Abstract
Til tross for flere tiår med innsats for å utvikle effektiv behandling og til å identifisere lovende nye legemidler, er prostatakreft dødelig når den utvikler seg til castration- resistent sykdom. Studier viser mis-regulering av flere veier i kastrering resistent prostatakreft (CRPC), reflekterer heterogenitet av svulstene og også antydet at målretting androgen reseptor (AR) veien alene kan ikke være tilstrekkelig til å behandle CRPC. I denne studien presenterer vi bevis for at Wnt /β-catenin veien kan bli aktivert i prostatakreftceller etter androgen-deprivasjon å fremme androgen-uavhengig vekst, blant annet ved forbedrede interaksjonen av β-catenin med TCF4. Androgen-uavhengig prostatakreftceller var mer tilbøyelige til å aktivere en Wnt-reporter, og hemming av Wnt /β-catenin sti økt følsomhet av disse cellene til andre generasjon antiandrogen, enzalutamide. Kombinert behandling av enzalutamide og Wnt /β-catenin inhibitor viste økt vekst undertrykkelse i både androgen-avhengige og-Uavhengig prostata kreft celler, noe som tyder terapeutisk potensiale for denne tilnærmingen
Citation. Lee E, Ha S, Logan SK (2015) Divergent androgen Receptor og Beta-catenin signale i prostata kreft celler. PLoS ONE 10 (10): e0141589. doi: 10,1371 /journal.pone.0141589
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTERRIKE
mottatt: 04.08.2015; Godkjent: 09.10.2015; Publisert: 28 oktober 2015
Copyright: © 2015 Lee et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Institutes of Health R01CA112226 (SL) og American Cancer Society RSG-11-108-01-CDD (SL). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Forkortelser : AR, androgen reseptor; APC, adenomatøs polypose coli; CRPC, kastrering resistent prostatakreft; DHT, dihydrotestosteron; GSK3, glykogensyntasekinase 3; iCRT3, hemmer av catenin responsive transkripsjon 3; PI3K, phosphatidylinostitol-3 kinase; PTEN, fosfatase og tensin homolog; TCF4, transkripsjon faktor 4; UBE2C, er Ubiquitin-konjugering enzym E2C
Innledning
Prostatakreft er den vanligste kreftformen hos menn [1]. Gitt nøkkelrolle androgen reseptor (AR) signaliserte i sykdomsutviklingen, til dagens konvensjonelle tilnærmingen behandle prostatakreft er androgen deprivasjon terapi ofte kombinert med antiandrogen behandling. Til tross for den innledende tumorregresjon, utvikler aggressiv sykdom kastrering motstandsdyktig prostatakreft (CRPC), for hvilken behandling er den største utfordringen i felten. Nye legemidler rettet mot AR sti som andre generasjon antiandrogen, enzalutamide [2] og abirateron som blokkerer intratumoral produksjon av androgen [3] har vært FDA godkjent for behandling av CRPC. Til tross for løftet om disse og andre behandlingsformer, de forlenge livet ved bare 6-8 måneder [4, 5], indikerer behovet for en ny tilnærming til behandling av avansert sykdom.
På grunn av den komplekse signalnettverk i avansert sykdom, kan inhibering av en bane forårsake uventede responser [6, 7]. I denne sammenheng er det blitt foreslått at prostata tumorer kan også aktivere alternative signalbaner for å kompensere for konsekvensene av AR-inhibering [8, 9]. Interaksjon mellom PI3K og AR veier har blitt godt undersøkt, og faktisk gjensidig tilbakekobling mellom de to baner i PTEN-slettede prostatacancer har blitt rapportert, som indikerer viktigheten av målretting begge baner i PTEN-slettede sykdom [10]. Mer nylig, oppregulering av glukokortikoidreseptor (GR) ble rapportert i enzalutamide-resistente svulster [11], og vist å være nødvendig for den resistente fenotype. Derfor kan terapeutiske tilnærminger som samtidig retter seg mot flere veier være mer effektiv i behandling CRPC [6].
Nylig genomsekvense data har vist misregulation av Wnt-veien i prostatakreft med sykdomsprogresjon. Den komparativ analyse av to separate hel-exome-sekvenseringssett med data, en fra primærsvulster [12], og den andre fra dødelige kastreringsbestandig metastatiske tumorer [13], viste at APC (adenomatøs polypose coli) genet ble hyppig mutert i primær svulster, men mer betydelig mutert i avansert sykdom [14]. Faktisk viser det senere data som Wnt-reaksjonsveien er en av de mest signifikant muterte baner i CRPC [13]. I samsvar med dette, WNT16B sekretet i svulsten mikromiljøet fremmet behandlingsresistens i prostata kreft gjennom aktivering av Wnt /β-catenin vei [15]. Mer nylig ble det rapportert at 18% av tilfellene av metastatisk kastrering resistent prostatakreft utstilt endringer i Wnt veien signaliserer [16]. Disse rapporter tyder på at den Wnt /β-catenin bane kan være en av de kompenserende trasé aktiveres i prostata cancer i respons til androgen deprivasjon. Støtte denne ideen, uttrykk for en aktiverende mutasjon av β-catenin i mus prostata aktivert kontinuerlig prostata vekst etter kastrering [17].
Vår gruppe tidligere utgitt proof of concept studier som viser at et lite molekyl hemmer av Wnt /β-catenin vei, iCRT3 (forkortet til C3) kan redusere AR mRNA uttrykk og transkripsjon av nedstrøms målgener ved å forstyrre β-catenin /TCF interaksjon på AR promoter. Vi viste også at C3 kan forstyrre AR og β-catenin protein interaksjon. De senere protein interaksjonsstudier ble utført i nærvær av høye nivåer av androgen å stabil AR protein nivåer, slik at de ikke ble redusert i nærvær av β-catenin hemmer [18].
Arbeidet er beskrevet i dette manuskriptet viser at aktiviteten av Wnt /β-catenin veien er lav i prostatakreftceller sannsynlig på grunn av preferanse for β-catenin interaksjon med AR snarere enn TCF4 i disse cellene. Vi observerer at undertrykkelse av AR aktivitet ved androgen-deprivasjon, antiandrogen behandling eller AR knockdown fremmet Wnt /β-catenin-målet genuttrykk og dette korrelert med økt samhandling mellom TCF4 og β-catenin. Den forbedrede aktivering av Wnt /β-catenin reaksjonsvei som skyldes vekst av androgen-avhengige LNCaP-celler i fravær av androgen eller i nærvær av antiandrogen. Aktivering av Wnt /β-catenin sti ble også undersøkt i en androgen-uavhengig underlinjen av LNCaP celler, LNCaP-abl (ABL). Abl-celler ble samlet ved kontinuerlig passasje i androgen fattigmedium og selektert for sin evne til å proliferere i androgen belastede tilstanden [19]. Abl-celler var mer utsatt for å Wnt /β-catenin aktivering enn LNCaP-celler, og inhibering av β-catenin aktivitet ved et lite molekyl-inhibitor eller siRNA øket enzalutamide følsomhet i abl-celler. Videre kombinert behandling av enzalutamide og en Wnt /β-catenin hemmer utstilt økt veksthemming i både LNCaP og abl celler, noe som indikerer det terapeutiske potensialet i denne tilnærmingen.
Materialer og metoder
Cellekultur
LNCaP (ATCC, CRL-1740) og LNCaP-abl (ABL) [19] (gave av Z. Culig) celler ble dyrket i RPMI 1640 (Cellgro) supplert med 10% FBS (Hyclone), og 10% trekull strippet FBS (CFBS; serum utarmet med steroider, inkludert androgener), henholdsvis, og 1% penicillin-streptomycin (Cellgro). 22Rv1 (ATCC, CRL-2505) og HEK293 (ATCC, CRL-1573) celler ble dyrket i DMEM (Cellgro) supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin. Følgende forbindelser ble brukt til å behandle celler: C3 (ChemDiv, C523-1410), enzalutamide (Selleck Chemicals) og GSK-3-hemmer (CHIR99021; Stemgent). For celleproliferasjon, QRT-PCR, immunoblot, immunoutfellingsstudier og chip-analyser, LNCaP-celler ble berøvet hormonet i 5% CFBS media i 2-3 dager, og deretter behandlet med androgen med eller uten de ovennevnte forbindelser.
Stabil integrering av EGFP Wnt-reporter i prostatakreftceller
lentiviral EGFP Wnt reporter, 7xTcf-EGFP /SV40-mCherry ble kjøpt fra Addgene (24304). Emballasje celler (HEK293T /17) (ATCC, CRL-11268) ble transient transfektert med 6 mikrogram EGFP Wnt reporter konstruere, 4 mikrogram av emballasje plasmid (psPAX2) og 2 mikrogram av konvolutten uttrykke plasmid (pMD2.G) med Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Media betinget av transfektanter ble oppsamlet etter 24 og 48 timer. LnCap, abl og 22Rv1-celler ble infisert ved inkubering i kondisjonert medium over natten og fikk komme seg etter en dag. Infiserte celler ble passert og valgt av mCherry uttrykk ved hjelp av flowcytometri.
kvantitativ real-time RT-PCR (QRT-PCR)
Total RNA ble isolert ved hjelp av RNeasy kit (Qiagen), og deretter revers transkribert ved 55 ° C i 1 time ved hjelp av Superscript III revers transkriptase og oligo- (dT) 20 primere (Invitrogen). Real-time PCR ble utført ved hjelp av gen-spesifikke primere og 2XSYBR grønn Taq-ready mix (Sigma). Data ble analysert ved DDCT metode med RPL19 som en kontroll genet og normalisert til kontrollprøver, som ble vilkårlig satt til 1.
Immun, immunoprecipitation og farging
For immunoblot analyse ble cellene lysert i Triton-buffer og supplementert med 1 mM PMSF, 1 mM Na
3VO
4, 10 mg /ml leupeptin og 10 mg /ml aprotinin. Protein lysater ble underkastet SDS-PAGE og immunoblottet med følgende antistoffer mot: AR (441), β-catenin (H-102), TCF4 (H-125, Santa Cruz Biotechnology); aktive β-catenin (klone 8E7, Millipore); tubulin (Covance). Proteinbånd ble visualisert ved hjelp av ECL Western Blotting gjenkjenning reagenser (GE Healthcare). Bilde J (NIH) programvare ble anvendt for å kvantifisere protein nivåer.
I immunoutfellingsstudier eksperimentene ble cellene lysert som beskrevet ovenfor. Primære antistoffer som er nevnt ovenfor, ble tilsatt til minst 1,5 mg av totalt protein og inkubert over natten ved 4 ° C etterfulgt av tilsetning av protein A /G-agarosekuler (Santa Cruz Biotechnology) i 2 timer. Immunkompleksene ble vasket grundig med Triton-buffer og solubilisert ved hjelp av Laemmli-prøvebuffer (BioRad). Normal mus IgG (Santa Cruz Biotechnology) eller normalt kaninserum (Sigma) ble anvendt som kontroller.
For immunfluorescens farging ble cellene fiksert med 4% formaldehyd i PBS i 20 minutter, vasket med PBS tre ganger, permeabilisert med 0,2% Triton-X i PBS i 20 minutter ble blokkert med 5% normalt geite og 5% normalt hesteserum i PBS i 1 time, og inkubert med antistoff mot aktiv β-catenin (Millipore) fortynnet i blokkeringsbuffer, over natten ved 4 ° C. Den følgende dag ble cellene vasket med PBS tre ganger, og deretter inkubert med sekundære antistoffer konjugert med FITC (Vector Labs) ved romtemperatur i 1 time. Deretter ble cellene vasket i PBS tre ganger, og montert med DAPI monteringsløsning (Vector Lab). Å analysere EGFP og mCherry nivåer i celler som stabilt integrert med 7xTcf-EGFP /SV40-mCherry konstruerer ble cellene fiksert, vasket og permeabilized som beskrevet ovenfor, og monteres med DAPI monteringsløsning.
Celleproliferering analysen
for CyQUANT celleproliferasjonsanalyse, 3 til 4 x 10
3-celler ble sådd ut i hver brønn av sort 96-brønners plate. Celler ble sådd ut i hormonmangel media inneholdende 5% CFBS og dyrket i 2 til 3 dager, og deretter behandlet med den angitte reagenser for hvert eksperiment. Reagensene ble tilsatt hver to dager med flere medier og en lik mengde hjelpestoff tilsettes til kontrollgruppen. På 2-3 dagers mellomrom, ble CyQUANT analysen (Invitrogen, C35006) utført i henhold til produsentens instruksjoner og analysert på en SpectraMax M5 plateleser (Molecular Devices) kjører Softmax Pro® programvare.
Chromatin immunoprecipitation (chip) assay
brikken ble utført som tidligere beskrevet [20]. Proteiner var dobbelt kryssbundet med DSP (Pierce) i 20 minutter og 1% formalin i 10 min. Celler ble lysert, kjerner som er samlet og resuspendert i sonikeringsbuffer, og sonicationed i 12 min (30 sek. På, 30 sek. Av) i en Bioruptor sonikator (Diagenode, modell XL). Sonikerte lysater ble pre-erte i 2 timer med protein A /G-agarosekuler blokkert med laksesperm DNA (Millipore). Supernatanter ble deretter inkubert over natten med følgende antistoffer: en blanding AR (441) og AR (N-20), eller β-catenin (H-102). Kontroll chip ble utført med normal mus IgG og normal kanin IgG sera. Immunokomplekser ble deretter vasket og kryssbinding reversert. DNA ble isolert med Qiagen PCR rensesett og qPCR ble utført. Relativ berikelse ble beregnet som en prosentandel av 4% innspill normalisert til IgG.
RNA-interferens (RNA-i)
For β-catenin og AR knockdown, siGENOME SMARTpool sirnas mot β-catenin eller AR ble brukt (Dharmacon). For APC knockdown, ble bassenget på tre Silencer® Velg sirnas mot APC (Ambion, s1433, s1434 og s1435) brukes. Cellene ble transfektert med HiPerFect transfeksjon reagens (Qiagen) i henhold til produsentens instruksjoner. 1 X 10
5-celler ble sådd ut i hver brønn av en 24 brønners plate i hormonmangel medium inneholdende 5% CFBS og blandingen av reagens og HiPerFect sirnas ble tilsatt direkte på toppen av cellene. Celler ble dyrket i 2 dager, og deretter behandlet med den angitte reagenser for hvert eksperiment. For CyQUANT proliferasjonsanalyse, 3 til 4 x 10
3-celler ble sådd ut i hver brønn av sort 96-brønners plater i hormonmangel medium inneholdende 5% CFBS og blandingen av HiPerFect reagens- og APC sirnas ble tilsatt direkte oppå celler. Celler ble dyrket i 2 dager, og deretter behandlet med den angitte reagenser for hvert eksperiment. CyQUANT Analysen ble utført ved 2-3 dagers intervaller, som beskrevet ovenfor.
De cellelinjer som stabilt tømt for β-catenin ble samlet med lentiviral pGIPZ shRNA mot β-catenin (Open Biosystems, RHS4430-98912789) eller et kontroll shRNA (Open Biosystems, RHS4743). Etter infeksjon ble cellene sådd ut ved en meget lav tetthet og valgt i 10 dager med 1 ug /ml puromycin (Sigma). Hver motstandsdyktig celle koloni ble samlet og utvidet i valg media for å screene for beta-catenin protein nivåer. To cellelinjer som viser moderat reduksjon av β-catenin ble valgt for å teste enzalutamide følsomhet (sh-β-cat-1 og -2) for å minimalisere sterk veksthemmende virkning av β-catenin knockdown (25).
resultater
androgen behandling undertrykker Wnt-reporter aktivitet i androgen-avhengige LNCaP celler
For å studere Wnt /β-catenin pathway aktivitet i prostatakreft, overvåket vi endogen Wnt /β-catenin aktivitet på en Wnt-reporter oppstrøms EGFP (7xTcf-EGFP /SV40-mCherry). Konstruksjonen uttrykker også mCherry under konstitutivt aktiv SV40 promoter indikerer positivt infiserte celler [21]. LNCaP, LNCaP-abl (ABL) og 22Rv1 prostata kreft celler ble infisert med lentivirus inneholder reporter konstruere og celler som stabilt integrert med konstruksjonen ble valgt av flowcytometri hjelp mCherry uttrykk. Wnt reportergen aktivitet ble testet ved anvendelse av GSK-3-inhibitor (GSK3-i; CHIR99021), en potent Wnt-aktivator [22, 23]. EGFP Wnt rapportøraktivitet, ble øket i nærvær av GSK3p-i, vist ved økt transkripsjon av EGFP i LNCaP-abl-celler som stabilt uttrykker reporter. EGFP transkripsjon ble redusert i nærvær av siRNA målretting β-catenin (figur 1A). Ved hjelp av denne reporteren, undersøkte vi aktiviteten av Wnt /β-catenin banen i androgen-avhengige LNCaP celler, og androgen-uavhengig LNCaP-abl og 22Rv1 celler [24, 25]. På tross av tallrike nivåer av aktiv, kjerne β-catenin (figur 1B), de tre cellelinjene viste lav basal aktivitet av Wnt-reporter (figur 1C). Behandling med GSK-3-hemmer (3 um) aktivert Wnt-reporter aktivitet i androgen-uavhengig abl og 22Rv1 celler (figur 1D), noe som tyder på at økte nivåer av β-catenin var nødvendig for å aktivere Wnt /β-catenin-responsive transkripsjon. Men behandling av androgen-avhengige LNCaP celler med 3 um gsk3-jeg hadde svært liten effekt på Wnt reporter (data ikke vist). I tillegg er Wnt-reporter ble ikke aktivert i nærvær av høyere konsentrasjoner av GSK-3-inhibitor (6 eller 9μM) (Fig 1 D). Fig 1E viser de relative mRNA nivåer av EGFP i hver tilstand, med økt EGFP transkripsjon i GSK-3 hemmer behandlet abl celler, men ikke i LNCaP celler.
En
, -catenin knockdown redusert Wnt-reporter-aktivering som respons på GSK-3-inhibitor. ABL celler ble infisert med EGFP Wnt-reporter (7xTcf-EGFP /SV40-mCherry) og transfektert med SI-kontroll eller si – catenin. Celler ble dyrket i 2 dager, og deretter behandlet med bærer, 2 uM eller 3 uM GSK-3-inhibitor i 24 timer. De relative mRNA-nivåer av EGFP indikerer Wnt aktivitet ble analysert ved QRT-PCR.
B
, Nivåene av atom -catenin (grønn) i LNCaP, abl og 22Rv1 prostata kreft celler ble bestemt ved immunofluorescens farging.
C
, Representasjons fluorescens bilder som viser lavt nivå av EGFP Wnt reporter aktivitet i LNCaP, abl og 22Rv1 celler: Wnt aktivitet (grønn), tilstedeværelse av celler (mCherry, rød), og kjernefysisk plassering (DAPI, blå ).
D og E
, androgen-uavhengig abl og 22Rv1 celler er mer utsatt for aktivering av Wnt-reporter. Cellene ble behandlet med GSK-3-inhibitor i 24 timer og utsatt for fluorescens imaging (
D
) eller QRT-PCR for å måle relative mRNA nivåene av EGFP (
E
). I
A-E
, ble eksperimenter utført i normal vekstmediet fra hver cellelinje som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder.
F og G
, hormon-deprivasjon forbedret aktivering av Wnt-reporter i LNCaP celler, som er svekket av androgen behandling. Celler ble behandlet med 9 pM GSK-3-inhibitor i fullstendig (i) eller hormonmangel media med /uten 10 nM di-hydro (DHT) i 24 timer (ii og iii). Celler ble deretter utsatt for fluorescens-avbildning (
F
), eller QRT-PCR for å måle relative mRNA-nivåer av EGFP (
G
). Dataene som er presentert er representative for tre uavhengige eksperimenter og den indikerte feil er standardavviket.
Gitt at β-catenin samvirker med AR i en androgen-avhengig måte [26-28], vi begrunnet at androgen-deprivasjon kan forbedre β-catenin interaksjon med TCF, og dermed øke Wnt-reporter aktivitet. Til støtte for denne ideen, behandling av LNCaP celler med GSK-3 hemmer i vanlig hormon som inneholder media (tilstand i) sammenlignet med hormonmangel media (tilstand ii) resulterte i økt reporter aktivering (figur 1F) i hormon fratatt tilstand. Behandling med di-hydro (DHT) redusert denne reporteren aktivering (figur 1F, tilstand iii), noe som tyder på at androgen behandling undertrykker Wnt reporter aktivitet i LNCaP celler. Den relative nivå av EGFP mRNA i hver tilstand er vist i figur 1G.
Hemming av AR aktivitet forbedrer Wnt /β-catenin-responsive transkripsjon
Som vi observert økt aktivering av Wnt-reporter i hormonmangel forhold, hypotese vi at hemming av AR aktivitet kan forbedre Wnt /β-catenin-responsive transkripsjon. For å teste denne ideen, var AR aktivitet trykt av enten hormonmangel, antiandrogen behandling (enzalutamide [2]) eller siRNA-mediert AR uttømming. Celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av GSK-3-inhibitor for å indusere Wnt /β-catenin-responsive transkripsjon og de relative mRNA-nivåer av Wnt-reporter (EGFP) og endogene Wnt /β-catenin målgen,
Axin2
, ble analysert. Sammenlignet med kontroll-celler, høyere induksjon av Wnt-reporter og ble observert
Axin2
mRNA-nivåer i LNCaP-celler dyrket i hormonmangel media, i nærvær av enzalutamide eller behandlet med AR siRNA (Fig 2A-2C). Som et alternativ til GSK-3-inhibitor behandling også gjentas vi eksperimentet ved hjelp av APC knockdown å aktivere Wnt /β-catenin pathway. APC er en komponent av β-catenin ødeleggelse kompleks og APC delesjon eller tap-av-funksjon mutasjon har vist seg å stabilisere β-catenin og aktiverer Wnt /β-catenin-responsive transkripsjon [29, 30]. I samsvar med resultatene i GSK-3 hemmer behandlede celler (figur 2A-2C), APC knockdown indusert høyere aktivering av Wnt-reporter genet og
Axin2
transkripsjon i hormonmangel eller enzalutamide behandlede celler (figur 2D og 2E ), noe som tyder på at AR undertrykkelse fremmer Wnt /β-catenin-aktivering i LNCaP celler. Imidlertid abl-celler viste høye nivåer av Wnt reporter og
Axin2
ekspresjon som reaksjon på GSK-3-inhibitor som var bare moderat økt i fravær av eller nærvær av DHT enzalutamide (figur 2F og 2G) med unntak av
Axin2
, som var upåvirket av enzalutamide behandling sammenlignet med kontrollceller (fig 2G). Uttømming av AR ved siRNA viste en økning i Wnt reportergen aktivitet og
Axin2
mRNA i både LNCaP og abl-celler (figur 2C og 2H) antyder at uttømming av AR-protein resulterer i frigjøring av mer β-catenin inn i en cellular basseng tilgjengelig for å aktivere Wnt /β-catenin veien
LNCaP celler ble behandlet med 6 mikrometer eller ni um av GSK-3-hemmer (
AC
.); ABL celler ble behandlet med og 2 mikrometer eller tre mikrometer av GSK-3-hemmer (
F-H
).
A og F
, Celler ble hormonmangel i 3 dager og deretter behandlet med bærer eller økende konsentrasjon av GSK-3-inhibitor med /uten 10 nM DHT i 24 timer.
B og G
, Celler ble behandlet med bærer eller økende konsentrasjon av GSK-3-inhibitor med /uten 10 uM enzalutamide (Enz) i 24 timer.
C og H
, Celler ble transfektert med si-kontroll eller Si-AR, dyrket i 2 dager, og deretter behandlet med bærer eller økende konsentrasjon av GSK-3-inhibitor i 24 timer.
D og E
, ble LNCaP-celler transfektert med si-kontroll eller økende mengder av Si-APC og enten hormonmangel i 2 dager og deretter behandlet med bærer eller 10 nM DHT i 24 timer (
D
), eller dyrket i komplett medium i 2 dager, og deretter behandlet med bærer eller 10 uM enzalutamide i 24 h (
E
). De relative mRNA-nivåer av angitte gener blir analysert ved QRT-PCR. Dataene som er presentert er representative for tre uavhengige eksperimenter og den indikerte feil er standardavviket.
Til sammen tyder disse resultater på at det i androgen-avhengige LNCaP-celler, kan inhibering av AR tillate tumorcellene for å aktivere Wnt /β-catenin veien. Under tilstander med hormonmangel, kan dette skje ved å utsettes for wnt-signaler som sannsynligvis er tilstede i tumoren mikromiljøet [15, 31, 32]. I motsetning til dette synes androgen-uavhengig abl celler som er avledet fra LNCaP-celler, klar for Wnt /β-catenin-aktivering i både nærvær og fravær av AR-aktivitet, noe som indikerer at interaksjonen mellom AR og Wnt /β-catenin veier kan ha vært endret i løpet av progresjon til androgen uavhengighet.
Hormonmangel mangel~~POS=HEADCOMP øker β-catenin interaksjon med TCF4
Gitt at β-catenin samhandler med AR eller TCF å aktivere AR eller Wnt /β-catenin-responsive transkripsjon, henholdsvis i prostata kreft [33, 34], undersøkte vi β-catenin belegg på AR og TCF bindingssteder ved hjelp av kromatin immunoprecipitation (chip) analyser. LNCaP-celler ble behandlet med DHT, GSK-3-inhibitor eller en kombinasjon av begge i 4 timer i hormonmangel media. De relative mRNA nivåer av Wnt /β-catenin (EGFP Wnt-reporter og
Axin2
) og AR-mål (
PSA
) gener i hver tilstand ble analysert (figur 3A). β-catenin belegg på TCF eller Ar bindingsseter ble også undersøkt (figur 3B) for å avgjøre om β-catenin rekruttering korrelert med mål genuttrykk. Som forventet, Wnt-reporter og
Axin2
mRNA-nivåene ble øket i GSK-3-inhibitor-behandlede celler, men redusert i nærvær av DHT og GSK-3-inhibitor (figur 3A). I samsvar med mRNA-nivåer, ble β-catenin rekruttert til TCF-bindingsseter på den Wnt-reporter og
Axin2
i respons til GSK-3-inhibitor, men ikke i cellene ko-behandlet med GSK-3-inhibitor og DHT (figur 3B). Transkripsjon av
PSA
skjedde i respons til DHT, og dette var upåvirket ved samtidig behandling med DHT og GSK-3-hemmer (fig 3A). β-catenin belegg ble observert på
PSA
forsterker på DHT behandling, men ble redusert ved samtidig behandling med DHT og GSK-3-hemmer (Fig 3B), noe som tyder på at det i denne sammenheng β-catenin er ikke avgjørende for
PSA
transkripsjon. AR ble også analysert; viser belegg på
PSA
i respons til DHT behandling, men ingen binding ble oppdaget på TCF områder av Wnt /β-catenin målgener i noen behandling (figur 3C).
A
, Expression of wnt /-catenin målgener (EGFP reporter og
Axin2
) og AR målet genet (
PSA
) ble analysert. LNCaP-celler ble hormonmangel i 3 dager og deretter behandlet med bærer, 10 nM DHT, 9 pM GSK-3-inhibitor eller en kombinasjon av begge i 24 timer.
B og C
, -catenin eller AR bindende mål gener ble analysert ved hjelp av kromatin-immunoprecipitation. LNCaP-celler ble hormonmangel i 3 dager og deretter behandlet med bærer, 100 nM DHT, 9 pM GSK3p-i, eller en kombinasjon av begge i 4 timer.
D og E
, -catenin interaksjon med TCF4 eller AR ble analysert ved hjelp av co-immunoprecipitation. LNCaP-celler ble hormonmangel i 3 dager og deretter behandlet med bærer, 100 nM DHT, 9 pM GSK-3-inhibitor eller en kombinasjon av begge i 4 timer. Proteinlysatene ble enten immunoblottet med angitte antistoffer (
D
) eller utsatt for co-IP studier (
E
) Kvantifisering av β-catenin og aktive β-catenin protein nivåer er vist nedenfor paneler i (
D
). Relativ densitometry er normalisert til bilen alene, satt til 1. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter og den angitte feilen er standardavviket.
For å finne ut om AR og β-catenin belegg på målet gener korrelerer med β-catenin binding til enten AR eller TCF4 protein, gjennomførte vi co-immunoutfellingsstudier analyser. LNCaP-celler ble behandlet som beskrevet for chip analysene ovenfor, og protein lysater ble immunopresipitert med β-catenin antistoff. Figur 3D viser at AR er stabilisert av DHT behandling. Selv om de totale nivåer av β-catenin var uendret etter 4 timer med GSK-3-inhibitor behandling, GSK-3-inhibering noe økt protein ekspresjon av den aktive formen av β-catenin (ufosforylerte ved serin 37 og treonin 41, [35]), uavhengig av tilstedeværelsen av DHT (figur 3D). Totalt sett DHT behandling økt AR /β-catenin samhandling og redusert TCF4 /β-catenin samhandling i forhold til kjøretøyet behandling (figur 3E), som rapportert tidligere [34, 36]. I samsvar med chip resultater (figur 3B), GSK-3 hemmer forbedret TCF4 /β-catenin interaksjon, men combinatory behandling med DHT redusert dette samspillet (Fig 3E). I tillegg, viste celler behandlet med DHT forbedret AR /β-catenin interaksjon, som ble redusert i nærvær av GSK-3-inhibitor (figur 3E) var i overensstemmelse med redusert AR opp en
PSA
enhancer i nærvær av GSK-3 hemmer og DHT (fig 3C). Det er ukjent hvorfor AR binding til
PSA Hotell og interaksjon med β-catenin blir redusert når DHT er co-behandlet med GSK-3-hemmer, men dette redusert nivå av AR på
PSA
forsterker var likevel tilstrekkelig for
PSA
transkripsjon (fig 3A, PSA mRNA nivåer i DHT vs DHT + gsk3-i).
i sammendraget, både chip og co-IP analyseresultatene tyder på at β- catenin interaksjon med TCF4 (figur 3E), og rekrutteringen til wnt /β-catenin målgener (figur 3B) ble øket i fravær av androgen, i samsvar med den forbedrede wnt /β-catenin-responsive transkripsjon i henhold til hormonmangel betingelser (figurene 1F, 2A og 2D).
Hemming av AR og Wnt /β-catenin veier øker veksten undertrykkelse av LNCaP celler
Siden en av de cellulære responser av Wnt-veien er å fremme spredning [37, 38], testet vi om den forbedrede aktivering av Wnt /β-catenin veien i fravær av androgen eller nærvær av enzalutamide (figur 2A, 2B, 2D og 2E) også fremmes celleproliferasjon. LNCaP celler dyrket i hormonmangel media ble veksten arrestert som forventet [39] men GSK-3 hemmer behandling eller APC knockdown indusert vekst lik DHT behandling (fig 4A og 4E). Enzalutamide behandling også trykt veksten av LNCaP celler som tidligere observert [2] men dette veksthemmende virkning ble lettet over GSK-3 hemmer behandling eller APC knockdown (fig 4B og 4F). Vi har også undersøkt transkripsjon av en M-fase cellesyklusregulerende gen,
UBE2C
, tidligere vist å være viktig for vekst av androgen-uavhengig prostatacancerceller [40]. GSK-3-inhibitor behandlingen resulterte i oppregulering av
UBE2C
transkripsjon lik den DHT behandling (figur 4C), så vel som de-undertrykkelse av
UBE2C
i enzalutamide co-behandlede celler (Fig 4D). Disse resultatene tyder på at Wnt /β-catenin aktivering fremmer veksten av LNCaP-celler i fravær av androgen eller i nærvær av enzalutamide, ledsaget av oppregulering av
UBE2C
. Behandling av celler med en inhibitor av Wnt /β-catenin vei, iCRT3 (C3) [41], reduseres den vekstfremmende virkning av GSK-3-inhibitor på en doseresponsiv måte (figur 4G og 4H), noe som ytterligere indikerer at Wnt /β-catenin sti dirigerer androgen-uavhengig vekst av LNCaP celler.
AF
, GSK-3 hemmer behandling eller APC knockdown fremmer vekst av LNCaP celler i hormonmangel eller enzalutamide ( Enz) behandlet medier.
A og B
, Celler ble hormonmangel i 3 dager og deretter behandlet med bærer, 10 nM DHT eller 6 pM GSK3p-i (
A
), eller 10 nM DHT med /uten 10 mm Enz eller 6 mikrometer gsk3-i (
B
) annenhver dag.
C og D
, Cellene ble behandlet som beskrevet i (
A
) eller (
B
) i 24 timer og deretter relativ mRNA nivåer av
UBE2C
ble analysert ved QRT-PCR.
E og F
, ble celler transfektert med si-kontroll eller Si-APC, hormonmangel i 2 dager og deretter behandlet med bærer eller 10 nM DHT (
E
), eller 10 nM DHT med /uten 10 mm Enz (
F
) annenhver dag.
G og H
, Behandling av celler med Wnt /β-catenin inhibitor (C3) reduserer den vekstfremmende effekten av GSK3p-i. LNCaP-celler ble hormonmangel i 3 dager og deretter behandlet med bærer eller 6 pM GSK3p-i (
G
), eller 10 nM DHT pluss 10 uM Enz (
H
) med /uten økende konsentrasjoner av C3 annenhver dag.
I
, Co-behandling av Enz og C3 viser økt vekst hemming av LNCaP celler.
