Abstract
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDA) er en svært dødelig sykdom, som vanligvis diagnostisert i et avansert stadium. Vi har etablert transgene rotter bærer et mutert K-
ras
genet kontrolleres av Cre /loxP aktivering. Dyrene utvikler PDA som er histopathologically lik den som hos mennesker. Tidligere rapporterte vi at serumnivåene av N-ERC /mesothelin var signifikant høyere hos rotter som bærer PDA enn i kontrollene. I denne studien, for å avgjøre om serum nivåer av N-ERC /mesothelin korrelert med tumorstørrelse, vi målte N-ERC /mesothelin nivåer hos rotter bærer PDA. Økte serumnivåer av N-ERC /mesothelin korrelert med økt tumorstørrelse. Dette resultatet indikerer en innbyrdes mellom serumnivået av N-ERC /mesothelin og tumorstørrelse. Vi neste undersøkte effekten av kjemoterapi på serum N-ERC /mesothelin nivåer. Rat kreft i bukspyttkjertelen celler ble implantert subkutant i flanken av NOD-SCID mus. I musene som ble behandlet med 200 mg /kg gemcitabin, tumorvekt og serumnivået av N-ERC /mesothelin ble signifikant redusert sammenlignet med kontrollene. Disse resultatene tyder på at serum N-ERC /mesothelin målinger kan være nyttig for å overvåke effekten av behandlingen
Citation. Fukamachi K, Iigo M, Hagiwara Y, Shibata K, Futakuchi M, Alexander DB, et al. (2014) Rat N-ERC /Mesothelin som en markør for
In Vivo
Screening of Drugs mot Pancreas Cancer. PLoS ONE 9 (10): e111481. doi: 10,1371 /journal.pone.0111481
Redaktør: Mohammad Saleem, Hormel Institute, University of Minnesota, USA
mottatt: 02.06.2014; Godkjent: 25 september 2014; Publisert: 27 oktober 2014
Copyright: © 2014 Fukamachi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Tilpasningsdyktig og sømløs overføring av teknologi Program gjennom target-drevet R D (A-STEP) fra Japan Science and Technology Agency; en Grant-in-Aid for Scientific Research (C) fra Japan Society for Promotion of Science; en Grant-in-Aid for forskning i Nagoya City University; Aichi Cancer Research Foundation; Program for utvikling av bæresystemet for oppgradering av utdanning og forskning fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi; og en Grant-in-Aid for Cancer Research (17S-6, 20S-8) fra Helsedepartementet, Arbeids- og velferds. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Yoshiaki Hagiwara er ansatt i Immuno-Biologiske Laboratories. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. De resterende Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Innledning
N-ERC /mesothelin er en 31-kDa protein som danner den N-terminale fragment av full-lengde 71 kDa ERC /mesothelin protein og utskilles i blodet av mesothelioma pasienter [1] – [3]. Rotta
Erc plakater (uttrykt i nyrecellekarsinom) genet ble identifisert som et høyt uttrykt gen i nyrecellekreft i Eker rotte [4], [5]. Den menneskelige homolog av rotte
Erc
er
Mesothelin Twitter /
megakaryocytt poten faktor product: (
MPF
) genet [6] – [8]. ERC /mesothelin er også uttrykt i ovarie og bukspyttkjertel karsinom vev hos mennesker [9] – [12]. N-ERC /mesothelin anses å være relevante for å overvåke kjemoterapeutisk respons hos pasienter med mesothelioma [13], [14].
Pancreatic duktalt adenokarsinom (PDA) bærer den mest sturen prognose av alle faste tumorer [15] . Vi har etablert transgene rotte linjer bærer en human H
ras
G12V (Hras250) [16] eller et menneske K
ras
G12V (Kras301, Kras327) [17] onkogenet i hvilken ekspresjonen av transgenet er regulert av Cre /loxP-systemet. Målrettet aktivering av transgenet blir oppnådd ved injeksjon av en Cre rekombinase-bære adenovirus (AxCANCre) inn i de pankreatiske kanaler gjennom den felles gallegang. Neoplastiske lesjoner i transgene rotter vise morfologiske [16], [18] og biologisk [17], [19] – [21] likheter med det som ble observert i menneskelige bukspyttkjertelen lesjoner. Vi har tidligere rapportert at N-ERC /mesothelin lett påvises i serum fra rotter som bærer bukspyttkjertel ductal adenokarsinomer [17]. I denne studien rapporterer vi bruk av N-ERC /mesothelin som et serum markør for evaluering av effekten av kjemoterapi.
Materialer og metoder
Dyr
Mann K
ras
G12V transgen (Kras301) rotter (JCL: SD rotte bakgrunnen) ble etablert som tidligere rapportert [17], [18]. Homozygote rotter ble samlet ved avl heterozygote hannrotter med heterozygot hunnrotter. Homozygote transgene rotter ble identifisert ved semi-kvantitativ PCR og deretter bekreftet ved genetisk testing. Kras301 rotter ble avlet for å få levedyktige og frukt homozygot transgen avkom. Fisher344 (F344 /DuCrlCrlj) rotter ble kjøpt fra Charles River Japan, Inc. (Yokohama, Japan). Sprague-Dawley (SD) rotter (JCL: SD) ble oppnådd fra CLEA Japan (Tokyo, Japan). SD (Sic: SD) og Wistar (Sic: Wistar /ST) rotter ble hentet fra Japan SLC, Inc. (Hamamatsu, Japan). Rottene ble opprettholdt i plastmerder i en luftkondisjonerte rom med en 12-timers lys /12-h mørke syklus. Alle forsøkene ble utført i henhold til retningslinjer for dyreforsøk i Nagoya City University Graduate School of Medical Sciences, og godkjent av Animal Care og bruk komité i Nagoya City University Graduate School of Medical Sciences (H21-02, H22M-24) .
tumorfremkallelse og patologisk undersøkelse
Cre-uttrykk adenovirusvektorer ble amplifisert i HEK293-celler og deretter renses ved hjelp av Vivapure Adenopack (Vivascience, Hannover, Tyskland) som tidligere rapportert [17]. Pankreas-tumorer ble indusert som tidligere beskrevet [16] – [22]. Bukspyttkjertelen ble fiksert i 4% paraformaldehyde og bearbeidet for histologisk observasjon. Anti-rotte C-ERC /mesothelin (306) ble anskaffet fra Immuno-Biological Laboratories (Gunma, Japan), og farging ble utført som tidligere beskrevet [17].
Transplantasjon av en rotte bukspyttkjertel cellelinje og behandlings med gemcitabin
en bukspyttkjertelen karsinom cellelinje (634NOD) ble etablert fra en bukspyttkjertelen svulst fra en Hras250 rotte [17], [23]. 634NOD tumorceller (2 × 10
6) ble transplantert subkutant i seks uker gamle NOD-SCID mus (CLEA Japan, Tokyo, Japan). En uke senere, NOD-SCID mus fikk gemcitabin (2 «, 2»-fluor deoxycytidine; dFdC) hydrochroride (Eli Lilly Japan K.K., Kobe, Japan) i saltvann fire ganger i løpet av ni dager etter intraperitoneal injeksjon. Tumorer ble målt med lengde (a) og bredde (b) i millimeter ved hjelp av målepunktene, og tumorvolumene (V) ble beregnet i henhold til forholdet V = ab
2/2, hvor «a» var den lengste av de to målingene [24]. Syv uker etter transplantasjonen, ble musene avlivet under dyp anestesi isofluran og tumorene ble fjernet og veiet, og serum ble innsamlet for analyse av N-ERC /mesothelin.
Serum test
Serumnivået rotte N-ERC /mesothelin ble kvantifisert ved ELISA (Kode No.27765, Rat N-ERC /mesothelin Assay Kit, IBL, Gunma, Japan) som beskrevet tidligere [25].
Resultater
serum nivå av N-ERC /mesothelin i Kras301 rotter
for å avgjøre om serumnivået av N-ERC /mesothelin er forskjellig i villtype JCL: SD-rotter og heterozygot og homozygot Kras301 rotter, vi analysert N -ERC /mesothelin nivåer i villtype JCL: SD rotter og heterozygot og homozygot Kras301 rotter i en alder av 10 uker: heterozygote F1 rotter ble generert av avl homozygot mannlige Kras301 rotter med kvinnelige JCL: SD-rotter. Det var ingen signifikant forskjell i kroppsvekt mellom hanner eller hunner av de forskjellige genotyper (data ikke vist). Serumnivåene av N-ERC /mesothelin var signifikant forskjellig mellom de tre genotyper (P 0,0001): 28,3 ± 4,0 ng /ml (n = 19) i villtypen JCL: SD-rotter, 51,5 ± 9,2 ng /ml (n = 19) i heterozygot Kras301 rottene, og 77,9 ± 8,2 ng /ml (n = 13) i homozygot Kras301 rotter (figur 1A). Videre er serumnivået av N-ERC /mesothelin i heterozygote F1 rotter var klart høyere enn de opprinnelige heterozygote rotter [17] Hotell
Heterozygot Kras301 rotter ble generert av avl homozygot Kras301 rotter med villtype JCL:. SD-rotter . (A) Serum nivåer av N-ERC /mesothelin i villtype JCL: SD rotter og heterozygot og homozygot Kras301 rotter. (B) Serum nivåer av N-ERC /mesothelin i mannlig (lukket bar) og kvinne (åpen bar) villtype JCL: SD-rotter og heterozygote og homozygote Kras301 rotter. *, ** Og #, P . 0,0001 sammenlignet med hverandre
Det var ingen signifikant forskjell i serum N-ERC /mesothelin nivåer mellom mannlige (30,3 ± 4,2 ng /ml, n = 9 ) og kvinne (26,4 ± 2,8 ng /ml, n = 10) villtype JCL: SD-rotter. I kontrast, var det en signifikant forskjell i serumnivåene av N-ERC /mesothelin mellom mannlige og kvinnelige heterozygote Kras301 F1 rotter (mannlige, 59,2 ± 8,0 ng /ml, n = 8; kvinnelig, 45,9 ± 5,0 ng /ml, n = 11: P 0,0001) og homozygot Kras301 rotter (hann, 83,4 ± 6,2 ng /ml, n = 6; kvinnelige, 73,2 ± 6,7 ng /ml, n = 7: P 0,05) (figur 1B)
.
serum nivå av N-ERC /mesothelin i ulike rottestammer
for å finne ut om den genetiske bakgrunnen påvirket serumnivåene av N-ERC /mesothelin, nivåene av N-ERC /mesothelin i serum var målt i tre forskjellige rottestammer: F344 /DuCrlCrlj, SLC: Wistar /ST, og SLC: SD. Nivåene av N-ERC /mesothelin var signifikant forskjellig mellom rottestammer (P 0,0001) (figur 2A). Nivåene av N-ERC /mesothelin var 45,0 ± 1,5 (n = 12) i F344 /DuCrlCrlj, 31,4 ± 5,9 (n = 12) i SLC: SD og 19,6 ± 3,0 (n = 12) i SLC: Wistar /ST rotter . Nivåene av N-ERC /mesothelin var også signifikant forskjellig mellom hanner av de ulike stammene og kvinner i de ulike stammene (figur 2B). I de individuelle stammer, var det ingen signifikant forskjell mellom hann (n = 6) og kvinner (n = 6) rotter (figur 2B). Videre var det ingen signifikant forskjell mellom JCL: SD (n = 19) og SLC. SD (n = 12) rotter
(A) Strain forskjeller i serumnivåene av N-ERC /mesothelin. (B) Serum nivåer av N-ERC /mesothelin hos menn (lukket bar) og kvinner (åpen bar) av forskjellige rottestammer. *, P 0,0001; **, P 0,005; #, P . 0,0001 sammenlignet med hverandre
Serum nivå av N-ERC /mesothelin korrelert med tumorstørrelse hos rotter
For å avgjøre om serum nivåer av N-ERC /mesothelin korrelert med tumorstørrelse, vi analysert N-ERC /mesothelin nivåer i homozygote Kras301 rotter bærer bukspyttkjertel ductal adenokarsinomer. Voksne hann homozygot Kras301 rotter ble drept 4 uker etter injeksjon av rekombinant AxCANCre inn i bukspyttkjertelen kanalen via felles gallegang: se Fukamachi et al. 2013 [22] for en detaljert beskrivelse av AxCANCre-mediert aktivering av Kras onkogen i Kras301 rotter. Mange grovt synlige hvite tumornoduler ble observert i hele bukspyttkjertelen i transgene rotter. Histologisk undersøkelse viste at disse noduler var adenokarsinomer, som har blitt rapportert tidligere [16], [17]. Neoplastiske lesjoner ble ikke funnet i noen andre organer. Immunhistokjemiske studier viste økt ekspresjon av ERC /mesothelin i carcinoma lesjoner sammenlignet med omgivende normalt vev, som har blitt rapportert tidligere [17]. Videre immunhistokjemiske studier viste ERC /mesothelin ble også positivt uttrykt i bukspyttkjertelen intraepitelial neoplasi (Panin) lesjoner (figur 3).
Farging av ERC /mesothelin i PanIN1 (A og B), PanIN2 (C og D) og PDA (E og F) lesjoner. A, C, E, H E farging; B, D, F, ERC /mesothelin farging. . Bars = 100 nm
En økning i serumnivået av N-ERC /mesothelin korrelert med økt tumorstørrelse (R = 0,89665, P 0,0001, n = 14) (figur 4). Dette resultatet indikerer en innbyrdes mellom serumnivået av N-ERC /mesothelin og tumorstørrelse i disse rottene.
serum nivået av N-ERC /mesothelin i homozygote Kras301 rotter bærer bukspyttkjertelen duktale karsinomer. Serumnivået av N-ERC /mesothelin korrelert med økt tumorvekt (R = 0,897).
N-ERC /mesothelin som en markør av den kjemoterapeutiske virkning av en anti-kreft legemiddel
Vi neste undersøkt om serum N-ERC /mesothelin nivåene ble påvirket av behandling av bukspyttkjertelen adenokarsinom med kjemoterapeutiske stoffet gemcitabin. 634NOD celler [17], som ble avledet fra en bukspyttkjertel ductal adenokarsinom fra en Hras250 rotte, ble implantert subkutant i flanken av NOD-SCID-mus. Etter en uke ble musene administrert gemcitabin (200 mg /kg, i.p.) fire ganger i løpet av ni dager etter intraperitoneal injeksjon. Fra uke til uke 1 7 tumorstørrelsen fortsatte å øke i både kontroll- og de gemcitabin-behandlede mus (Figur 5A). Selv om det, på grunn av den store spredning av tumorstørrelser, er det ikke var en signifikant forskjell i tumorstørrelse mellom de to gruppene, er den gjennomsnittlige tumorstørrelsen var vesentlig mindre i de gemcitabin-behandlede mus sammenlignet med kontrollmusene fra uke 3 til uke 7 ( Figur 5A). Ved slutten av uken 7 ble musene avlivet og tumorene fjernet og veid; den tumorvekten i de gemcitabin-behandlede mus (0,33 ± 0,26 g, n = 9) ble signifikant redusert sammenlignet med kontrollmusene (1,60 ± 1,37 g, n = 10) (P 0,05) (Figur 5B). Det var ingen forskjell mellom morfologisk svulster fra de gemcitabin-behandlede og kontrollmusene (data ikke vist). Ved slutten av uken 7, serumnivået av N-ERC /mesothelin var signifikant redusert (P 0,01) i mus behandlet med gemcitabin (22,4 ± 22,6 ng /ml, n = 9) sammenlignet med kontrollmusene (123,7 ± 100,6 ng /ml, n = 10) (figur 5C). I motsetning til dette, verken tumorvekt og heller ikke serumnivåer av N-ERC /mesothelin var signifikant forskjellig fra kontrollen (n = 10) i mus behandlet med 75 (n = 10) eller 150 (n = 9) mg /kg gemcitabin (figur S1 ). Selv om det på grunn av den store spredning av tumorstørrelser og N-ERC /mesothelin nivåer, var det ikke en signifikant forskjell i tumorstørrelse eller N-ERC /mesothelin nivåer mellom mus behandlet med 75 eller 150 mg /kg gemcitabin og kontrollmusene, gjennomsnittet av begge verdiene var mindre i de gemcitabin-behandlede mus sammenlignet med kontrollmusene. Således serumnivået av N-ERC /mesothelin korrelert godt med effekten av gemcitabin (R = 0,96597, P 0,0001). (Figur 5D)
rotte bukspyttkjertel kreftceller (634NOD celler) ble implantert subkutant i flanken av NOD-SCID mus. Etter en uke ble musene administrert gemcitabin (0 eller 200 mg /kg, i.p.) fire ganger i løpet av ni dager etter intraperitoneal injeksjon. (A) periodiske observasjon av tumorer i NOD-SCID-mus som ble behandlet med gemcitabin (0 mg /kg, åpne sirkler; 200 mg /kg, lukkede sirkler). (B) Den tumorvekten og (C) serumnivået av N-ERC /mesothelin ble signifikant redusert ved behandling med gemcitabin (200 mg /kg, lukkede sirkler) sammenlignet med kontroll (åpne sirkler) (P 0,05, P 0,01 hhv ). (D) Korrelasjonen av svulst vekt og serumnivåer av N-ERC /mesothelin. Serumnivået av N-ERC /mesothelin korrelert med tumorvekt og gemcitabin behandling (R = 0,966). Åpne sirkler, 0 mg /kg; lukkede sirkler, 200 mg /kg.
Diskusjoner
Vi har tidligere rapportert at serumnivået av N-ERC /mesothelin korrelert med tumorstørrelse hos mus med transplantert rotte bukspyttkjertelen kreftceller (634NOD celler) [17]. I denne studien, i samråd med vår forrige rapport, serum nivået av N-ERC /mesothelin korrelert med bukspyttkjertelen tumorstørrelse hos rotter (figur 4). Disse resultatene viste at relativ pancreas tumorstørrelsen kan bli estimert fra serumnivået av N-ERC /mesothelin uten å ofre dyrene. Vi har også vist at N-ERC /mesothelin i serum var en biomarkør som kunne brukes for å overvåke responsen på kjemoterapi. Når mus med tumorer avledet fra transplanterte 634NOD-celler ble behandlet med gemcitabin, tumorvekt og graden av N-ERC /mesothelin i serumet ble redusert sammenlignet med kontrollen. Serumnivået av N-ERC /mesothelin korrelert med den terapeutiske effekten av anti-kreft legemiddel (figur 5). Derfor kan N-ERC /mesothelin anvendes for kvantitativ analyse av den terapeutiske effekten av anticancermidler på bukspyttkjertel cancer i dyremodeller som brukes i denne undersøkelsen.
Serumnivået av N-ERC /mesothelin i homozygot Kras301 rotter var betydelig høyere enn de til vill-type-rotter. Serumnivået av N-ERC /mesothelin i heterozygot F1 av homozygot rotter var også betydelig høyere enn i villtype rotter. Imidlertid serumnivået av N-ERC /mesothelin i de opprinnelige heterozygote rottene var ikke forskjellig fra villtype-JCL: SD-rotter [17]. Homozygot Kras301 rotter ble opprettholdt av avl homozygot mannlige og homozygot hunnrotter. Det er sannsynlig at rotter med høye nivåer av N-ERC /mesothelin ved et uhell ble valgt i løpet av å etablere de homozygote Kras301 rotter.
serum nivået av N-ERC /mesothelin var signifikant forskjellig blant rottestammer (F344 /DuCrlCrlj, Sic: SD og Slc: Wistar /ST). Disse resultater antyder at den genetiske bakgrunn av forskjellige rottestammer påvirker det basale nivået av serum N-ERC /mesothelin. Derfor, for evaluering av kjemoterapeutiske svarene ved hjelp av serum N-ERC /mesothelin, er det viktig å bruke passende kontroller.
N-ERC /mesothelin ble detektert i supernatantene av dyrkede humane bukspyttkjertel kreftceller og korrelert med den uttrykk nivåer av ERC /mesothelin [26]. ERC /mesothelin blir ofte uttrykt i duktalt karsinom, men ikke i normal pankreas [11], [26] – [28]. Dermed kan ERC /mesothelin uttrykk som finnes i både menneskelige og rotte bukspyttkjertel ductal adenokarsinom. Men i motsetning til forventningene, var det ingen signifikant forskjell i serum N-ERC /mesothelin konsentrasjoner mellom bukspyttkjertelen kreftpasienter og friske kontrollgrupper [26]. Derfor, mens N-ERC /mesothelin kan brukes som et serum biomarkør for bukspyttkjertel ductal karsinom i dyremodeller som brukes i den foreliggende undersøkelse, er det ikke egnet for mennesker.
For tiden finnes det ingen effektiv medikament mot bukspyttkjertelen kreft; Derfor, bruk av dyremodeller for å teste responsen til bukspyttkjertelen kreft til behandlingen fortsatt av stor betydning. Bruken av rotte N-ERC /mesothelin som et serum markør ligger i dens evne til å skille mellom rotter med eller uten bukspyttkjertel cancer uten å åpne bukhulen. Gemcitabin er generelt ansett å utgjøre førstelinjebehandling for kreft i bukspyttkjertelen. Den maksimale tolererte dosen av gemcitabin i rotter var 50 mg /kg en gang i uken. Denne dosen hadde ingen effekt på tumorstørrelse i Kras301 rotter. Derfor er serumnivået av N-ERC /mesothelin ble ikke signifikant påvirket hos disse dyrene (våre upubliserte resultater). Spesielt, i mus behandlet med gemcitabin, gemcitabin nivåer som ikke i vesentlig grad påvirker tumorstørrelse ikke påvirker serumnivået av N-ERC /mesothelin (figur S1). Mens gemcitabin alene ikke viser anti-kreft effekt på endogent utviklet bukspyttkjertel kreft i rotter (vår upublisert resultat) eller i musemodeller [29], resultatene som presenteres her demonstrere nytten av N-ERC /mesothelin som et serum markør i overvåking preklinisk prøvelser for behandling i mus og rottemodeller i bukspyttkjertel ductal adenokarsinom: serodiagnosis i dyremodeller kan brukes til å forbedre screening for kandidat kjemoterapeutika som kunne evalueres for menneskelig bruk
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1..
Effekt av gemcitabin i NOD-SCID mus med transplanterte 634NOD celler. Svulsten vekt og serumnivå av N-ERC /mesothelin ble ikke redusert ved behandling med 100 eller 150 mg /kg gemcitabin
doi:. 10,1371 /journal.pone.0111481.s001 plakater (TIFF)
