Abstract
Formål
Formålet med denne studien var å utnytte proteomikk-baserte samarbeids Enzyme Enhanced Reactive (FME) immunologisk å undersøke protein tyrosin phosphorylations som diagnostiske markører i mage kreft (GCer ).
Experimental Design
Protein lysates fra fersk frosne 434 avansert stadium GCer ble analysert for fosforylering av HER1, HER2, p95HER2, HER3, cMET, IGF1R og PI3K. Den veien aktiveringsmønster ble segregert basert på svulsten HER2 status. Hierarkisk clustering ble benyttet for å bestemme pathway coactivations i GCer. Prognostisk verdi av spredningsveier aktiveringsmønster ble bestemt ved å korrelere sykdomsfrie overlevelsestider for de forskjellige GC undergruppene ved hjelp av Kaplan-Meier-overlevelsesanalyse. FME ble også brukt til å bestemme tilstedeværelsen av tyrosin fosforylert signalering kaskader i sirkulerende tumorceller (CTCs) og ascites tumorceller (ATCS).
Resultater
Ved hjelp av en roman diagnostikk immunoassay, FME, vi påvise p95HER2 og samtidig aktiverte signalveier i GC tumorvev, CTCs og ATCs isolert fra GC-pasienter for første gang. p95HER2 er uttrykt i ~77% av HER2 (+) GCer. Omtrent 54% av GCer har en aktivert HER1, HER2, HER3, cMET eller IGF1R og demonstrere en dårligere prognose enn de hvor disse reseptor tyrosin kinaser (RTK) ikke er aktivert. Hierarkisk clustering av RTK avslører co-gruppering av fosforylert HER1: cMET, HER2: HER3 og IGF1R-PI3K. Coactivation av HER1 med cMET gjengir GCer med en kortere sykdomsfri overlevelse sammenlignet med bare cMET aktivert GCer.
Konklusjoner
Vår studie fremhever nytten av en roman companion diagnostics teknologi, FME som har sterke implikasjoner for legemiddelutvikling og terapeutisk overvåking. FME brukes til å gi en økt forståelse av aktivt signalveier i avanserte GCer som kan betydelig forbedre sin kliniske behandlingen gjennom nøyaktig pasienten utvalg for målrettet legemiddel
Citation. Lee J, Kim S, Kim P, Liu X, lee T, Kim KM, et al. (2013) A Novel proteomikk-Based Clinical Diagnostics Technology Identifiserer heterogenitet i Aktivert signalveier i Gastric Kreft. PLoS ONE 8 (1): e54644. doi: 10,1371 /journal.pone.0054644
Redaktør: Anthony W. I. Lo, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 20 september 2012; Godkjent: 13 desember 2012; Publisert: 25 januar 2013
Copyright: © 2013 Lee et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser. Mens PK, XL, TL, NH, GH, AK, AJ, GM, GL og SS er ansatt av Prometheus Laboratories, dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
molekylært målrettede midler har akselerert innen onkologi. Gitt at omtrent halvparten av tyrosin-kinase-komponenten av det menneskelige kinome er innblandet i humane kreftformer, er det ikke overraskende at en stor andel av den nåværende terapi rettet mot ulike kinaser [1], [2]. Coactivation av reseptor-tyrosinkinaser (RTK’er) er blitt observert i undergrupper av mange kreftformer, slik som glioblastoma multiforme [3], brystkreft [2], [4], [5], [6], [7], lungekreft [8 ], [9], hode og nakke kreft [7] og magekreft [4], [5], [6] og dermed impliserer dem som nødvendig for tumorprogresjon og overlevelse. Disse observasjonene gir tilstrekkelig klinisk rasjonale for screening aktivert RTK i kreft som kan deretter veilede terapeutisk målretting og potensielt gi kunnskap for rasjonelle kombinatoriske terapeutiske strategier. Men bare analysere ekspresjonen eller aktiveringsstatusen til en enkelt RTK som kan være det spesifikke mål-protein for en spesiell terapeutisk er utilstrekkelig for å velge pasienter som ofte pasienter som ikke responderer på behandling til tross for ekspresjon av målet. Flere potensielle problemer kan være ansvarlig for en slik mangel på terapeutisk nytte av målrettede midler, for eksempel 1) samtidig aktivering av parallelle eller alternative veier som omgår opprinnelig rettet protein (r), og 2) kontinuerlig endring i molekylære og patologiske trekk ved neoplastisk vev under kreft progresjon. Derfor ville det være ideelt å ha en ledsager diagnostisk verktøy som kan brukes på begrensede mengder av kliniske prøver for å fange omfattende kompleksiteten av fosforylerte signaleringsnettverk i det neoplastiske vev i tillegg til den direkte mål RTK-protein for å overvåke «utviklende» sykdom .
Målrettet fosforylering analyse av kliniske prøver har vært hemmet på grunn av mangel på lett brukbare kliniske analyser som er følsomme nok til å fungere på begrensede mengder av kliniske vev. Vi har tidligere rapportert utvikling av en ny nærhet basert immunoassay, Collaborative Enzyme Forbedret Reactive-immunoassay (CEER, figur S1) [6], som er egnet til å analysere både den totale ekspresjon og aktivering status av proteinsignalisering kaskader. FME kan utføres på en multiplekset mote direkte på kliniske prøver som kan være tilgjengelig i begrensede mengder. FME-analysen benytter dannelsen av et unikt immun-kompleks krever samlokalisering av to detektor enzym-konjugert-antistoffer når target proteiner har blitt fanget på en microarray. Dette formatet muliggjør effektiv og følsom påvisning av RTK’er, samt nedstrøms pathway proteinene ned til enkeltcelle-nivå (en sensitivitet på omtrent 100 zeptomoles). I denne studien har vi utnyttet FME-analyse for å studere signalveien kompleksitet i mage kreft (GC).
GCer er den ledende årsak til kreft dødsfall over hele verden med en insidens på 18,9 /100 000 tilfeller per år og en dødelighet rate på 14,7 /100 000 per år [10] og er den vanligste kreftformen i Korea [11]. Metastatisk GC forblir en terapeutisk utfordring for medisinsk onkologi på grunn av sin dårlig prognose. Foreløpig er trastuzumab den eneste aktive målrettet middel som har vist seg å være effektiv for GC i en randomisert fase III studie [12]. Selv om aktivering av flere RTK’er har blitt rapportert i GCer, er deres innvirkning på GC prognose ukjent. Dette er viktig for utvikling og anvendelse av legemiddelselskap for den kliniske behandlingen av GCer.
I denne studien har vi brukt multiplekset FME plattform for å bestemme nivåer av aktiverte RTK (HER1, HER2, avkortede varianter av HER2, dvs. p95HER2, HER3, cMET, PI3K, og IGF1R) i 434 friske frosne GC vev og forsøkte å kategorisere GC pasienter til potensielle undergrupper basert på deres protein sti aktiveringsmønstre. Vi har observert flere signal protein aktiveringer i undergrupper av GC svulster som korrelerer med sykdomsfri overlevelse (DFS) hos disse pasientene. Derfor hypoteser vi at overflødig pathway aktiveringsinnganger kan føre til gjenværende nedstrøms signalisering i gcs, og dermed begrense den anti-tumor effekt av monoterapier rettet mot enkelt RTK’er. Endelig har vi utviklet en potensielt kraftig metodikk som kan gjøre det mulig for helsepersonell å overvåke baseline og utviklende endringer i kreft RTK aktiverings profiler i løpet av en behandling ved hjelp av sirkulerende tumorceller (CTCs) og ondartede celler isolert fra peritoneal væske (ascites tumorceller eller ATCs ). Til sammen gir vår studie bevis for samtidig RTK aktivering i GC menneskelig vev i tillegg etablere FME som et effektivt klinisk verktøy for å diagnostisere og overvåke RTK aktivering under GC behandling eller sykdomsprogresjon.
Materialer og metoder
pasient~~POS=TRUNC Cohort og vevsprøve Procurement
studien ble gjennomført etter godkjennelse fra Samsung Medical Center Institutional Review Board (SMC IRB) for informert samtykke avkall bruker arkiv vev med retrospektive kliniske data. Den primære tumorprøver ble alle hentet fra Samsung Medical Center. Alle pasientene gjennomgikk gastrektomi med radikal lymfeknutetoalett med kurativ hensikt. Fra mars 2001 til februar 2005, ble 447 friske frosne vev oppnådd fra 434 pasienter hentet fra kirurgisk resected primære mage svulster og var tilgjengelig for endelige analysen. Alle ferske frosne vev ble oppsamlet (innen 30 minutter) ved operasjonsområdet og ble umiddelbart hurtigfrosset og lagret i flytende nitrogen inntil senere bruk. Vevsprøver ble bekreftet med hensyn til nærvær av 70% tumorområdet av patologen. For analyse ble små stykker av frosset vev (10 um avsnitt x 3) fremstilt ved anvendelse av forhåndsavkjølt barberblad og lysert i 100 ul lyseringsbuffer. De resulterende lysatene ble lagret ved -80 ° C inntil påfølgende analyse
Histopatologi gjennomgang og HER2 status besluttsomhet
Alle tilgjengelige H . E-fargede objektglass ble sentralt gjennomgått av to patologer (ID, KKM ) ved eksperimentell patologi kjernen av Samsung Cancer Research Institute. Alle vevsprøver var fra kirurgisk resected primære mage svulster. HER2 status ble bestemt ved IHC og FISH. IHC analyse ble utført ved hjelp av HercepTest ™ (Dako, Glostrup, Danmark). HER2 protein uttrykk nivåer ble scoret som 0 til 3+, i henhold til konsensus panel anbefalinger om HER2-ledelsen til GC [13], [14]. For fisk, ble PathVysion HER2 DNA probe kit (Abbott, Des Plaines, IL) som brukes. ARIOL bildeanalysesystem ble anvendt til å telle hybridiseringssignaler (Genetix, San Jose, USA). Alle prøver med prosenter av HER2 /CEP17 mellom 1,8 og 2,2 ble scoret manuelt ved å telle mer enn 60 ikke-overlappende celler. Prosenter av 2.2, 1.8 til 2.2, eller 1,8 ble klassifisert som positive, tvetydige eller negativ for forsterkning, henholdsvis. Kromosom 17 polysomy ble definert som en CEP17 signal som hadde mer enn seks eksemplarer i gjennomsnitt per celle. Av de 447 prøvene, ble 434 prøver tatt med i den endelige analysen.
Collaborative Enzyme Forbedret Reaktiv-immunoassay (FME)
FME lysbilder ble trykket, inkubert med GC lysatene og behandles som beskrevet tidligere [ ,,,0],6]. Lysbilder ble skannet på fire photomultiplier (PMT) forsterkning for å øke den effektive dynamisk område. Data var skikket til en fem-parameter ligning utledet som en funksjon av fangst-antistoff konsentrasjon og PMT og presentert i beregnede enheter (CU).
multipleks-mikromatriser utskrift.
Ta antistoffer ble trykt på nitrocellulose-belagt glassplater (ONCYTE®, Grace Bio-Labs) ved hjelp av ikke-kontakt skrivere (Nanoplotter, GeSiM). Spot diameter var ca. 175 mikrometer. Objektglassene ble oppbevart i et uttørket kammer ved 4 ° C. Omtrent 500 pl av fangst Abs ble trykket i triplikat ved seriefortynning konsentrasjoner på 1 mg /ml, 0,5 mg /ml, og 0,25 mg /ml. Renset mus-IgG tjente som negative kontroller. Immuno-rekkeglide konfigurasjoner er vist i figur S1.
Antistoff konjugering og rensing.
target-spesifikke antistoffer (mus monoklonalt mot spesifikke epitoper på human signaltransduksjon proteiner) og de tilsvarende detektor enzymer glukoseoksidase (GO) eller pepperrot peroksidase (HRP), ble aktivert med bi-funksjonelle tverrbindingsmiddel, succinimidyl-4- (N-maleimidometyl) cykloheksan-1-karboksylat (SMCC), og koblet hvilket ga antistoff-enzym-konjugater. Konjugatene ble renset ved HPLC. Antistoff aktiviteter i de rensede konjugater ble bestemt av konkurranse ELISA og etter konjugering enzymaktivitet ble oppdaget av funksjonelle analyser som er spesifikke for hver detektor enzymet.
FME-analyser.
Immuno-microarray lysbilder ble skylt 2X med TBST (50 mM Tris /150 mM NaCl /0,1% Tween-20, pH 7,2-7,4), blokkert med 80 ul Whatman blokkeringsbuffer i 1 time ved romtemperatur, deretter vasket 2x med TBST. Serielt fortynnet lysat-kontroller eller prøver i 80 ul fortynningsbuffer (2% BSA /0,1% TritonX-100 /TBS, pH 7,2-7,4) tilsatt til angitte deloppstillinger på objektglass og inkubert i 1 time ved RT. Objektglassene ble vasket 4X (3 min. Hver), og detektor Abs ble tilsatt i 80 ul reaksjonsbuffer og inkubert i 2 timer ved RT. Etter vasking lysbilder med TBST for å fjerne ubundet detektor Abs, 80 ul biotin-tyramide løsning (5 ug /ml i 50 mM glukose /PBS) fremstilt fra 400 mikrogram /ml i etanol-løsning (Perkin-Elmer Life Science) ble tilsatt og inkubert for 15 minutter i mørket. GO /HRP-mediert tyramide signal forsterkning prosessen ble avsluttet ved vask med TBST 4X, 3 min hver. Lokal avsetning av biotin-tyramide ble detektert ved inkubasjon med streptavidin (SA) -Alexa647 (Invitrogen) ved 0.5 ug /ml i 2% BSA /0,1% Triton /TBS i 40 minutter. Ved fullføring av inkubasjon ble objektglass vasket 4X med TBST, tørket og holdt i mørke inntil de ble fotografert ved hjelp av en microarray skanner.
For CEER dataanalyse, ble objektglassene skannet ved fire PMT forsterkning for å øke den effektive dynamiske område. Bakgrunnskorrigert signal intensiteter ble gjennomsnitt for flekker trykt i tre eksemplarer. Flere kriterier ble brukt til å filtrere data for videre analyser, inkludert begrensninger på stikk fotavtrykk, variasjonskoeffisient for spot gjentak, og samlet pad bakgrunn. For hver analyse ble en standardkurve utviklet fra serielt fortynnede kontrollcellelysatene fremstilt fra cellelinjer med godt karakterisert signaltransduksjon proteiner. Data ble passer til en fem-parameters ligning utledet som en funksjon av fangst-antistoff-konsentrasjon og PMT. Standardkurven for hver markør var egnet som en funksjon av log signalintensiteten målt som relativ fluorescens-enhet (RFU) mot log konsentrasjon av cellelysater og referert til standard cellelinjer. For eksempel, ble standardkurve for seriefortynnet cellelysater fremstilt fra BT474 brukt til å normalisere HER2 ekspresjon og graden av fosforylering i hver prøve (figur S2). Derfor en prøve med en CU av HER2 uttrykk har RFU verdien tilsvarer RFU verdien av en standard referanse BT474 celle. Som referanse celler har 1~2 × 10
6 HER1 eller HER2 reseptorer per celle med ca 10% fosforylerte reseptorer, representerer en CU uttrykk for 1~2 × 10
6 RTK eller 1~2 × 10
5 fosforylerte RTK [6]. Deteksjonsgrensen (LOD) verdien av CU var bestemt å være mindre enn en CU for både uttrykk og aktivering av HER2. Individuelle spådommer fra hver fortynning og gevinst ble i gjennomsnitt i en enkelt, endelig prediksjon.
avkortet HER2 berikelse
Full-lengde p185-HER2 reseptorer ble tømt fra svulstvev lysatene ved hjelp av magnetisk-perle kombinert antistoffer spesifikk for ekstracellulære domenet (ECD) av HER2 som vist i figur S3. Resulterende p185-HER2-utarmet lysatene, som inneholdt anriket avkortede HER2 (t-HER2) reseptorproteiner som mangler ECD, ble anvendt for påfølgende kvantifisering av t-HER2 ekspresjon og fosforylering ved hjelp av de respektive FME analyser. En avskåret verdi av 500 CU ble brukt å score for p95HER2 positivitet per 20 mikrogram av vev analysert. Den totale p95HER2 analysen avlesning var i forhold til de signaler som genereres fra standardkurver generert ved hjelp av en kontroll cellelysat fra BT474 brystkreft cellelinje.
Cell kultur og reagenser
FME-analyse kontrollcellelinjer , MDA-MB-468, T47D, HCC827 og BT474-celler med varierende grad av ErbB-RTK ekspresjon ble oppnådd fra ATCC og dyrket ved 37 ° C i 5% CO
2 – for MDA-MB-468 (Dulbeccos minimale essensielle medium (DMEM) + 10% FBS), BT474 (DMEM + 10% FBS), og HCC827 og T47D (RPMI 1640 + 10% FBS, 0,2 U /ml bovint insulin). Cellene ble tellet og vasket med 1 x PBS før vekstfaktor stimulering. MDA-MB-468-celler ble stimulert med 100 nM epidermal vekstfaktor (EGF) eller transformerende vekstfaktor a (TGFa), ble T47D-celler stimulert med 20 nM heregulin β (HRGβ) eller 100 ng /ml insulinlignende vekstfaktor-1 (IGF1) i serumfritt vekstmedium for 5 eller 15 min. Stimulerte celler ble vasket med 1 x PBS og deretter lysert (lyseringsbuffer: 50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% ernæring X-100 og 2 mM Na
3VO
4) og holdt på is for 30 min lot supernatanten for en etterfølgende analyse eller oppbevart ved -80 ° C.
CEER markør bestemmelse og varmekartet clustering
Positivity for en gitt biomarkør ble definert som er større enn den tredje kvartil for en individuell biomarkør i pasientpopulasjonen i denne studien. Pasientene ble rangert basert på CU verdien fra FME-analysen for en gitt biomarkør. De pasientene som er større enn den tredje kvartil cutoff ble vurdert med høyest risiko for å ha forhøyede biomarkør nivåer og derfor potensielt aktivert signalveier. Etterfølgende overlevelsesanalyse ble gjort for å vurdere predicative kvaliteten på disse tidsavgrensninger.
biomarkør profil av tumorprøver ble representert av et varmekart. Hver celle ble fargelegges basert på desil rang av aktivering av som markør. Hver markør ble rangert etter desiler, representert ved en tydelig skygge, med skala som angir fargen. Både rad (pasient) og kolonne (markør) clustering ble vist. Den komplette kobling algoritme ble brukt for å få en hierarkisk klynge (eller dendrogram) ved sekvensiell gruppere de korrelerte observasjonene ved hjelp av hclust funksjon i R, kalt av heatmap.2 funksjonen tilgjengelig med gplots bibliotek av statistikkmiljøet R: A Språk og miljø for Statistisk Computing (https://www.r-project.org/). Undergrupper av markører ble definert av clustering som tillot sammenligninger av markør profiler for pasientene.
CTC og ATC isolasjon
For CTC evaluering, 7,5 ml blodprøver ble trukket inn i 10-ml evakuert etylendiamintartrat tetraeddiksyre (EDTA) rør. Den CellSearch System (Veridex) ble anvendt for immuno-magnetisk CTC isolasjon ifølge protokollen beskrevet tidligere [6] med ferrofluids- konjugert til Ab mot epithelial cell adhesion molecule. For ATC evaluering ble det cellulære innhold anriket fra 50 til 100 ml av ascites fluid ved sentrifugering og immuno-magnetisk tumorcelleisolering ble utført på en lignende måte. Flere sett med ATCs ble behandlet med cocktails av vekstfaktorer (EGF, HRG, HGF og IGF1) med eller uten lapatinib og PHA-665752 inhibitor kombinasjon.
Diskusjoner
Resultater og Selge
Pasient egenskaper
Kjennetegn på 434 GC pasienter er gitt i tabell 1. Alle pasienter fikk gastrectomies med D2 lymfeknute disseksjon med 242 (55,8%) av pasientene som fikk Subtotal gastrectomies. Ifølge AJCC 2002 staging system, 86 pasienter hadde patologisk stadium I, 116 hadde stadium II, 126 hadde stadium III og 106 hadde stadium IV (35 pasienter med metastatisk M1) GC. På tidspunktet for analyse, 226 pasienter var døde og 237 pasienter hadde dokumentert gjentakelse. 70 pasienter hadde signet ring cell carcinoma. Den 5-årige generelle og sykdomsfrie overlevelse var 52,4% og 50,0%, henholdsvis. Alle primære GC vev ble anskaffet ved tidspunktet for kirurgi og umiddelbart hurtigfrosset for fremtidig molekylær analyse.
FME-baserte analyser indikerer heterogenitet i HER2 ekspresjon og tilstedeværelsen av HER2 avkortet variant p95HER2, på HER2 ( +) mage kreft
Vi har tidligere rapportert utviklingen av immunmicroarray baserte FME analyser [6], [15]. Vi brukte CEER baserte HER2 assay for å undersøke HER2 status for HER2 (+) og HER2 (-) prøver i vårt GC pasientmateriale som ble segregert basert på standard IHC HercepTest /FISH-analyse. Fordelen med FME-baserte analyser er deres høyere sensitivitet og spesifisitet i forhold til IHC-baserte analyser [6]. Basert på dagens HER2 (+) definisjoner for GCer [13], [14], det vil si, prøver med en HER2-IHC score på 3+ eller 2+ og en positiv
HER2
genamplifisering status, 50 av 434 (11,5%) prøver i vår GC pasient kohort var HER2 (+) ved IHC HercepTest /FISH analyse (tabell S1). I kontrast, i henhold til de retningslinjer som er spesifikke for IHC brystkreft, bare 78% (39/50) av disse pasientene var HER2 (+) (tabell S1) som indikerer forskjellen i scoring kriterier for HER2-positivitet mellom mage og brystkreft. Et flertall av HER2 (+) GCer (36 av 50 prøver (72%)) var av tarm subtype snarere enn diffuse eller blandet type GCer i enighet med publiserte rapporter [13], [16], [17].
CEER basert HER2 assay demonstrert betydelig høyere HER2-ekspresjonsnivåer i IHC /FISK HER2 (+) tumorer sammenlignet med de i HER2 (-) tumorer (med en middelverdi på 77,9 CU CU vs. 4,3, p-verdi 8.18E-10) som vist i figur 1A. FME-baserte HER2 data er presentert i CU, en standard funksjonell enhet basert på cellelinje styrer med kjent HER2 uttrykk [6], som gjør at sammenligning av HER2 uttrykk på tvers av prøver. Kun 32/50 eller 64% av IHC /FISH HER2 (+) GCer demonstrert HER2 uttrykk av FME, og det var en betydelig grad av heterogenitet i HER2 uttrykk i disse prøvene som avslørt av de kvantitative FME leselig. Heterogenitet i HER2 uttrykk kan forklare årsaken til bare en moderat grad av samsvar (87,5%) mellom IHC og FISH avlesninger for HER2 i toga rettssaken [12]. Dette avviket vil direkte påvirke utfallet av HER2-rettet terapi som trastuzumab i GCer. Dessuten, på grunn av den høye følsomheten til CEER analysen, ble det lagt merke til at ~ 20% av IHC /FISH HER2 (-) GCer likevel uttrykt total HER2 dog på klart lavere nivåer enn det HER2 (+) pasientpopulasjon
.
(A) CU-distribusjon for HER2 uttrykk for GC prøver på 0,25 mikrogram lysat.
x
-aksen representerer IHC /FISH status, og
y
-aksen representerer CU verdier fra FME-analysen som bestemmes fra en BT474 standardkurve. Separasjon er illustrert mellom de to gruppene med en median på 0 for IHC /FISH negativ befolknings (384 av 434) sammenlignet med en median på 11 for IHC /FISH positive befolkningen (50 av 434). En mettet prøve, over grensen for kvantifisering og angitt som «Number mettet «i den tilsvarende tabell, er ikke vist. Bokser representerer interkvartilt område, med den 75. persentil på toppen og 25. persentil nederst. Den linje i midten av boksen representerer medianen. Linjene utvides til høyeste og laveste verdi innenfor 1,5 ganger interkvartile området.
P
verdi 0,001 ble bestemt av Wilcoxon signed-rank test. (B) CU fordeling for p95HER2 i et delsett av tumorprøver (58 av 434) ved 20 ug lysat.
x
-aksen representerer IHC status, og
y
-aksen representerer CU verdier fra FME-analyse for P95. Full lengde HER2 ble fjernet ved immuno-uttømming før analysen. Datapunktene er farget basert på HER2 status ved IHC og FISH. Som vist, er en datapunkt med en IHC av 2 bestemt til å være positiv ved FISH-analyse. Av de 34 prøvene bestemt til å være positivt for P95 av FME, 24 (71%) av dem var HER2 (+) ved IHC /FISH. p95HER2 uttrykk kunne ikke fastslås i en prøve som er angitt som «Number NA» i den tilsvarende tabellen.
Bruke FME-baserte p95HER2 analysen plattformen, ble forkortede former av HER2 spesifikt påvises, i tillegg til full lengde HER2, i GCer for første gang. p95HER2 uttrykk ble analysert i 31/50 HER2 (+) prøver og 27/384 HER2 (-) prøver) som viser en signifikant full lengde HER2 uttrykk ved FME (figur 1B). Forekomsten av p95HER2 i HER2 (+) GCer var ~77% (i 24/31 prøver) (tabell S1). I likhet med full lengde HER2 uttrykk, de fleste av p95HER2 uttrykket (79% av p95HER2 uttrykt i HER2 (+)) ble detektert i tarm typen GCer. p95HER2 ekspresjon ble også observert i en liten prosentandel av HER2 (-) GCer (37% eller 10/27 sampler) som viste full lengde HER2 uttrykk. Men den gjennomsnittlige p95HER2 uttrykk i HER2 (+) GC prøvene var betydelig høyere enn det som ble observert i HER2 (-) GCer (5083,6 CU i HER2 (+) vs 437,0 CU i HER2 (-), p-verdi = 1.27e-05 ). p95HER2 kan bidra til trastuzumab ikke-respons i GC svulster som det gjør i 70-80% av økt forekomst av HER2 [18]. Trastuzumab pluss standard kjemoterapi gjengitt en samlet respons på bare 47% i HER2 (+) GCer i toga rettssaken [12] indikerer eksistensen av mulige trastuzumab resistensmekanismer og vår manglende evne til å nøyaktig velge trastuzumab respondere. For å klinisk validere p95HER2 uttrykk med trastuzumab motstand, som har vært kontroversiell, spesielt på grunn av de siste motstridende funn fra GeparQuattro brystkreftstudier [19], strenge p95HER2 analysen avgrensning i form av klinisk relevante diagnostisk analyse lodde bestemmelser og anvendbarhet i kliniske situasjoner er nødvendig. En validering av p95HER2 uttrykk er planlagt i en fase II neoadjuvant lapatinib pluss kjemoterapi klinisk studie i GC pasienter som flere studier tyder på bruk av lapatinib i p95HER2 (+) kreft [20], [21].
Til sammen våre data klart definere HER2 status i GCer og demonstrere nytten av FME-baserte HER2 diagnostikk i GC pasientprøver for å bestemme sin nøyaktige full lengde og avkortet HER2 uttrykk. Utviklingen av slike diagnostikk vil sterkt påvirke nøyaktig utvalg av HER2 (+) GCer som respondere til trastuzumab og andre HER2 rettet mot agenter. Vi har tidligere rapportert bruk av FME-baserte HER2 diagnostikk hos brystkreftpasienter [6], [15] som viste en høyere sensitivitet og spesifisitet i forhold til IHC-basert diagnostikk.
Gastric kreft demonstrere samtidig aktivering av signalveier
Vi brukte FME analysen direkte på GC prøver å vurdere tilstedeværelse av totalt og fosforylerte (aktivert) former av flere signalmolekyler som er kjent for narkotika mål: disse inkluderte flere RTK (HER1, HER2, HER3, cMET, IGF1R) og PI3K. Representative bilder av multipleksede FME sti-arrays fra åtte forskjellige prøver er vist i figur 2A. Disse bildene viser klart heterogenitet i aktiverte pathway signaturer som er utbredt i GCer. For eksempel er både HER1 /HER2 coactivated i prøvene 1 og 6, mens bare HER2 aktiveres i prøve 2, men HER1, HER2 og cMET er uttrykt til høye nivåer. Prøve 5 viser aktivering av alle 5 analysert RTK inkludert nedstrøms PI3K og SHC veier. Følgende avsnitt beskriver signalveien heterogenitet observert i vårt GC pasient kohort som bestemmes av FME-analyser.
(A) Representative immuno-array-bilder for pathway profilering av angitte signaltransduksjon proteiner. Array signal intensitet varierer fra svart /mørk blå (lav) til rød /hvit (høy /metning). (B) Heat kart og hierarkisk clustering av de 434 prøvene basert på CU verdier fra FME-analyse for fosforylerte markører målt til 10 μ g lysat konsentrasjon. Hver kolonne representerer en markør og hver rad representerer en pasientprøve. Relative nivåer av fosforylering er avbildet med en fargeskala der rød representerer det høyeste nivået av aktivering og grønt representerer det laveste nivå. Cu verdier for hver markør (kolonne) ble rangert etter desiler. Jitter, mellom 0 og 0,1, ble lagt til hver biomarkør CU verdi for å skape like store binger. Rad og kolonne Dendrogrammet viser resultatet av den hierarkiske clustering beregningen.
tumorer fra 202 pasienter (46,5%) hadde ingen påvisbar aktivering av RTK’er testet i vårt studium. Pathway aktiverings mønstre for resten av svulster, som avbildet i en bane klyngeanalyse (figur 2B), varierer mye med noen GCer demonstrerer samtidig aktivering av flere RTK’er som HER2 /HER3, HER1 /2/3, HER1 /3 /cMET eller HER3 /cMET mens andre ble fosforylert bare på et enkelt protein. Svulsten Innholdet av alle de analyserte prøvene var ved 70% basert på deres histologisk undersøkelse. Men den pan-cytokeratin (pan-CK) uttrykk var utpreget variabel tyder heterogenitet i epiteliale innholdet i GCer. Basert på denne profileringen, kategorisert vi 434 GC prøven kohort i henhold til deres RTK aktiverings signaturer og HER2 status
HER aksen i mage kreft. (Tabell 2 Tabell S1).
i det minste en reseptor medlem av HER-aksen ble aktivert i 41% av pasientene GC. HER2-fosforylering ble påvist ikke bare i 50% av HER2 (+) GC-pasienter, men også i ~22% av HER2 (-) kreft i overensstemmelse med den observerte totale HER2 uttrykk som er beskrevet tidligere. 16/25 HER2 (+) prøver som viste aktiverte HER2 også uttrykt p95HER2. Likeledes, HER3 ble også fosforylert i en høyere prosentandel av HER2 (+) GCer (36%) sammenlignet med HER2 (-) kreft (~24%). Imidlertid gjorde fosforylert HER1 ikke har en slik preferanse og er ekvivalent aktivert i begge GC typene (26% i HER2 (+) og 25% på HER2 (-)). Videre er de fleste av de HER medlems aktivert GC svulster (~64%) viste en samtidig aktivering av andre RTK’er, dvs. cMET eller IGF1R. Histologisk et flertall av HER2 (+), uttrykt tarm typen GCer en aktivert HER2 (i 22/36 eller ~61%), etterfulgt av HER3 (i 13/36 eller ~36%) med en samlet 36% av tarm typen GCer uttrykker en aktivert HER2 sti. Totalt, HER2 aktiveringen var mer konsentrert i tarmtypen (55/154 eller 35,7%) sammenlignet med de diffuse-type kreft (43/225 eller 19,1%). I motsetning til dette ble aktivert HER1 like observert både i intestinal-type (eller 38/154 24,7%) og diffus type (58/225 eller 25,8%) GCer. Aktivert HER3 var også ekvivalent til stede (29,9% og 21,8%) mellom begge Lauren klassifikasjon subtyper.
Som signal funksjon HER kinase aksen er avhengig aktivert reseptor dimerization, har vi sett på de ulike parene av HER medlem coactivations. Coactivation av HER2 med HER3 ble foretrukket i HER2 (+) kreft (13/50 eller 26%) med 7/13 HER2: HER3 aktivert GCS uten HER1 coactivation. Omtrent 54% av HER2: HER3 coactivated HER2 (+) GCer koekspresjon p95HER2. På den annen side, HER2 (-) GCer viste ikke en preferanse for en bestemt HER-kinase-dimer par med alle tre mulige aktiverte dimer-parene (HER1: HER2, HER1: HER3 og HER2: HER3) uttrykt i ~15% hver av HER2 (-) prøver. Triple aktivering av HER1 /2/3-reseptorer ble observert i 11,1% av GCer med en marginalt høyere fordeling i HER2 (-) kreft
cMET aktivert mage kreft (Tabell 3 Tabell S1).
.
i likhet med HER1, cMET fosforylering ble likt distribuert mellom HER2 (+) (22%) og HER2 (-) (-25%) GCer. Videre aktivert cMET fordeling basert på Lauren histotype var lik mellom tarm (48/154 eller 31,2%) og diffus-type (55/225 eller 24,4%) GCer.
Flertallet av cMET aktivert GC prøver (~ 71% eller 77/108) viste en samtidig aktivering av hennes kinase reseptor medlemmer. Alle prøver med en fosforylert cMET viste en
cMET
forsterkning (data ikke vist).
