Abstract
Kreft celle invasjon er en viktig del av metastaser og er ansvarlig for omfattende celle diffusjon inn i og stor ødeleggelse av vev. Celler stille komplekse invasjon moduser, inkludert en rekke kollektive atferd. Dette fenomenet resulterer i strukturell heterogenitet av den ekstracellulære matriks (ECM) i vev. Her har vi systematisk undersøkt miljø heterogenitet tilrettelegge tumorcelle invasjon via en kombinasjon av
in vitro
celle migrasjon eksperimenter og datasimuleringer. Nærmere bestemt, konstruerte vi et ECM mikromiljø i et microfabricated biochip og opprettet en tre-dimensjonal (3D) traktlignende matrigel grensesnitt inne. Scanning elektronmikroskopi viste at grenseflaten var på de indre defekter av nano-skala molekylær orientering anisotrope og de lokaliserte variasjoner strukturtetthet i matrigel. Våre resultater, særlig korrelasjon av den kollektive migrasjonsmønster med de geometriske egenskaper av den traktlignende grensesnitt, tyder på at denne heterogene
in vitro
ECM struktur sterkt skinnene og fremmer aggressiv celle invasjon i det stive Matrigel plass. En cellulær automat modell ble foreslått basert på våre eksperimentelle observasjonene, og den tilhørende kvantitativ analyse indikerte at celle invasjonen ble initiert og styrt av flere mekanismer, inkludert mikro heterogenitet, langtrekkende celle-celle homotype og retningscellemigrasjon gradient-drevet. Vårt arbeid viser muligheten for å bygge en kompleks og heterogen
in vitro
3D ECM mikromiljøet som etterligner
in vivo
miljø. Videre våre resultater tyder på at ECM heterogenitet er viktig å kontrollere kollektiv celle invasive atferd og derfor bestemme metastase effektivitet
Citation. Zhu J, Liang L, Jiao Y, Liu L, på vegne av den USA-Kina Fysisk Sciences-Oncology Alliance (2015) Forbedret invasjon av metastatisk kreft celler via ekstracellulær matriks Interface. PLoS ONE 10 (2): e0118058. doi: 10,1371 /journal.pone.0118058
Academic Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korea, Republikken
mottatt: 12 oktober 2014; Godkjent: 03.01.2015; Publisert: 23 februar 2015
Dette er en åpen tilgang artikkel, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Data Tilgjengelighet:. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering: Forfatterne erkjenner støtte fra National Key Basic Research Program of China (Grant 2013CB837200) og Science Foundation of China (Grant 11474345) National. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
den mest livstruende stadium av metastasering oppstår når tumorceller spre seg fra vev av opprinnelse og begynner å vokse på andre organer. I det første avgjørende skritt, kalt invasjon, metastatiske celler uttrykker metalloproteinaser på deres overflater, fremme basalmembran fordøyelsen og flytte inn i det omkringliggende ekstracellulære matriks (ECM) [1-2]. ECM spiller en viktig rolle i prosessen med kreftcellen invasjon, som virker som en fysisk stillas for cellebevegelse og også som medium for cellesignalkommunikasjon [3]. I vev, kreftceller uttrykker matriksmetalloproteinaser (MMP) som bryter ned ECM i forkant, genererer lokale stier og hjelpe migrere cellene til å invadere fritt [4-6].
In vivo
, invasiv celle histologiske mønstre varierer fra én celle invasjon til kollektive celle invasjon, selv innenfor samme vev. Mønstrene varierer fra celle acini, snorer, kjertler, ark, klynger og andre [7-8]. Viktigere, ulike mønstre føre til ulike effektiviteten av kollektive celle invasjon og bestemme den totale alvorlighetsgraden av sykdommen og pasientens overlevelse. Derfor er det viktig å forstå innholdet av de invasive mønstre og faktorer som påvirker dem.
De kollektive invasive celle atferd og mønstre er sterkt påvirket av heterogenitet av ECM mikrostrukturer. På molekylært nivå, ECM proteinkonsentrasjon og ECM komponenter bestemme ECM sub-mikron struktur og mekaniske egenskaper [9-14]. På vev skala, er den strukturelle heterogenitet og anisotropi av innfødte vev hovedsakelig forårsaket av de komplekse lokaliserte ECM microenvironments og deres størrelse, tetthet og orientering. Disse fysiske egenskaper, så vel som de spesifikke kjemiske omgivelser som består av oksygen, ernæring, og vekstfaktorer, varierer sterkt mellom vev og vev-grensesnitt [15]. Alle disse ECM variasjoner påvirker enkeltcelle polaritet og gruppe kollektiv celle atferd under invasjonen og føre til flere celleinvasjonsmønstre som til slutt vil forme ECM landskapet og bestemmer hastigheten på metastasering.
På grunn av kompleksiteten av ECM heterogenitet
in vivo
, dens innflytelse på kollektiv celle atferd har blitt beskrevet, men ikke kvantifisert [7].
In vitro
, studier har oppstått flaskehalser på grunn av vanskeligheter med å konstruere ECM romlig orientering og strukturelle defekter. Derfor noen modellering og teoretiske analyser er rapportert [6, 16]. For eksempel, er det Boyden-analysen en vanlig akseptert metode for å teste kreftcelle invasjon potensial i tre dimensjoner. Imidlertid gir kammeret bare en homogen ECM miljø, som skiller seg fra den heterogene vev miljøet [17-18].
For ytterligere å utforske celle invasjon, har nye tilnærminger modellert komplekse mikromiljøet med en høyere grad av likhet til
in vivo
tilstand ved hjelp av mikrofluid teknologi kombinert med optisk imaging. Denne enheten har en tredimensjonal (3D) plattform for cellekultur og invasjon som ligner på
in vivo
mikromiljø. Sammenlignet med konvensjonelle to-dimensjonale metoder, slik som skrape analyser, gir denne enheten mer spesifisitet og mer nøyaktig etterligner 3D-miljøet for blodlegemer [19-20]. I dette manuskriptet, rapporterer vi vår siste fremskritt på å konstruere en 3D matrigel basert ECM miljø for å studere invasive atferd av metastatisk MDA-MB-231 brystkreftcellelinje. Videre vi lykkes bygget en kunstig matrigel grensesnitt i 3D-rom. Den heterogenitet av Matrigel strukturer i stor grad bestemmes den kollektive celle atferd, cellen morfologi og invasjon effektivitet. Spesielt, den samlede cellemigreringsmønsteret var sterkt koplet med de geometriske egenskaper av den traktlignende grensesnitt. Videre foreslår vi en cellulær automat modell [21-35] for å antyde mulige mekanismer som førte til den observerte kollektive invasjon atferd. Vår synergi av eksperimentelle og beregnings studier viste at ECM heterogenitet og cellesignalering, sammen med en kjemisk gradient, spille viktige roller i å bestemme kreftcelle invasjon.
Resultater
Heterogene matrigel grensesnitt
Matrigel er en temperaturavhengig gel som vanligvis lagret ved 4 ° C. Den rutineprosedyre for fremstilling av matrigel som
in vitro
ECM er å lagre gelen ved 37 ° C. Gelen danner deretter homogene strukturer med jevn tetthet. For å opprette en heterogen matrigel struktur som kan simulere den ikke-homogene
in vivo
ECM mikromiljøet, ble en romlig matrigel seksjon forberedt, gravet og deretter sluttet med en annen matrigel delen som deretter ble kurert. To Matrigel deler av identisk konsentrasjon, men herdet til forskjellige tider skapt et grensesnitt på sin grense. Fig. 1 er en scanning elektronmikroskopi (SEM) bilde som viser detaljene i de felles mikro-skala strukturer. Den øvre delen, Matrigel I, ble fremstilt og deretter sammenføyet med den nedre delen som ble fremstilt i 30 minutter etter at den øvre delen. Begge Matrigel seksjoner hadde mesh strukturer med tilsvarende tetthet. Imidlertid, dannet de en synlig vertikal grensesnitt ved skjøten, som indikert med hvite piler. Grensesnittet hadde to egenskaper. Først konstruksjonene hadde små hulrom som strekker seg fra 100 ~ 300 nm, noe som fører til lavere tetthet lokalisert. For det andre molekylene hadde horisontale polarisasjon langs grenseflaten, noe som indikerer at maske strukturene av de to delene ikke overlapper hverandre. Senere eksperimenter demonstrerte og analysert funksjonen av dette grensesnittet i å bestemme invasive atferd av metastatiske kreftceller.
Grensesnittet har en horisontal molekylær orientering og redusert lokal tetthet som produserte defekter inne i gel.
mikrofluid oppsett for celle 3D invasjon
for å analysere hvordan matrigel grensesnittet påvirket metastatisk celle invasjon i 3D-rom, har vi designet og fabrikkert en microfluidic chip (fig. 2A). De stiplede linjer skissere den kubiske formen av polydimetylsiloksan (PDMS) brikke. Brikken besatt to runde kamre er forbundet med en sylindrisk hul tunnel fylt med herdede 100% matrigel. Proteinkonsentrasjonen var ca. 10 mg /ml, som er 3-4 ganger høyere enn det som vanligvis anvendes kollagen fra rottehaler (3-4 mg /ml) (354 236, Dow Corning, Michigan, U. S. A). Føtalt bovint serum (FBS) er en vanlig brukt vekstfaktor for kreftcellevekst. I kreftcelle invasjon
in vivo
, metastatiske celler vanligvis følger vekstfaktor tiltrekkende gradient. Fartøyet er rikere på ernæring og vekstfaktorer enn vev, og disse faktorene danner en gradient som styrer retningen av celle invasjon. Følgelig eksperimentet dannet en FBS gradient som etterlignet
in vivo
mikromiljø for guiding celle invasjon. RPMI-medium med 1,0% FBS ble plassert i venstre kammer, og RPMI-medium med 10% FBS ble plassert i et annet kammer. Fig. 2B viser at en FBS gradient utviklet inne i matrigel da media med ulike konsentrasjoner FBS ble anvendt ved de to ender av den matrigel ved 100% konsentrasjon. Metastatiske MDA-MB-231 brystkreft celler ble sådd ut på overflaten av Matrigel i kammeret inneholdende medium med 1,0% FBS. Hvert kammer ble fylt med 180 ul medium for å sikre jevn trykkforskjeller mellom de to kamrene. For de første 24 timer ble celle kammer fylt med 10% FBS medium for å sikre normal veksten av MDA-MB-231-celler. Etter 24 timer ble mediet forandret til 1,0% FBS medium, og den FBS gradient ble etablert. For å teste etablering og stabiliteten av gradienten, fluorescerende dekstran-rhodamin (70 kDa molekylvektprotein, Invitrogen) ved en konsentrasjon på 0,025 mg /ml ble brukt til å simulere etablering av FBS gradienten [36-37]. Molekylvekten av dekstran-rhodamin er lik bovint serumalbumin på 66,5 kDa. En invertert mikroskop (Ti-E, Nikon) med EMCCD (Flash 4.0, Hamamatsu) ble ansatt for å fange de fluorescerende signaler i matrigel. Brikken med matrigel inne ble plassert inne i en tilpasset på scenen levende celle inkubator ved 37,0 ° C, 5,0% CO
2 og 80,0% fuktighet, en normal celle inkubasjon miljø. Micro-manager programvare kontrollert mikroskop for å skaffe seg tid-lapse bilder av fluorescerende dekstran-rhodamine distribusjoner inne i matrigel hvert 10 min i 48 timer. Fig. 3C viser dekstran-rhodamin fordeling 48 timer etter at gradienten ble etablert. En synlig gradient ble etablert i gelen. Dette time-lapse imaging ble senere analysert kvantitativt ved ImageJ programvare. De gjennomsnitts grå verdier ble innhentet og analysert fra bildene, som representerer de dekstran-rhodamine fluorescensstyrkene på bestemte steder. Disse verdiene ble deretter normalisert og plottet med steder og tid i diagrammet ved Origin Software, som er vist i fig. 3D. En serie av dekstran-rhodamin diffusjon bilder ble tatt ved 10 min intervaller. Hvert bilde ble normalisert med maksimum og minimum oppnådd fra hvert bilde i serien [38]. Gradienten profiler ble analysert ved å midle et horisontalt rektangel langs gelen region og plottet mot sin stilling i kanalen. Fig. 2D indikerer at den simulerte FBS gradient ble etablert i løpet av 3 timer og opprettholdt i opptil 48 timer. Stigningen test indikerte at matrigel kunne etablere en lineær og stabil gradient. I tillegg, når medium med eller uten FBS ble tilført samtidig til de to sider, en effektiv gradient dannet i matrigel sonen.
(A) Diagram skisse av PDMS chip. Den horisontale sylinder kanal mellom de to kammere er fylt med matrigel (rød). Den venstre kammer er fylt med det medium med 1,0% FBS, mens det høyre kammer er fylt med det medium med 10,0% FBS. (B) Et medium med 10,0% FBS og 1,0% FBS etablert en FBS gradient langs klemt matrigel. (C) fluoriserende bilde av Matrigel sonen. Den blå linjen viser matrigel. Den venstre side med den nedre grå verdi på viser RPMI 1640 medium uten dekstran-rhodamin, og høyre sone med større grå verdien representerer RPMI 1640 medium med dekstran-rhodamine. Matrigel sone har en gradvis minkende grå farge, noe som indikerer etablering av en dekstran-rhodamin gradient. (D) Kvantitativ analyse av dekstran-rhodamin gradient i tids- og rom-avhengig etablering i matrigel. Stigningen ble etablert i 3 timer og holdt seg stabil etter 9-48 timer.
(A) MDA-MB-231 celler festet til matrigel sideflaten veggen på 0 timer. Den røde linje viser forsiden av cellegruppe. (B) MDA-MB-231 celle invasjon i matrigel på 96 timer. Den celler og matrigel nedbrytning forårsaket gel krymping sammenliknet med celle fremre ved 0 timer. (C) Et par celler i fig. 3B strukket ut og viste liten invasjon inn i matrigel, som de hvite pilene betegne, noe som indikerer at MDA-MB-231 celler ikke kunne invadere i stiv matrigel av 100% konsentrasjon.
Invasion oppførselen til MDA -MB-231 celler i et homogent miljø ECM
Deretter påvirkning av den heterogene Matrigel-grensesnittet på kollektiv celle invasjon ble analysert. Til sammenligning er kontrollforsøk analysert celle invasjon i et homogent ECM mikromiljøet. Fig. 3A viser forbindelses cylindered kanal fylt med homogen matrigel ved 100% konsentrasjon. Ved 0 timer, MDA-MB-231-celler festet jevnt til den venstre side av Matrigel. Begge kamre ble fylt med 10% FBS medium, som sørget for cellebinding og normal vekst. Etter 24 timer ble mediet i det venstre kammer erstattet med medium inneholdende 1,0% FBS. På fig. 3B, den sorte skygge langs den matrigel overflaten indikerer at celletallet økes betydelig på grunn av rask celleformering. Etter 96 timer ble Matrigel deformert, og MDA-MB-231 celle front (røde linjer) flyttet frem til høyre som de fast til matrigel overflaten. Matrigel deformasjon var forårsaket av MMP utskilt av MDA-MB-231-celler, noe som forringer den matrigel [39], og kraften fra samvirket mellom MDA-MB-231-celler og matrigel mikro [40-42]. Førstnevnte er en kjemisk virkning, mens den sistnevnte er en fysisk prosess. Selv om konvergerende styrker var betydelig og forårsaket matrigel deformasjon, cellene ikke åpenbart kollektivt invadere Matrigel 3D-strukturer. Fig. 3C viser den forstørrede delen av cellen fronten i fig. 3B. Bildet viser celle invasjon i 3D matrigel 520 mikrometer over bunnen av kanalen. De blå pilene indikerer at MDA-MB-231 celler bare litt invadert matrigel. Som vist, bare noen få celler i fronten dannet elliptiske former i matrigel, representerer deres små invasjoner. Mesteparten av cellene bak disse cellene viste kompakt vekst. Totalt sett er MDA-MB-231 celler kan ikke invadere matrigel, trolig på grunn av stivheten i 100% matrigel. Denne kontrollen forsøket bekreftet at cellene kan bare vise intensiv vekst på gel overflaten, uten 3D-invasiv oppførsel, hvis den stive gelen hadde en jevn tetthet.
Konstruere en heterogen ECM mikromiljøet med en matrigel grensesnitt
Forrige kontroll eksperiment viste at metastatisk MDA-MB-231 celler var knapt i stand til å invadere ECM-lignende matrigel grunn av sin stivhet. For ytterligere å studere kollektiv celle invasive atferd i ECM med en heterogen mikromiljøet, genererte vi en romlig matrigel felles struktur i gel kanal. Fig. 4A viser at cylindered matrigel kanalen ble fylt med to seksjoner av gelene: matrigel I (rød) og matrigel II (blå). Nærmere bestemt Matrigel II ble innsatt i matrigel I og dannet en traktlignende 3D-struktur. Under fremstillingen, ble den sylindriske kanal første injisert med 8 um på 100% matrigel. Deretter ble den brikken på skrå 30 ° ~ 45 ° grader i forhold til vannrett underlag i 30 minutter mens gelen herdes (Fig. 4B). Som Matrigel ikke hadde stivnet i løpet av denne tid, og den myke matrigel klebet sterkt til PDMS kanal, tyngdekraft kjørte gelen til den høyre enden, som skaper en traktlignende struktur til den er helt stivnet. På dette punkt tyngdekraften sammen med gel adhesjon spilte en viktig rolle i dannelsen av 3D-morfologien av Matrigel I. Endelig ble ytterligere 3 ul av 100% matrigel II tilsatt til hulrommet. Brikken ble deretter plassert inne i et nivå inkubator for fullstendig gelering. Således Matrigel I og II sammen og dannet en traktlignende grensesnitt, slik som vist i fig. 4B. Disse to seksjonene hadde identisk gel tetthet, men grensesnittet hadde strukturelle forskjeller. Som vist ved SEM på fig. 1, den lokale tettheten og gel-molekyl orientering varierte fra de ensartede seksjoner. De fysikalske egenskaper av grenseflaten var derfor forskjellig fra den homogene matrigel. Variasjonene førte også til endringer i optiske egenskaper, herunder refleksjon indeksen. Figur C viser lyse-feltet bilde fotografert av invertert mikroskop. Den traktlignende 3D-grensesnitt er klart synlig i den kanal, som antydet med de røde pilene.
(A) tegneserie som viser at den heterogene matrigel er sammensatt av Matrigel I (rød) og matrigel II (blå). De to delene danner en traktlignende 3D-grensesnitt. (B) Den øvre innfelte viser matrigel gelstrukturen preparat. Etter matrigel I i kanalen gelert i 30 min, ble brikken på skrå 30 ° -45 °. Matrigel jeg dannet en trakt struktur på grunn av tyngdekraften og gel adhesjon. Deretter Matrigel II ble injisert inn i hulrommet. Den nedre innfelt viser grensesnittet fra siden. (C) De røde pilene viser gelen grensesnittet i forsøket.
Matrigel grensesnitt styrt kollektiv MDA-MB-231 celleinvasjons
MDA-MB-231 celler ble lastet på den venstre siden av den heterogene Matrigel med grensesnitt og dyrket i 48 timer (fig. 5D). Fremgangsmåten var nøyaktig den samme som for kontrollforsøk er vist i fig. 3. På fig. 5D, er skyggen grensen av Matrigel-kanalen og rundt basseng og er forårsaket av lys projeksjon av PDMS veggen. Fokalplanet av bildet er på kammeret substratet. Skyggen til venstre er mediet kammer hvor MDA-MB-231 celler ble tidligere lastet og hadde slått seg ned og proliferated på underlaget. På høyre side er matrigel sonen, der cellene festet til venstre vegg. De fleste celler på den vertikale matrigel overflaten forble i skygget området og er ikke synlig på bildet. Den nederste høyre fargen på bildet indikerer at etter MDA-MB-231 celler hadde festet til matrigel side i 48 timer, noen få celler strukket ut og begynte å invadere den indre matrigel strengt etter grensesnittet. Cellene som ikke hadde noen kontakt med grenseflaten på plass ikke invadere, i likhet med den kontrollforsøk. Disse resultatene indikerer at cellene hadde mechanotransduction respons til strukturen og kan avføle og følge grensesnittet. Grensesnittet spiller en viktig rolle i å veilede celle invasjon, som ikke kunne oppstå i homogen stiv matrigel. Som SEM viser ECM fibriller hadde polarizations og mangler i grensesnittet som muligens guidet celle retnings invasjon. Dessuten kunne de heterogene fysiske begrensninger og spenninger indusere anker reseptor omfordeling i cellemembranen. Således resulterte mekanisk strekking av membranene kan styre pseudopodia utvidelser og motiverer celle invasjon langs grenseflaten. For å klargjøre denne prosessen, forklarer den ovenfor angitte skjematiske celle invasjon etter den romlige Matrigel-grensesnittet.
(A-C) Filmer som forklarer de forskjellige fasene av kollektive celle invasjon. (D) viser at MDA-MB-231-celler avføles grensesnittet og begynte å invadere den matrigel ved 48 timer; (B) De MDA-MB-231 celler «invaderende grener økt etter at matrigel grensesnittet på 96 timer. Noen grener koble og danne et nettverk, som indikert av rød sirkel. (C) Etter den partielle grensesnitt var fylt med cellene, de umodne cellene unnslapp fra grenseflaten fødsel og produserte finger-lignende invasjoner i den homogene Matrigel, noe som bekrefter den sterke invasjonen av MDA-MB-231 celler i heterogen gel plass.
Etter 96 timer ble celle invasjon mer tydelig, som vist i fig. 5E. Flere MDA-MB-231-celler, som danner de enkelte grener, begynte å invadere den matrigel langs grenseflaten, både fra siden og undersiden. Cellene invaderte langs siden grensesnitt, avsløre at invasjonen fortsatt strengt fulgt grensesnittet ved høye hastigheter. I tillegg til grensesnittet innflytelse, mobilsignal også spilt en viktig rolle i akselererende celle invasjon. Celle kommunikasjon hjalp 3D-invaderende celler som danner et nettverk og kontakt med andre invaderende grener, som antydet med sirkelen skissert med stiplede røde linjer. Denne forbindelsen hjalp cellene danner en stor gruppe og invadere gel plass kollektivt. Samtidig stiger FBS gradient også bidratt og ført celler til å invadere mot høyre side [43-44].
Med fordelen av grensesnittet veiledning, MDA-MB-231-celler raskt invaderte matrigel. På 192 timer, de MDA-MB-231 celler presenteres sterke kollektive invasive atferd og invasjonsmønstre i gel. Fig. 5F viser at celle invasjon gruppe dannet i to deler av Matrigel. Tidlig-invaderende celler som dannet invaderer grener langs grenseflaten fortsatte å invadere, formerende og slå sammen inntil de er koblet, og dannet en celle plan 350 mikrometer i lengde og 100 mikrometer i bredde, som vist ved den svarte pilen. Denne celle flyet ble begrenset av grensesnittpanelet. Deretter ble en tett klynge av celler som fremkom ved sin fremre og fortsatte å utvikle seg til en langstrakt form som invaderte i ECM fremover. Vi viser til dette langstrakte celle klyngen som en celle «finger». Fingeren invaderte horisontalt mot høyre av gelen, noe som indikerer at cellene hadde unnsluppet fra den innesperring av Matrigel-grensesnittet og invaderte inn i matrigel I delen. Med andre ord, at cellene ikke lenger invaderte gelen langs grenseflaten, men direkte inn i homogent miljø matrigel. Den svarte stiplede linjen representerer foran på trakten grensesnittet og viser cellen finger som genereres før cellene fylles grensesnittet. Grensen av cellene i fingeren ikke er synlig, hvilket indikerer at cellegruppen hadde meget kompakte konstruksjoner med sterke celle-celle kryss. Sammenlignet med den celle invasjon oppførsel i kontrollforsøk, der bare noen få celler viste liten og kort-distanse invasjon i cellegruppe foran, innebærer den massive finger invasjon at MDA-MB-231-celler hadde sterke signalkommunikasjon med hverandre som dominerte deres kollektive oppførsel, noe som kan forklare hvorfor cellegruppe her kunne invadere 100% matrigel plass, i motsetning til kontrollgruppen i matrigel med den samme tetthet. I tillegg FBS gradient i stor grad bidratt og rettet finger invasjon til høyre [45].
diskusjon
Generelt invasjonen prosessen med metastatiske MDA-MB-231-celler i matrigel med en traktlignende 3D-grensesnitt kan anses for å ha tre faser. I en
st fase, cellene invaderte matrigel i noen bekker, først og fremst styrt av den krumme grenseflaten (48 timer). I 2
nd fase, flere cellestrømmer først ved grenseflaten. På dette stadiet, cellesignale dominerte, slik invaderte bekker til å kommunisere med andre og skjema cellenettverk. I løpet av 3
rd fase (192 timer), viste cellenettverket i en kontinuerlig invadere cellegruppe som genererte finger form og kollektivt invaderte på forsiden. Samtidig den FBS kjemisk gradient og cellesignalisering var de dominerende faktorene regi celle invasjon til høyre i den stive og homogen matrigel plass.
For å teoretisk analysere den kollektive celle invasjon i et heterogent matrigel mikromiljøet, vi foreslått følgende mekanismer som kan indusere de viktigste funksjonene i den tre-fase invasjonen atferd observert her: (i) mikro-miljø heterogenitet; (Ii) langtrekkende homotypisk tiltrekning gjennom celle-celle kommunikasjon (hovedsakelig kjemiske i natur); og (iii) gradient-drevet retningscellemigrasjon. For ytterligere å bekrefte disse mekanismene og få en dypere forståelse av hvordan de er koblet, vi utviklet en cellulær automat (CA) modell [22-35] som innlemmet de nevnte mekanismene til
kvalitativt
simulere kollektiv cellemigrasjon i en heterogent miljø. Vi merke til at selv om selve systemet er i tre dimensjoner, vi anvendt en to-dimensjonal (2D) modell. Dette er fordi våre tidligere studier har vist at 2D CA modeller er tilstrekkelig til kvalitativt reprodusere den kollektive cellulære dynamikken i invasive solide tumorer [46-48] og sovende ondartede svulster [49].
Etter tidligere studier [46- 49], ble en rektangulær simulering domene (med et sideforhold på 2) delt inn i diskrete polygoner ved hjelp Voronoi flislegging forbundet med en unormal pakking av sirkulære disker (fig. 6). Pakkingen ble generert via tilfeldig sekvensiell tillegg på 80.000 harde sirkulære disker [46]. Den lineære størrelse av simuleringen domenet var 4000 um x 2000 um. Således var den gjennomsnittlige lineære størrelsen på hver Voronoi polygon var tilnærmet 10 um, i samsvar med den typiske størrelse av en celle. I vår simulering, kan en Voronoi polygon være okkupert av ECM-makromolekyler, en celle eller et hulrom. Hver ECM forbundet Voronoi polygon besatt en effektiv ECM tetthet verdi
ρ
, og for et tomrom-plass polygon,
ρ = 0
. Vi merker oss at denne tettheten verdien er en simulering parameter som er proporsjonal med, men generelt forskjellig fra det faktiske ECM tetthet (dvs. antall /masse av ECM makromolekyler per volumenhet /område)
Høyre panel. Assosiert Voronoi tessellation av flyet i polygoner.
for å etterligne den heterogene mikromiljø observert i forsøkene, vurderte vi to ECM regioner med ulik tetthet, dvs. en myk region med
ρ
b
og en hard region med
ρ
h
Vi brukte en gaussisk kurve for å tilnærme grensen mellom de to regionene. De Voronoi polygoner på grensesnittet av to ECM regioner hadde en mye lavere tetthet
ρ
b
enn bulk ECM regioner på grunn av mulige feil på grensesnittet. tetthetsverdiene er gitt i tabell 1. I tillegg ble en ensartet kjemisk gradient påføres langs den horisontale retningen implisitt innlemmet i vår modell, som forspent migreringen av celler langs den horisontale retningen (som beskrevet nedenfor). Vi merker oss at generelt, er en gradient prolife mye mer kompleks enn en uniform en. Men var tilstrekkelig for våre kvalitativ studie av denne tilnærmingen.
I begynnelsen av simuleringen, blir cellene frigitt og kan gå inn i simuleringen domene fra venstre side av domenet. Simulering tid da diskretisert inn timer. Når du skriver inn simulering domene, har en celle en Voronoi polygon og forringer ECM makromolekyler opprinnelig i mangekanten. På hver gang trinnet, er hver celle sjekket for migrasjon. Når en celle vandrer, den hopper fra dagens Voronoi polygon til en nabo Voronoi polygon med en sannsynlighet
P
m
, som er en viktig simulering parameter som avhenger av ECM tetthet av nabo polygon, i retning av kjemiske gradient og posisjonene til andre celler. Konkret er følgende CA regler for å bestemme
P
m
:
ECM tetthet
: Etter tidligere studier [46-49 ], antok vi at det er lettere for cellene å migrere i mykt ECM enn hardt ECM. Dermed anser vi sannsynligheten for at en celle hopper inn i en Voronoi polygon
j
med
ρ
j
å være proporsjonal med
e
-ρj
, dvs.
P
m product: ~ e
–
ρj
kjemisk gradient
: Vi vurderte at migrasjon retning av en celle er inhabil ved kjemisk gradient. Denne regelen ble innført ved å pålegge en høyere migrasjon sannsynlighet om migrasjon retning var mer på linje med gradient retning. Anta at en celle opprinnelig opptar en Voronoi polygon
i
, sannsynligheten for at cellen hopper til en nabo Voronoi polygon j er da proporsjonal med e
(
r
ij
∇
c
), dvs. P
m
~
e
(
r
ij
∇
c
), der
r
ij
betegner forskyvningsvektor som peker fra polygon
jeg anbefale til
j Hotell og ∇
c
er brukt kjemiske gradient, som er valgt til å være den enhetsvektor langs horisontalretningen
Homotype attraksjon
. Vi anser at retningen av migrasjon er også påvirket av andre celler via celle-celle-kommunikasjon som kan være av kjemisk art. Uten å komme inn detaljene i celle-celle kommunikasjon involvert i den observerte kollektiv atferd, som krever omfattende sub-cellulære nivå studier, vi bare implementert den samlede effekten av en slik kommunikasjon i vår modell, dvs. homotype attraksjon. Denne attraksjonen innebærer at cellene migrerer mot hverandre og ble gjennomført som følger: Anta en celle opprinnelig opptar en Voronoi polygon
i
, vi konstruere en sirkel med radius
R
c sentrert på polygon
i
, der
R
c er effektiv rekkevidde på celle-celle kommunikasjon. Deretter blir posisjonene til alle cellene innenfor påvirkning sirkel i gjennomsnitt, slik at posisjonen til et effektivt sentrum for tiltrekning. La vektoren r
ic
betegne forskyvning fra polygon
jeg anbefale til den gjennomsnittlige mobil posisjon (dvs. sentrum av attraksjonen). Sannsynligheten for at cellen hopper til en nabo Voronoi polygon
j
anses proporsjonal med e
(
r
ij
∙
r < Fig.
