svulster oppnådd fra nakne mus. Svulster som oppnås fra hårløse mus er alle vist i denne figuren. Det bør bemerkes at vi bare oppdaget 4 svulster i H1299-WT1-shRNA gruppe og 5 svulster i H1650-WT1-shRNA gruppe i det injiserte området
doi:. 10,1371 /journal.pone.0068837.s002 product: ( TIF)
Figur S3.
WT1 mRNA uttrykk for NSCLC celler. WT1 uttrykk for NSCLC villtype celler og NSCLC celler transfektert med lentivirus inneholder pLL3.7 (GFP1), PLV-GFP (GFP2), pLL3.7-WT1-shRNA (WT1-shRNA1, WT1-shRNA2, WT1-shRNA3) og PLV-GFP-WT1 (WT1) ved real-time PCR. Data er representert som gjennomsnitt ± SD. * P 0,05
doi: 10,1371 /journal.pone.0068837.s003 plakater (TIF)
Tabell S1..
Forholdet mellom WT1 uttrykk og clinicopathological funksjoner i NSCLC
doi:. 10,1371 /journal.pone.0068837.s004 plakater (DOC)
Tabell S2.
sekvens av WT1-shRNA
doi:. 10,1371 /journal.pone.0068837.s005 plakater (DOC)
Takk
Forfatterne takker alle personer som frivillig deltok i studien og D. Beicheng Sun og D. Yun Chen (Universitetet i Nanjing Medical University, Nanjing, Kina) for sine plasmider.
