Abstract
Duplisering av kromosom arm 20Q skjer i prostata, cervical, tykktarm, mage, blære, melanom, bukspyttkjertel og bryst kreft, noe som tyder på at 20Q forsterkning kan spille en kausal rolle i tumorigenesis. Ifølge en alternativ visning, er kromosomal ubalanse i hovedsak en vanlig bivirkning av kreft progresjon. For å teste om en bestemt genomisk avvik kan tjene som en kreft innledende hendelsen, etablerte vi en in vitro system som modeller evolusjonsprosessen av tidlige stadier av prostata svulst formasjon; normale prostataceller ble udødeliggjort av den over-uttrykk for menneskelig telomerase katalytisk subenhet hTERT, og dyrket i 650 dager til flere transformasjons kjennetegnene ble observert. Genuttrykksmønster ble målt og kromosomavvik ble overvåket av spektral karyotype analyse på forskjellige tider. Flere kromosomale aberrasjoner, særlig duplisering av kromosomal arm 20Q, forekom tidlig i prosessen, og ble fiksert i cellepopulasjoner, mens andre avvik ble utryddet kort tid etter deres utseende. Et bredt spekter av bioinformatiske verktøy, anvendt på våre data og data fra flere kreft databaser, avslørte at spontan 20Q forsterkning kan fremme kreft initiering. Vår beregningsmodell viser at 20Q forsterkning indusert deregulering av flere spesifikke kreftrelaterte pathways inkludert MAPK vei, p53 sti og Polycomb gruppe faktorer. I tillegg ble aktivering av Myc, AML, B-catenin og ETS familietranskripsjonsfaktorer identifisert som et viktig skritt i utviklingen av kreft drevet av 20Q forsterkning. Til slutt vi identifisert 13 «kreft initiere gener», som ligger på 20q13, som var betydelig over uttrykt i mange svulster, med uttrykk nivåer korrelerte med svulst klasse og resultatet tyder på at disse genene indusere ondartet prosessen på 20Q forsterkning.
Citation: Tabach Y, Kogan-Sakin jeg, Buganim Y, Solomon H, Goldfinger N, Hovland R, et al. (2011) Forsterkning av 20Q kromosom Arm Forekommer Tidlig i Svulst Transformation og kan ta initiativ til kreft. PLoS ONE 6 (1): e14632. doi: 10,1371 /journal.pone.0014632
Redaktør: Vladimir Brusic, Dana-Farber Cancer Institute, USA
mottatt: 9 juli 2010; Godkjent: 03.12.2010; Publisert: 31 januar 2011
Copyright: © 2011 Tabach et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av en bevilgning fra Leir Charitable Foundation og ved EC FP6 finansiering. Delfinansiering ble gitt av Senter for kvinner Health Research. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nedsatt genom stabilitet er ett av kjennetegnene til kreft [1]. Lokal DNA kopitall aberrasjoner har vist seg å være prediktive for utfallet [2], [3], [4] eller av behandlingsrespons [5], [6], [7] i flere krefttyper. Selv om de fleste kreftceller vise gevinst eller tap av kromosomale regioner [8], er det fortsatt en debatt mellom forskere om genomisk avvik er avgjørende for kreft initiering [9], [10] eller et resultat av tumorigent prosessen [11], [12 ], [1. 3]. Mens noen rapporter tyder på at forsterkningen av en ekstra kromosom utøver anti-proliferative effekter [14], [15], Andre hevder at fremkalle aneuploidi avvik forekomme ved en premalign trinn [10], [16], [17], [18] som resulterer i kromosom variasjoner og neoplastisk fenotype [9].
Flere kromosom duplikasjoner er ofte blitt observert i mange typer kreft. Blant disse, tilbakevendende forsterkning og forsterkning av den lange arm av kromosom 20 (20Q) er observert i 90% av pankreas cellelinjer [19], 15 til 83% av pankreas adenokarsinom [20], omkring 70% av primær gastriske cancere [21] og for tykktarmskreft [18], [22], 50% av eggstokkreft og livmorhals og 90% av brystkreft [23] kreft. Gevinsten av 20Q kromosom arm ble også vist seg å være en svært hyppig hendelse på tidlige stadier av prostata kreftutvikling [24], [25]. I tillegg ble forsterkningen i 20Q kromosomale region merke til forbigående i tidlige passasjen lagre av human mammary fibroblaster, udødeliggjort med hTERT og SV40 stort tumor oncoprotein [26]. Merkbart, i nesten alle disse studiene 20Q er den hyppigste forsterkning, og sletting av denne armen er svært sjeldne. Videre er det flere studier viser at forsterkningen av 20Q er korrelert med dårlig prognose [27], aggressiv svulst fenotype, progresjon [28] og metastasedannelsen [19], [29], [30].
Vurdere om kromosom ubalanser spille en utløsende rolle i tumordannelse, i motsetning til å være tilskuere er en vanskelig oppgave. Studier gjort på kliniske prøver, både kromosomale aberrasjoner og genekspresjon blir hindret av en rekke forvirrende faktorer, som stammer fra forskjellige genetiske bakgrunner av pasienter, variable og uncharacterized mutasjoner i tumorer, og de ukontrollerte forurensninger ved inflammatoriske, endotel, og stromal celler. For å overvinne disse hindringene, vi tidligere har etablert en in vitro-transformasjonsmodellen basert på de humane lungefibroblaster, WI-38, noe som ga opphav til identifisering av genekspresjon signaturer [31], [32], [33] assosiert med genetiske avvik [ ,,,0],34]. I tillegg er menneskelige solide svulster vanligvis hentet fra resections utført på et tidspunkt når svulsten er allerede fullt utviklet, noe som utelukker tilgang til viktig informasjon om tumor initiering og progresjon.
For å få ny innsikt i tidlige stadier av transformasjon og genetiske nettverk forbundet med kromosomavvik, vi brukte en in vitro modell av prostata cellulær transformasjon. I denne modellen primære prostata epitelceller som tidligere ble udødeliggjort ved å innføre den katalytiske subenhet av telomerase, ble hTERT (EP156T) [35] dyrket i kultur under kontrollerte forhold. Den spesifikke Hensikten med denne studien var å undersøke hypotesen om at en bestemt genomisk avvik forekommer ved tidlig stadium av kreftutvikling er ledsaget av endringer i genuttrykk som kan tjene som en pådriver for tumorigenesis. Etter 650 dager i kultur de EP156T avledet cellene delte flere fenotypiske, Kromosom og transkripsjons attributter med prostatakreft prøver. Vi rapporterer her på to hovedfunn. Den første er fremtredende og tidlig rolle 20Q forsterkning i utviklingen av vår in-vitro cellekultur mot en pre-malign fenotype, med en forbedret spredning rate. For det andre, forklarer vi malignitetspotensiale av 20Q dobbeltarbeid ved å identifisere 13 «kreft initiere gener», som ligger på 20q13, som er over-uttrykt i flere typer kreft, og hvis uttrykket er korrelert med tumor klasse og utfall.
Materialer og metoder
Utarbeidelse av cellelinjer
Normale menneskelige prostata celler udødeliggjort av telomerase introduksjon [35] ble dyrket i kultur i 650 dager, der de ble analysert for cellevekst, kromosom~~POS=TRUNC forandringer og ekspresjonsanalyse. hTERT forlenges kromosomalt ender hindre replikasjons senescens av flere typer normale humane celler [36]. de hTERT udødelig EP156T celler ble betegnet her som N-linje (figur 1). den C, G og M linjer ble avledet fra N linje (figur 1) etter 25 passeringer (tilsvarende ca. 150 dager). for dette formål, ble en mutant av tumor suppressor p53 (p53R175H) klonet inn i en retroviral vektor PLXSN innført i N-linjen. de nye celler, som stabilt uttrykker den p53R175H mutant, ble utpekt M linje. I parallelle N-celler ble også infisert med PLXSN vektor inneholdende GSE56 sekvens som koder for et kort peptid som inaktiverer p53 tumor suppressor-gen i en dominant negativ måte, [37], noe som ga opphav til G linje. Den tomme PLXSN plasmid ble brukt som en kontroll generere C linjen. Onkogen H-RasV12 klonet inn i pBabe-hygro retrovirale plasmid ble anvendt for infeksjon av C, G og M linjene like før passasje 80 generering av C8R, den G8R og M8R cellene, respektivt. Ytterligere linjer er laget av infeksjon av sen passasjen N-celler med PLXSN plasmid som koder for enten p53R175H mutant (N8M), den GSE56 (N8G) eller med det tomme plasmidet (N8C) (figur 1). Infeksjonen ble fulgt ved å holde cellene i to uker i nærvær av 400 ug /ml neomycin (for celler infisert med den PLXSN vektor) eller med 50 ug /ml Hygromycin (for celler infisert med den pBabe-hygro vektor) for å kunne velger for stabil ekspresjon av de innførte plasmider. Den retrovirale infeksjonen Prosedyren er beskrevet i [32]. Vekstbetingelser og mediekomponenter er beskrevet i [35].
Skjematisk fremstilling av de viktigste avledede kulturer av EP156T prostata epitelceller. Hver linje står for subkulturen generert in vitro ved innføring av spesifikke genetiske modifikasjoner. X-aksen representerer antall passasjer i kultur (ca en uke per passering). Brikken symbolene representerer punkter hvor cellene ble samlet og deres RNA hybridiserte til mikromatriser; koden for den resulterende prøve, f.eks G5, representerer linjen (G) og omtrentlig antall (50) passasjer i kultur dividert med ti. Kromosomet symbolet indikerer en SKY måling.
Gene expression profilering langs utviklingen prosessen med EP156T avledet kulturer
For genuttrykk profilering, prøver ble tatt på 32 poeng sammen dyrking prosessen og hybridiserte med Genechip human Genome U133A 2,0 Array (figur 1). De mikromatriser ble preprocessed hjelp RMA [38] og normalisert. Alle data er MIAME kompatibel; rådata har blitt deponert i en GEO database. GEO rekordmange er- GSE23038. De 5000 mest varierende gener ble sortert etter SPIN algoritmen [39] og gruppert ved hjelp av SPC [40] for å identifisere 2 hoved stabile klynger av gener med en korrelert mønster av uttrykk.
Spectral Karyotype Analysis (SKY)
Eksponensielt voksende celler ble inkubert med Colcemid (0,1 ug /ml) over natten, trypsinert, lysert med hypoton buffer, og fast i iseddik /metanol (01:03). Kromosomene ble samtidig hybridisert med 24 combinatorially merket kromosom maleri prober og analysert ved hjelp av SD200 spektral Bioimaging system (Applied Spectral Imaging Ltd., Migdal HaEmek, Israel).
S-fase analyse
Subkonfluente kulturene ble merket i en time med 10 uM BrdUrd (Sigma). Cellene ble løsnet med trypsin, fiksert i 70% etanol, og behandlet som følger (PBS-vaskinger mellom hvert trinn): 2 M HCl og 0,5% Triton X-100 i 30 minutter ved romtemperatur; 0,1 M Na
2Br
4O
7 ved pH 8,5; FITC-konjugert anti-BrdUrd (Becton Dickinson) fortynnet 1:03 i PBS /1% BSA /0,5% Tween 20 i 1 time ved romtemperatur; og til slutt, 5 ug /ml propidiumjodid og 0,1 mg /ml RNase A. Prøver ble analysert ved to-dimensjonal strømningscytometri for å detektere både fluorescein og propidiumjodid fluorescens ved anvendelse av en fluorescens-aktivert cellesorterer (FACS) (Becton Dickinson). Minst 10.000 celler ble analysert per prøve.
Isolering av Total RNA
Total RNA for microarray eksperiment og for Kvantitativ Real Time PCR (QRT-PCR) ble isolert ved hjelp NucleoSpin RNA ekstrakt kit (Macherey -Nagel), i henhold til produsentens protokoll.
Kvantitativ real Time PCR (QRT-PCR)
En to mikrogram delmengde av den totale RNA ble revers transkribert ved hjelp MMLV RT (Promega) og tilfeldig heksamerprimere. QRT-PCR ble utført ved anvendelse av SYBR-grønn PCR-Master Mix reagens (Applied Biosystems) på en ABI 7300-instrument (Applied Biosystems). Ekspresjonsnivået for hvert gen ble normalisert til den av GAPDH husholdningsgenet i den samme prøven. Primerne ble utformet med Primer Express-programvaren. Primer sekvenser er tilgjengelig på forespørsel.
The Expression Karyotype
Expression data ble tidligere brukt til å utlede kromosomavvik [41], [42]. Vår arbeidshypotese er at endringer i kopiantallet av DNA av en hel kromosom eller en del av det blir reflektert i genekspresjon. Sletting av en kromosom bevirker, i gjennomsnitt, nedregulering i uttrykket av gener som kromosom, mens duplisering bør bli reflektert av et høyere ekspresjonsnivå. For å identifisere kromosomale ubalanser, sammenlignet vi ekspresjonsnivåer av gener som befinner seg på hver kromosomale arm, i hver prøve, til en referanseprøve av normale celler (N0), og søkte etter signifikante forskjeller i ekspresjonsnivåer. Vi innførte her en fremgangsmåte for å Kromosomalt Ubalanse Analysis, basert på en paret t-test, for å utlede kromosomal kopi nummerinformasjon fra ekspresjonsdata. Kromosomal ubalanse Analysemetoden er beskrevet, testet og sammenlignet med en tidligere avledet teknikk [42] i den supplerende tekst S1, se fig S1 og S2.
Sammenligning av de to beregningsmetoder med SKY
To fremgangsmåter er blitt brukt for å identifisere «uttrykk karyotype» i prøver. Bruke kromosom Ubalanse Analyse vi beregnet, for hver prøve
s
, en P-verdi for hvert kromosom for å teste om den gjennomsnittlige forskjellen mellom genene i N0, sammenlignet med prøven
s
, er forskjellig fra null. Binomial tilnærmingen [42] bestemmer hvorvidt en signifikant del av genene på kromosom er over-uttrykt i
s
versus N0 (eller underuttrykt). For mer informasjon om forskjellene mellom de to tilnærmingene se utfyllende tekst S1.
De innhentet av SKY resultatene, som ble brukt til å beregne prediktiv kraft av de to beregningsmetodene, ble analysert som følger. Hvis ble det observert et kromosomalt avvik på mer enn 50% av karyotyped celler, ble det ansett som en sann avvik; ellers ble det tolket som støy og fjernes fra analysen. Ved hjelp av denne definisjonen av himmelen resultatene som «bakken sannhet», sammenlignet vi resultatene av de to beregningsmetoder, ved hjelp av mottakeroperasjonelle egenskaper (ROC) analyse (se figur S2). Forestillinger av de to metodene var like, og vi vedtok kromosom Ubalanse Analyse her.
kromosom Ubalanse Analyse sammenheng
Denote av
E
gs
uttrykket nivå (etter pålogging og terskelverdier) av probeset
g
i prøven
s
. For hver probeset g i prøven
s
vi beregne Δ
E
gs
=
E
gs Anmeldelser –
E
g
N0. Beregn for hver prøve
s
medianen av Δ
E
gs
for betydelig endring probeset fra 20Q (som definert i tilleggs Tekst S1 på kromosom Ubalanse Analysis), for å få
M
s
. For hver probeset
g
fra 20Q vi beregne Pearson korrelasjon mellom de to sett med tall:
E
gs Hotell og
M
s
, og samtalen dette som kromosom Ubalanse Analyse korrelasjon av probeset
g plakater (med uttrykket karyotype av 20Q).
Konstruere den karyotype evolusjonære treet
Vi konstruerte en «karyotype evolusjonære treet» kombinere data fra himmelen resultater og uttrykket karyotype. Den normale Karyotype «arter» (46, XY) var roten /stamfar til alle utviklet seg Karyotyper. Treet ble konstruert manuelt ved hjelp av data fra både uttrykket karyotype og SKY. Hvis dataene fra uttrykk karyotype ikke var i samsvar med himmelen data på et bestemt punkt, interpolert vi oppførselen til to tilstøtende poeng, forutsatt at vi arbeider med en kontinuerlig prosess.
Kopier nummer analyse
Ultra-høy oppløsning Affymetrix Genome-Wide menneskelige SNP matriser 6.0 ble brukt for å undersøke kjøpt genomisk kopinummerendringer og tap av heterozygositet av EP156T celler. Genomisk DNA ble renset ved hjelp av Tissue DNAkit (Kat. Nr D3396-02, EZNA, OMEGA Biotek). DNA prehandling og rekke hybridisering ble utført i henhold til produsentens anvisninger (P /N 702504, Rev3, Affymetrix, Santa Clara, CA), og skannes i en Affymetrix Genechip Scanner 3000. Kvalitetskontroll, genotype kall, sonde nivå normalisering og kopiere nummer normalisering å produsere logge
2 forhold ble gjort i Affymetrix GeneChip® Genotyping Console v3.0.1. En in-house referanse fil generert fra 59 friske blodgivere ble brukt. Dataanalyse og visualisering ble utført i kromosom analyse suite med en terskel på minimum 100 kb og 20 markører. Avvik rapporteres i henhold til ICSN nomenklatur og NCBI bygge 36.
Nettverk og grafiske fremstillinger
Data ble analysert ved bruk av Oppfinnsomhet Pathways Analysis (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com). Nettverket er en grafisk fremstilling av de molekylære forhold mellom gener /genprodukter. Gener eller genprodukter er representert som noder, og den biologiske forholdet mellom to noder blir representert som en kant (line). Alle kanter er understøttet av minst en referanse fra litteraturen, fra en lærebok, eller fra kanonisk informasjon som er lagret i oppfinnsomhet Pathways kunnskapsbase. Menneske, mus og rotte ortologer av et gen blir lagret som separate objekter i Ingenuity Pathways Knowledge Base, men er representert som en enkelt node i nettverket. Noder vises ved hjelp av ulike former som representerer funksjonsklasse av genproduktet.
Resultater
En in vitro modell for tidlig prostata kreft
For å følge den opprinnelige progresjon stadier mot kreft i prostata kreftutvikling, har vi etablert et system basert på hTERT-udødelig benign prostata epitel (EP156T) celler [35]. Disse immortaliserte celler betegnes her som N linje. Ved passering 25, ble N celler manipulert til over-express reagenser som inaktiverer tumor suppressor p53. For dette formål, ble p53R175H mutant av tumor suppressor p53 klonet inn i en retroviral vektor PLXSN innføres i N linje parallelt med GSE56, en p53-inaktiverende peptid, klonet inn i PLXSN vektor, og med en tom PLXSN plasmid som en kontroll . De fire udødeliggjorte cellelinjer, inkludert normal (N), transduseres med GSE56 (G), med mutant- p53R175H (M) og med en tom vektor for kontroll (C) ble dyrket i ytterligere 500 dager in vitro. Figur 1 viser skjematisk denne modellen. Gjennom dette manuskriptet, blir prøver betegnet med LX, hvor L = N, G, M eller C, og henvisningstallet x indikerer antall passasjer (± 3) ved hvilken den spesifikke prøven ble tatt, dividert med ti (f.eks G4 representerer prøve tatt fra GSE linje ved passering ~40). Like før passasje 80, onkogeniske Ras (H-RasV12) ble innført i C, M og G linjer som ga C8R, M8R og G8R linjer, henholdsvis som vist i figur 1. For å oppnå dette, H-RasV12 onkogen klonet inn pBabe- hygro retrovirale vektor ble anvendt. I tillegg ble de retrovirale reagensene som er beskrevet ovenfor brukes til å over-uttrykke GSE56 og mutant p53R175H i cellene i N linje på et sent passasje, genererer den N8G, N8M og N8C linjer (figur 1). En retroviral infeksjon ble etterfulgt av to uker med medikamentseleksjon for å indusere stabil ekspresjon (se Materialer og Metoder). For å få et helhetlig bilde av de evolusjonære endringer i løpet av langvarig dyrking av cellekulturer, ønsket vi å kombinere analyser av cellevekst, kromosomale endringer og uttrykk profilering sammen 650 dager i kulturen i N, C, G og M linjer. For å oppnå dette målet, ble cellene samplet langs denne perioden, og analysene av celleproliferasjon, genekspresjon og karyotype ble utført (figur 1).
Ved etableringen av vår in vitro transformasjonsmodellen, var det viktig å evaluere om dette systemet kan representere in-vivo human kreft på en pålitelig måte. For å nå dette målet, undersøkte vi hvorvidt langs 650 dager dyrking, de EP156T celler kjøpt molekylære og fenotypiske egenskaper som er typiske for faktiske svulster. Ettersom cellulær proliferasjon er den grunnleggende trekk ved krefttransformasjonen, celleveksthastighet og andelen av prolifererende celler (i. E., Cellene ved det S-fasen av cellesyklus), ble vurdert. Faktisk, en økning i celleveksthastigheten var tydelig når cellene dyrking kommet (figur 2A). I overensstemmelse med dette, ble en større andel av prolifererende celler detektert ved senere passasjer, som bedømt ved BrdU-merking og FACS-analyse (figur 2B). I tillegg, ekspresjon av p16INK4a svulsthemmer-gen ble redusert med tiden i kultur i alle fire cellelinjer (figur 2C). Reduserte nivåer av p16INK4a blir ofte observert i avanserte prostatakreft [43] og ble funnet å være en av de sentrale hendelser i en in vitro-transformasjonsprosess av humane fibroblaster WI-38 [31], [32], [33]. Deretter ønsket vi å undersøke om genuttrykk mønster av EP156T-avledet kulturer minner om in vivo svulster. For å oppnå dette mål, ble den følgende analyse utført. Ved genekspresjon profilering av EP156T celler, ble en gruppering analyse utført for å identifisere gener med korrelerte uttrykk mønster. Ekspresjons mønstre av de to mest fremtredende klynger er presentert i figurene 2D og 2E. Den første klyngen (figur 2D) inneholdt 177 transkripsjoner som ble opp regulert over tid i kultur. Når undersøke Gene ontologi (GO) berikelse med David programvare [44], fant vi at disse genene var assosiert med celleproliferasjon. Dermed er denne klyngen kalt «spredning klynge» sammen manuskriptet. Denne trenden med uttrykket ble validert ved QRT-PCR på tre representative gener (Figur S3). Den andre gruppen (figur 2E) inneholdt 296 glykoprotein og celleadhesjonsmolekyl-transkripter og deres ekspresjon negativt korrelert med spredning klyngen. For å evaluere hvorvidt disse forandringer i gen-ekspresjon kan være relatert til transformasjonsprosessen av EP156T celler, undersøkte vi ekspresjon av genene i begge klynger i et datasett av 99 prøver, oppnådd fra normal prostata, tumor og metastasering av prostata kreftpasienter [45 ]. Påfallende, uttrykket av gener fra begge grupper signifikant korrelert med deres uttrykk i dette settet av kliniske kreftprogresjonsprøver (figur 2D og 2E, nederst). Oppdagelsen av at den genuttrykk mønster av vår in vitro modell ligner som av avansert prostatakreft, tyder på at denne modellen rekapitulerer de molekylære hendelser som oppstår i løpet av in vivo malign transformasjon av prostatakjertelen. Den detaljerte analyser av disse klyngene og forhold til in vivo data er gitt i tekst S1. Sammen utgjør disse observasjonene tyder på at under langvarig in vitro dyrking av EP156T prostata immortaliserte celler, en utvelgelsesprosess fant sted som favoriserer overlevelse av celler med høyere proliferative kapasitet som kan føre til en transformert fenotype.
A. Antall populasjonsdoblinger av EP156T-avledet kulturer (C, G og M) beregnet på 50-dagers intervaller i løpet av den 650-dagers kulturperiode etter hTERT infeksjon, sammen med antallet populasjonsdoblinger utført av ikke-infiserte EP156 celler i den første 50 dager i kultur og EP156T (N) celler i løpet av de neste 100 dager i kultur. B. Prosentandel av prolifererende celler (S-fase) ble målt med BrdU-merking av tidlig passasje (C4) og sen passasje (C8) celler. C. sanntid QRT-PCR for p16INK4a uttrykk i ulike prøver av EP156T system. D. Topp: Expression matrise av en klynge av gener som uttrykk økte i transformasjonsprosessen. Innenfor hver linje prøvene er bestilt fra tidlig til sent passasjer. Nedre panel: den midlere uttrykksmønster av disse genene i prøver fra prostatakreftpasienter [45]. P-verdien for forskjellen i uttrykket mellom normal og kreft er p = 0,00024 og fra normal og kreft til metastasering er p = 0,00013. E. Top: Cluster av gener som inneholder overrepresentert glykoprotein og ekstracellulære regiongener, er prøvene for hver linje bestilles fra tidlig til sent passasjer. Klyngen er nedregulert i løpet av transformasjonsprosessen. Den nederste grafen viser gjennomsnittlig uttrykk for klyngens gener i kreftprøver [45]. P-verdien for forskjellen i uttrykket mellom normal og kreft er p = 0,00013 og fra normal og kreft til metastasering er p = 0,00023.
Eksogene innføringen av telomerase indusert immortalization av EP156T celler på grunn av telomere forlengelse som var tydelig etter å opprettholde cellene for lengre tidsrom in vitro [35]. Videre er over-ekspresjon av mutant form av p53 tumor suppressor og av p53 inaktive peptid GSE56 ble også opprettholdt i lang tid etter at de ble introdusert til cellene. En detaljert analyse av de spesifikke funksjoner av mutant p53R175H over-uttrykt i EP156T celler er presentert i [46]. Retensjonen av telomerase og endrede former av p53 i EP156T celler over tid tyder på at disse genene kan spille en rolle i opprettholdelsen av transformasjonen.
20Q forsterkning dukket opp, og dominerte cellepopulasjon ved tidlige stadier av prosessen
kromosomavvik.
Vi snudde for å undersøke kromosomkopinummervariasjoner i våre celler, ettersom disse har blitt funnet å være relatert til kreft fenotyper. For å oppnå dette, beregnet vi kromosomaberrasjon mønster på befolkningsnivå ved hjelp av matematisk analyse av uttrykk data (se metoder), og på nivået av enkeltceller ved hjelp av spektral karyotypering (SKY). Vi brukte våre data for å følge tidsmessige utviklingen av «uttrykket karyotype» – dvs. de kromosomavvik, som de ble reflektert i genuttrykk mønster. Våre data utgjør en reell tidsserie, som gir oss betydelige fordeler i å identifisere utviklingen av de dominerende kromosomavvik.
«uttrykk karyotype» avslørte betydelig tidsmessig variasjon i uttrykket nivåer av genene til flere kromosomarmer for de forskjellige linjer (figur 3). Kromosom arm 20Q viste de mest markante endringer i uttrykk og ble assosiert med de mest betydningsfulle p-verdiene i alle linjene. Sammenlignet med N0, ekspresjonen av 20Q viste omtrent 1,5 gangers økning i den N linje og i de første passasjene i M, G og C linjer. Interessant, i slutten av passasjene i M, G og C linjer denne ganger endring økt til ~1.8. Disse resultatene tyder på at celler med en trisomy av 20Q dominerte cellepopulasjon ved tidlige stadier av prosessen, og i C, G og M linjer sekundære hendelser fulgt og skapt mer enn 3 eksemplarer av 20Q arm. Andre avvik som ble observert var presiseringer av 9q og 13q i N linjen; av 7p, 7Q, 18q og, senere i prosessen, av 3p i C-linje; forsterkning av 9 p, 11 p og mindre vesentlig, av 13q i G linjen; i M-linjen vi identifisert, i tillegg til amplifikasjoner av 13q og 20p, også delesjoner av 10p og kromosom 16 (etter passasje 60).
Ekspresjon nivået for hvert gen kommentert til et bestemt kromosomalt arm ble sammenlignet med dens uttrykket nivå i N0 prøven (EP156 primære celler ved passering 8) som representerer foreldre kultur av alle fire linjer. For hver av de N, C, G og M linjer (se tekst) det øvre felt viser koordinerte endringer i median av ekspresjonen av gener som er merket til spesifikke kromosomale regioner, dividert med sin midtlinje ekspresjon i N0. Den nedre panel er -log
10 (p-verdi) av den parede t-test mellom genene i N0 og de andre prøvene (x-akse) på et bestemt kromosomalt arm. Figuren viser de statistisk signifikante kromosomarmer (p-verdi 0,001 og median ganger endring 1.5 eller 0,5 minst på ett punkt).
Vi utførte 24 SKY målinger på ulike stadier av prosessen; i hvert undersøkte vi mellom 4-10-celler (resultatene er oppsummert i tabell 1). SKY, i samråd med uttrykket karyotype, identifisert duplisering av kromosomer 20, 3, 7, 9, 18 og sletting av 16 langs de forskjellige linjene. I tillegg trans involverer kromosomer 10, 11 og 20 som ble identifisert av SKY, ble anerkjent som slettinger /duplikasjoner av uttrykket karyotype (som vil bli diskutert nedenfor).
På flere punkter SKY resultater ikke oppfører seg i henhold til våre forventninger (tabell 1). For å utføre SKY analyse ble cellene tint og re-vokst på flere punkter i stedet for å bruke nøyaktig den samme befolkningen som ble tatt for mikromatriser. Dermed grunnleggereffekten kan være ansvarlig for uoverensstemmelser mellom ulike SKY resultater (f.eks duplisering av kromosom 7 i passasjen 41 er i strid med passasjer 31 og 52) og mellom SKY og uttrykket karyotype observert på noen punkter (f.eks duplisering av kromosom 18 i C linjen eller sletting av kromosomene 13 og 5 i prøven N8).
The karyotype evolusjonære treet.
for å forstå bedre de evolusjonære prosesser som fant sted i løpet av eksperimentet vårt, vi bygget en «karyotype evolusjonære treet» (figur 4) å kombinere data fra himmelen resultater og uttrykk. I likhet med andre evolusjonære trær, den «karyotype evolusjonære treet» tillater oss å forstå bedre hvilke Karyotype «arter» dukke opp, utvikle seg eller bli utryddet i løpet av prosessen. Den evolusjonære treet påpeker egenskap (i vårt tilfelle den spesifikke innsetting, sletting eller avvik) som gir den valgte karyotype vekst fordel over andre Karyotyper. Dersom dataene fra uttrykket karyotype ikke var i overensstemmelse med dataene fra SKY analyse på et bestemt punkt, interpolert vi oppførselen til to tilstøtende punkter (se Metoder). For eksempel, himmelen resultatene i C linjen viste celler med kombinasjoner av flere presiseringer og slettinger. Selv om flere mulige konstruksjoner av den C-linjen treet var mulig, bevis fra både uttrykket karyotype og fra SKY foreslått at den mest dominerende virkning i disse cellene var duplisering av kromosom 7 (ved passering 40), fulgt av duplisering av kromosom 18, som senere var etterfulgt av duplisering av kromosom 3. på den annen side uttrykket karyotype i prøver C6 og C7 viste uventet reduksjon i median-fold forandringer av alle de avvikende kromosomene (se figur 3). Vi tror at SKY representerer mer nøyaktig den virkelige karyotype på følgende tidspunkter.
Figuren ble generert på basis av de 24 SKY resultatene langs prostatakreft transformasjonsprosessen og uttrykket karyotype. Normal prostata menneskeceller (venstre side av figuren) ble brukt til å etablere fire udødelig forskjellige linjer: GSE, kontroll, Normal og Mutant p53 (se tekst) som sprer under 80 passasjer (x-aksen).
