Abstract
Tykktarmskreft er en av de vanligste kreftformene i utviklede land, og er et resultat av både miljømessige og genetiske faktorer. Mange av de genetiske lesjoner observert i tykktarmskreft endre uttrykket av homeobox gener, som koder homeodomain transkripsjonsfaktorer.
MEIS1
homeobox genet er kjent for å være involvert i flere hematologiske maligniteter og solide svulster og nyere bevis tyder på at uttrykk for
MEIS1
transkripsjon er endret i tykk- og endetarmskreft. Til tross for dette potensialet forbindelse, er lite kjent om rollen av genet i tarmen. Vi probet murine gastrointestinale vevsprøver med en N-terminal Meis1 antistoff, og viser ekspresjon av to tidligere beskrevne isoformer, samt to nye Meis1 produkter. En 32 kD Meis1 produkt ble uttrykt i kjernen av ikke-epiteliale celler i mage og tykktarm, mens et 27 kD produkt ble uttrykt i cytoplasma av epitelceller i den proksimale kolon. Våre data tyder på at de 27 kD og 32 kD Meis1 proteiner er begge former av Meis1d protein, en homeodomain-mindre isoform som avskrift ble tidligere identifisert i cDNA skjermer. Både
MEIS1D
transkripsjon og protein ble uttrykt i menneskelig kolon mucosa. Uttrykk av MEIS1D protein ble nedregulert i 83% (10/12) av primære kolorektal kreft prøvene sammenlignet med matchet normal slimhinne, noe som indikerer at MEIS1D er en biomarkør for tykktarms tumorigenesis. Den reduserte uttrykk for MEIS1D i colontumorer antyder også at dette konservert homeodomain-mindre isoform kan fungere som en tumor suppressor i menneskelig kolorektalkreft
Citation. Crist RC, Roth JJ, Waldman SA, Buchberg AM (2011) en konservert vevsspesifikke homeodomain-Less isoformen av MEIS1 Er nedregulert i tykktarmskreft. PLoS ONE 6 (8): e23665. doi: 10,1371 /journal.pone.0023665
Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: Mai 20, 2011; Godkjent: 22 juli 2011; Publisert: 17 august 2011
Copyright: © 2011 Crist et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health [T32-CA09678 til RCC, T32-CA09683 til JJR] og National Cancer Institute. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av dette manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kolorektal kreft står for omtrent 10% av både kreftdiagnoser og dødelighet i USA (www.cancer.org). Dødeligheten har gått ned i de to foregående tiårene, hovedsakelig på grunn av høyere nivåer av samsvar med anbefalte koloskopi screenings samt forbedret effekt av behandlingsalternativer [1]; derimot, har tykktarmskreft fremdeles den nest høyest dødelighet forekomst i USA, etterfølgende bare lungekreft. Som mange typer kreft, har tykktarmskreft både miljømessige og genetiske komponenter [2], [3], [4]. Både sporadiske og arvelige former av sykdommen er assosiert med en opphopning av flere genetiske lesjoner [5], [6], noe som kan resultere i nedsatte nivåer av apoptose [7], tap av reguleringen cellesyklus [8], og konstitutiv aktivering av
WNT
signalveien [9]. Som regulatorer av nedstrøms transkripsjonen aktivering, er transkripsjonsfaktorer ofte dysregulerte i kolorektal cancer [10], [11].
Homeobox gener koder for proteiner med DNA-bindende domener som er kjent som homeodomains. Disse homeodomain proteinene fungerer som transkripsjonsfaktorer, binding promotorområdene og aktivering av transkripsjon [12].
HOX
genet familiemedlemmer er prototypiske homeobox gener.
HOX
gener som er involvert i embryonale segmentering og mønstre, så vel som utviklingen av mange organsystemer, herunder gastrointestinale traktus [12]. Utviklings gener er ofte ectopically uttrykt i kreftutvikling [13], og flere
HOX
gener har vært knyttet til tykktarmskreft.
HOXB6
,
HOXB8
,
HOXC8
,
HOXC9
, og
HOXD13
er overexpressed i begge kolorektal kreft cellelinjer og primære colontumorer [14], [15], [16].
HOXB13
, men er vanligvis uttrykt i kolon mukosa, men er nedregulert i tumorvev [10]. Deregulering av ikke-
HOX
homeobox gener har også blitt observert i kolorektal karsinom.
CDX1 Hotell og
CDX2
er nedregulert i løpet av kolorektal kreftutvikling [17], [18], mens avvikende
PROX1
uttrykk i tykktarmen fører til økt dysplasi [19].
homeodomain transkripsjonsfaktorer ofte binde promoter regioner som enten homodimerisk eller heterodimere komplekser [20]. Denne dimerization gir økt spesifisitet transcriptional aktivering [21]. Den MEIS1 homeodomain proteinet er et kjent bindingspartner av flere andre homeodomen-proteiner, herunder HOXA7, HOXA9, og PBX1 [22].
MEIS1
spiller en rolle i den normale utviklingen av blodkreft avstamning og er overuttrykt i en undergruppe av akutte myeloide leukemier [23]. Økt
MEIS1
uttrykk har også blitt observert i neuroblastomer og uttrykket nivået av
MEIS1
transkripsjon er en prognostisk indikator på brystkreft [24]. Nedregulering av total
MEIS1
avskrift ble observert i kolorektale adenomer, noe som tyder på en rolle for
MEIS1
i tarm tumorigenesis [25].
På grunn av sammenhengen mellom homeobox gener og tykktarms kreft, undersøkte vi status for Meis1 i tykktarmen. I denne studien beskriver vi to nye Meis1 produkter uttrykt i murine mage-tarmkanalen. Disse to proteinene blir uttrykt i forskjellige celletyper og subcellulære rom. Begge proteiner er oversatt fra
Meis1d
avskrift, en homeodomain-mindre spleise variant av
Meis1
.
MEIS1D
, menneske homolog av
Meis1d
, ble identifisert i normal menneskelig kolon vev på både mRNA og protein nivå. Videre ser vi at nedregulering av
MEIS1D
uttrykk i menneskelige kolorektal kreft. Disse dataene tyder på at
MEIS1D
er en roman suppressor av tykktarms tumorigenesis og en potensiell terapeutisk mål for tykktarmskreft.
Materialer og metoder
Mus koloni
C57BL /6J (B6) mus ble hentet fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Mus ble opprettholdt i AALAC-akkreditert TJU Dyreavdelingen. Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen, 343C, ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Thomas Jefferson University, tillatelse nummer A3085-01.
Retroviral Infeksjon
HCT116-celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Cat. No. CCL-247), hvor identiteten av cellelinjen ble bekreftet ved analyse STR. MSCV-
Meis1d Hotell og MSCV-
Neo
plasmider ble transfektert i Phoenix celler ved hjelp av Profection Kalsiumfosfat kit (Promega, Madison, WI). Celler ble inkubert ved 37 ° C i 24 timer for å fremstille virusmateriale. Viral medium ble tilsatt til HCT116-celler i løpet av seks-brønners plater og sentrifugert ved 1800 rpm i 45 minutter. Cellene ble deretter inkubert ved 32 ° C i 3 timer, ble den virale mediet fjernet, og ny viral medium ble tilsatt. Cellene ble sentrifugert igjen ved 1800 rpm i 45 minutter og inkubert ved 32 ° C i ytterligere 3 timer. Viral medium ble erstattet med DMEM og cellene ble flyttet til 37 ° C i 48-72 timer for å tillate translasjon av den innførte sekvens.
Western blot-analyse
B6 mus ved 120 dagers alder ble avlivet av CO
2 kvelning fulgt ved halshugging. Vev og celleprøver ble vasket i 1 x PBS og homogenisert i lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 2 mM EDTA, 10% glycerol, 1% Triton-X-100) med proteasehemmere (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Proteinkonsentrasjonen ble kvantifisert ved anvendelse av Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). 20 ug av hver prøve ble separert ved SDS-PAGE (10% akrylamid) og overført til nitrocellulosemembraner. Membranene ble blokkert med 5% fettfri tørrmelk i 1 x TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,05% Tween 20). Primære antistoffer ble anvendt over natten ved 4 ° C: Meis1-N; Meis1d-C; GAPDH (Abcam, Cambridge, MA); aktin, histon H1, og cytokeratin 18 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California). Pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Vector Laboratories, Berlingame, CA) ble benyttet ved en fortynning 1:2500 i 1 time ved romtemperatur. Proteinene ble visualisert ved hjelp SuperSignal kjemiluminescenssubstrat (Thermo Scientific, Rockford, IL).
subcellulære fraksjone
Tissue og celleprøver ble vasket i 1 x PBS og homogenisert i lyseringsbuffer (10 mM Tris- HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl
2; 1 mM DTT, 1 mM PMSF) med proteasehemmere (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Lysatene ble deretter ført gjennom en 25½g nål, og sentrifugert ved 600 x g ved 4 ° C i 10 min. Supernatanten ble merket den cytoplasmiske fraksjon. Pelleten ble resuspendert i lyseringsbuffer og merket den nukleære fraksjonen.
epitelisk celleisolasjon
proksimale og distale colon prøver ble skåret i 1 mm brede strimler. Prøvene ble inkubert i 1 x PBS med 0,15% DTT i 30 minutter ved romtemperatur med konstant omrøring ved rørestav for å fjerne slim. Slimhinne strimler og rørestav ble vasket i 1 x PBS og deretter inkubert i 1 x PBS med 1 mM EDTA, pH 7,2 under omrøring i 60 minutter ved romtemperatur for å fjerne epitelceller. EDTA-oppløsningen ble oppsamlet og sentrifugert ved 470 x g i 5 min. Gjenværende vev ble inkubert i EDTA-løsning for å fjerne gjenværende epitelceller og deretter homogenisert i lyseringsbuffer som beskrevet ovenfor. Den epiteliale pelleten ble resuspendert i RPMI 1640 og inkubert med kollagenase (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ved 50 enheter /ml i 30 minutter ved 37 ° C, vortex-bland forsiktig hvert femte minutt. Prøvene ble sentrifugert ved 200 x g i 5 min. Pelleten ble resuspendert i 1 x PBS, sentrifugert på nytt og suspendert på nytt i RPMI. Den RPMI Cellesuspensjonen ble belagt på en 50% Percoll /PBS-blandingen. Den Percoll gradient ble sentrifugert ved 470 x g i 20 min. Epitelceller ble tatt fra toppen av gradienten, fortynnet med RPMI, og sentrifugert ved 830 x g i 5 min. Cellepelleten ble resuspendert i RPMI og igjen sentrifugert ved 470 x g i 5 min. Den endelige cellepelleten ble homogenisert i western blot lyseringsbuffer ved anvendelse av en 25½g nål.
RT-PCR
Vevsprøver ble homogenisert i 1 ml TRI reagensløsning (Ambion, Inc., Austin, TX) og sentrifugert ved 12000 x g i 15 min ved 4 ° C. 200 ul kloroform ble tilsatt. Prøvene ble blandet i 15 sekunder, inkubert ved romtemperatur i 3 minutter, og sentrifugert ved 12 000 x g i 20 minutter ved 4 ° C. Topplaget ble blandet med 500 ul 2-propanol, inkubert ved romtemperatur i 10 minutter, og sentrifugert ved 12 000 x g i 20 minutter ved 4 ° C. RNA-pelleten ble vasket med 75% etanol og sentrifugert ved 7500 x g i 5 min. RNA ble deretter lufttørket og resuspendert i DEPC-behandlet vann. Superscript II revers transkriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA) ble anvendt for å danne cDNA. Alle Meis1 transkripsjoner ble forsterket i murine prøver, mens MEIS1D-spesifikke primere ble brukt i humane prøver.
Immunohistochemistry
Vev ble fikset i Formalde-Fresh 10% bufret formalin løsning (Fisher Scientific) over natten ved 4 ° C og lagret i 70% EtOH. Faste vev ble dyppet i parafin og vev ble kuttet og montert på glassplater ved KCC translasjonell forskning Kjerne Facility. Vev ble deparaffinized hjelp citratbuffer, pH 6,0 (Vector Laboratories, Berlingame, CA) og farget med Meis1-N antistoff over natten ved 4 ° C. Anti-kanin-sekundært antistoff (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ble benyttet ved en fortynning 1:200 i 1 time ved 37 ° C etterfulgt av ABC-Linker-sett (Vector Laboratories, Berlingame, CA) i 30 minutter ved 37 ° C. Prøvene ble utviklet ved hjelp av DAB peroxydasesubstrat Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Farging ble visualisert på et Nikon Eclipse E600 mikroskop på enten 4 × eller 20 × forstørrelse.
Etikk
ville bli brukt
Pasientene ble samtykket ved hjelp av en skriftlig kirurgisk samtykkeskjema som sier avfallet fra kirurgi for forskningsformål. Alle prøvene ble tatt ved Thomas Jefferson universitetssykehus. The Thomas Jefferson universitetssykehus Institutional Review Board (IRB) unntas denne studien fra gjennomgangen fordi de mente at studien ikke utgjøre mennesker forskning og fravikes behovet for samtykke på grunn av det faktum at prøvene mottatt ble kodet for å fjerne identifikasjon.
Resultater
To nye Meis1 isoformene er til stede i murine mage-tarmkanalen
Selv om nedregulering av
MEIS1
i human kolorektal kreft har nylig blitt observert, rollen av genet i gastrointestinal (GI) homeostase og tumorigenesis er dårlig forstått. For å bestemme ekspresjonen av murine Meis1 isoformer i mage-tarmkanalen, ble en western blot utført på C57BL /6J (B6) GI lysater ved hjelp av et polyklonalt antistoff rettet mot den N-terminale ende av Meis1 (Meis1-N). Produkter av 43 kD og 51 kD ble observert i de fleste prøver (Figur 1a). Disse molekylvekter samsvarer med de kjente størrelser av to tidligere beskrevne isoformer, henholdsvis Meis1a og Meis1b,. Ytterligere to bånd ble observert i noen av prøvene: a ~32 kD protein som er tilstede i magen og tarmen, og en ~27 kD protein uttrykt i den proksimale tykktarm og cecum (Figur 1a). Den ~27 kD Produktet er det samme som den forutsagte vekt for Meis1d, en annen Meis1 isoform. Utskriften for
Meis1d
ble tidligere identifisert i løpet av skjermer av murine cDNA [26], [27]. Isoformen mangler alle av exon 8, noe som resulterer i en for tidlig stoppkodon i exon 9, og en teoretisk avkortet proteinprodukt (figur 1c, d). Eksistensen av en
in vivo
proteinprodukt, men har aldri blitt bekreftet.
A) Western blot analyse av B6 gastrointestinale lysatene ved hjelp av Meis1-N antistoff. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. PSI, MSI, og DSI viser lysatene fra den proksimale, midtre og distale tynntarm, henholdsvis. PC og DC angir lysater fra de proksimale og distale kolon. B) Forsterkning av
Meis1
isoformer fra B6 proksimale colon cDNA ved hjelp av RT-PCR. Diagrammer av C) utskrifter og D) produkter av Meis1a, Meis1b, og Meis1d isoformer er inkludert. Plasseringen av de to Meinox domener (M1 og M2) og homeodomain (HD) er merket.
Meis1d, en avkortet Meis1 isoform, er uttrykt i murine cecum og proksimale colon
Hvis 27 kD Meis1 produktet er Meis1d, deretter
Meis1d
transkripsjon bør være synlig i den proksimale colon. For å finne ut om
Meis1d
transkripsjon er til stede,
Meis1
spleisevarianter ble forsterket fra B6 proksimale colon cDNA prøvene ved hjelp av RT-PCR. Primere ble utviklet for å forsterke tvers ekson 8, skille
Meis1d
fra full lengde isoformene,
Meis1a Hotell og
Meis1b
. PCR reaksjonen amplifiserte produkter på ca 758 og 904 bp i lengde, den antatte størrelsen på produkter fra
Meis1d Hotell og
Meis1a /b
transkripsjoner (Figur 1b). Forskjellen i størrelse mellom de to produktene korresponderer med kjent lengde av exon 8 (146 bp), noe som tyder på at de mindre produkt mangler den exon. Ekstraksjon og sekvensering av de mindre PCR-produktet bekreftet fravær av exon 8 fra PCR-produktet (data ikke vist), noe som viser tilstedeværelsen av den
Meis1d
transkripsjon i den murine proksimale kolon.
Fjerning av ekson 8 fra
Meis1d
transkripsjon forårsaker et rammeskifte i ekson 9. resultatet av denne rammeskifte er produksjon av avkortede proteinprodukt med fem nye aminosyrer på C-terminalen (figur 1d). Siden disse restene ikke er til stede på fulle lengde Meis1 isoformer, ble en tilpasset antistoff rettet mot den unike epitop (Meis1d-C) generert. For å finne ut om den tilpassede antistoffet gjenkjenner ~27 kD Meis1 produkt, ble kolon lysatene fra B6 mus undersøkt med Meis1d-C og Meis1-N antistoffer. Proksimale tykktarm og distale colon lysater ble anvendt som positive og negative kontroller, respektivt. Som forventet, Meis1-N antistoff plukket opp tidligere identifisert ~27 kD bandet i proksimale colon, men ikke den distale colon (figur 2a). Det samme uttrykksmønster ble observert i prøvene probet med Meis1d-C-antistoff, som viser at den Meis1d-C-antistoff detekterer ~27 kD Meis1 produkt, og som angir at produktet er Meis1d (figur 2a). For å bestemme den romlige uttrykk mønster av Meis1d protein, ble lysater fra et panel av B6 organer probet med den Meis1d-C-antistoff. Meis1d ekspresjon ble begrenset til cecum og proksimale kolon (figur 2b, c).
A) Western blot-analyse av B6 proksimale og distale colon lysater med Meis1-N og Meis1d-C-antistoffer. Posisjonene av Meis1, Meis1b, og de to nye Meis1 produktene er merket. B) og C) Lysater fra et panel av B6 organer ble probet med den Meis1d-C-antistoff. GAPDH ble brukt som en lasting kontroll.
posttranslational modifisering av Meis1d korrelerer med subcellulære lokalisering
homeodomain mindre isoformer av andre homeodomain proteiner har vist seg å fungere gjennom to mekanismer. De homeodomain-mindre proteiner kan beslaglegge full lengde isoformer i cytoplasma gjennom dominerende negative interaksjoner. Homeodomen-mindre isoformer kan også fungere som atombindingspartnere for andre transkripsjonsfaktorer, forandre aktivering av nedstrøms målgener. Derfor kan den subcellulære lokalisering av Meis1d indikerer den funksjonelle rolle av isoformen i tykktarmen. For å bestemme subcellulære lokalisering av Meis1d, ble B6 proksimale kolon lysatene delt inn i kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner og analysert med Meis1-N antistoff. Som forventet, full lengde Meis1 var til stede i det nukleære fraksjon (figur 3a). Den 32 kD Meis1 produkt var også til stede i kjernen. Den 27 kD Meis1d protein, men ble bare observert i den cytoplasmiske fraksjon (figur 3a). Disse lokalisering data indikerer at Meis1d ikke opptrer som en transkripsjonsfaktor eller avsette full lengde Meis1 utenfor kjernen, noe som tyder på at den isoformen har nye cytoplasmatiske funksjoner.
A) B6 proksimale kolon prøvene ble separert i kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner og undersøkt med Meis1-N antistoff. Histon H1 ble brukt til å bekrefte den subcellulære fraksjonering. B) Western blot-analyse av B6 proksimal tykktarm og HCT116-celler som uttrykker den Meis1d ORF ved hjelp av Meis1-N-antistoff. C) HCT116-celler ble infisert med retroviralt den Meis1d ORF eller en tom MSCV vektor. Celler ble tatt 72 timer etter infeksjon, fraksjonerte, og probet med den Meis1-N-antistoff. Posisjonene til Meis1a, kjerne Meis1d (Meis1d
32), og cytoplasmatiske Meis1d (Meis1d
27) er merket der det er aktuelt.
For å studere effektene av
Meis1d
ekspresjon
in vitro
, den åpne leseramme (ORF) på
Meis1d
ble retroviralt infiserte inn mot HCT116 tykktarmskreftcellelinje. Western blot-analyse av cellelysater viste nærvær av et 32 kD protein som ble gjenkjent av Meis1-N-antistoff, men ikke den Meis1d-C-antistoff (figur 3b). Dette
in vitro
Meis1d produktet er ~ 5 kD større enn den forventede 27 kD protein spådd av Meis1d transkripsjon og observert
in vivo plakater (figur 3b). Imidlertid er molekylvekten samsvarer med den nye 32 kD Meis1 isoform tidligere observert i mage og tykktarm B6 lysater (Figur 1a). Molekylvekten til
in vitro
Meis1d ble bekreftet i begge murine 3T3 og ape COS-1-celler, noe som indikerer at den økte størrelsen er ikke cellelinje bestemt (data ikke vist). Posttranslasjonell modifikasjon av
in vitro
Meis1d produkt kan være årsaken til den økte molekylvekt, så vel som manglende evne til Meis1d-C-antistoff for å påvise proteinet.
I motsetning til 27 kD Meis1d produkt, er det 32 kD Meis1 isoform lokalisert til kjernen i den proksimale kolon. For å avgjøre om
in vitro
Meis1d er også lokalisert til kjernen, HCT116-celler som uttrykker Meis1d var fraksjonert. De 32 kD
in vitro
Meis1d produkt var til stede i atomlysatene, rekapitulere
in vivo
subcellulære lokalisering av romanen 32 kD isoform (figur 3c). Disse dataene antyder at både 27 kD og 32 kD Meis1 isoformer observert i murine mage-tarmkanalen er oversatt fra
Meis1d
transkripsjon. Den cytoplasmatiske form (Meis1d
27) er den anslåtte molekylvekt på Meis1d, mens kjernefysiske form (Meis1d
32) er større, mest sannsynlig på grunn av posttranslational modifikasjon.
Nuclear og cytoplasma Meis1d er gjensidig utelukkende i tykktarmen
colon består av et enkelt lag av epitelceller som dekker lamina propria og flere muskellagene. Tykktarmskreft er avledet fra stamceller som ligger i epitellaget [28]. For å avgjøre om enten Meis1d
27 eller Meis1d
32 er uttrykt i kolonepitelet, epitelceller ble isolert fra B6 proksimale og distale colon prøver. Lysates fra de isolerte epitelceller og lamina propria /muskellagene ble undersøkt med Meis1-N antistoff. Den Meis1d
27-protein ble uttrykt utelukkende i epitelcellene i den proksimale kolon (figur 4a). Meis1d
32, derimot, ble uttrykt i lamina propria /muskellagene fra både den proksimale og distale colon (figur 4a). Full lengde Meis1 isoformer, Meis1a og Meis1b, var også til stede i bare lamina propria /muskelprøver (figur 4a). Disse data indikerer at de nukleære og cytoplasmatiske former av Meis1d ikke er til stede i de samme cellepopulasjoner i murine colon. Videre Meis1d
27 er uttrykt i colonic epitelceller i fravær av full lengde Meis1. For ytterligere å bekrefte epitelceller uttrykk for Meis1d
27, ble B6 kolon prøver farget med Meis1-N antistoff. Sterk cytoplasmatisk farge ble observert i epitelet i den proksimale kolon, men ikke den distale colon (figur 4b). Dette uttrykket mønster sammenfatter ekspresjon av Meis1d
27, igjen antyder at Meis1d
27 er til stede i epitelcellene i den proksimale kolon.
A) B6 proksimale og distale colon prøvene ble separert i epithelial og ikke-epiteliale fraksjoner. De ikke-epiteliale fraksjoner består av lamina propria og muskellagene i tykktarmen. De fraksjoner og helcellelysater fra begge segmenter kolon ble probet med den Meis1-N-antistoff. Cos-1 celler som uttrykker Meis1d ble brukt til å sammenligne
in vitro Hotell og
in vivo
molekylvekt på Meis1d
32. B) B6 nære og fjerne tykktarm prøver ble farget med Meis1-N antistoff. Farging ble visualisert ved 20 × forstørrelse.
Uttrykk av MEIS1D protein er nedregulert i menneskelige kolorektal kreft
Meis1 er sterkt konservert i eukaryoter og fjerning av ekson 8 fra menneskets MEIS1 mRNA vil kode en antatt protein produkt med 99% homologi overfor murine Meis1d. Basert på den evolusjonære bevaring av Meis1, forsøkte vi å karakterisere uttrykk for MEIS1D i menneskets tykktarm. En vestlig blot ble utført på menneskelige kolon lysatene ved hjelp av Meis1-N antistoff. Et band den antatte størrelsen på MEIS1D
27 ble observert i menneskelige kolon prøver (figur 5b). For å bekrefte ekspresjonen av den MEIS1D transkript, ble RT-PCR utført på human colon cDNA (figur 5a). Et 758 bp bånd ble forsterket, noe som indikerer at
MEIS1D
mRNA blir transkribert i den humane kolon.
A) RT-PCR-amplifisering av
MEIS1D
transkriptet fra human tykktarm cDNA. B) Western blot-analyse av lysater fra humane kolorektale tumorer (T) og tilpasset normal slimhinne (N) ved hjelp av Meis1-N-antistoff. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. Prøvene representerer alle fire delene av menneskets tykktarm:. Stigende, tverrgående, synkende, og sigmoid
Uttrykk for full lengde MEIS1 er kjent for å være dysregulerte i flere solide tumorer [29], [30]. For å avgjøre statusen til MEIS1 i tykktarmskreft, ble vestlige blotter utført på matchet normal tykktarm og primære kolorektal kreftlysatene ved hjelp av Meis1-N antistoff. MEIS1A og MEIS1B ble uttrykt i både tumor og normale prøver, mens MEIS1D
32 ikke var til stede i begge sett av prøver (data ikke vist). Imidlertid, 83% (10/12) av normal tykktarmsslimhinne prøver uttrykte detekterbare nivåer av MEIS1D
27-protein (figur 5b). Expression ble redusert eller helt borte i alle matchet tumorprøver fra disse pasientene (figur 5b). De resterende to pasientene uttrykte ikke målbare nivåer av MEIS1D
27 i både normal slimhinne og svulstvev (figur 5b). Disse
in vivo
data indikerer at MEIS1D
27 uttrykk er nedregulert i løpet av tarm tumorigenesis.
Diskusjoner
Alternativ spleising er kjent for å produsere to
Meis1
isoformer,
Meis1a Hotell og
Meis1b
, både mus og mennesker. Både Meis1a og Meis1b proteiner er full lengde, inneholdende de to Meinox domener som er involvert i protein-protein interaksjoner og den DNA-bindende homeodomain (figur 2d). De proteinprodukter av disse spleisevarianter er forskjellige i C-enden, på grunn av skjøting av exon 12 fra
Meis1b
koding sekvensering (figur 2c, d). Tyder på at de to tilsvarende isoformer kan aktivere transkripsjon av ulike undergrupper av gener [31]. Screens av cDNA bibliotek viser at et stort antall ekstra alternativt skjøtes transkripsjoner er produsert fra
Meis1
locus [26], [27], [32]. I motsetning til
Meis1a Hotell og
Meis1b
imidlertid proteiner for andre
Meis1
transkripsjoner har ikke blitt observert
in vivo
. Derfor er det fortsatt uklart om disse transkripsjonene er funksjonelt relevante eller bare gjenstander som genereres av feil alternativ spleising.
I denne artikkelen har vi beskrevet to proteinprodukter av
Meis1d
spleisevariant, en isoform tidligere identifisert i cDNA skjermer.
Meis1d
transkripsjon mangler ekson 8, noe som resulterer i en predikert 27 kD-protein som mangler den homeodomain (figur 2c, d). Dette 27 kD produkt ble observert i cytoplasma av proksimale tykktarm epitelceller (3a, 4a). En andre, forekommer 32 kD Meis1d produkt i kjernen av ikke-epiteliale celler i mage og tykktarm (figurene 3a, 4a). De cytoplasmatiske og kjernefysiske former for Meis1d har fått navnet Meis1d
27 og henholdsvis
32, Meis1d. Jo større molekylvekt og kjernefysiske lokalisering av Meis1d
32 protein er rekapitulert i celler transfektert med
Meis1d
ORF (figur 3b). Uttrykk for MEIS1D
27 i menneskelige kolon prøvene ble også observert, viser evolusjonære bevaring av denne romanen isoform (figur 5).
Meis1d
er bare den tredje
Meis1
isoform som en oversatt protein produktet har blitt bekreftet, og er også den første homeodomain mindre Meis1 produkt observert i enten mus eller menneskelig vev.
homeodomain mindre isoformer har blitt beskrevet i mange homeobox gener, inkludert flere medlemmer av Hox familien. Bare et fåtall av disse isoformer, derimot, har blitt identifisert i fortellingen supergener, en gruppe inkludert Meis1. Tapet av homeodomain hindrer direkte binding til DNA-target-sekvenser og normal transkripsjonen aktivering. Homeodomen-mindre isoformer av TALE transkripsjonsfaktorer, imidlertid, er tidligere blitt vist at fortsatt regulere transkripsjon gjennom to forskjellige mekanismer. De avkortede isoformer kan ha en dominant negative effekter, sekvestrering av full lengde proteiner i cytoplasma og hindre transkripsjonen aktivering av nedstrøms mål [33], [34]. De homeodomain-mindre proteiner kan også samhandle indirekte med DNA ved å binde andre transkripsjonsfaktorer for å danne heterodimerer. Tilstedeværelsen av de avkortede proteiner som endrer DNA-bindingssetet av det proteinkomplekset, aktivere en distinkt undergruppe av nedstrøms mål [35].
Siden homeodomen-isoformer mindre beslektede gener har forskjellige mekanismer i cytoplasma og cellekjernen, de subcellulære lokaliseringer av Meis1d og eventuelle bindingspartnere kan foreslå en cellular funksjon. I den foreliggende undersøkelse, ble Meis1d observert i enten kjernen eller i cytoplasma, avhengig av celletype. Meis1d
27 er uttrykt i cytoplasma av proksimale tykktarm epitelceller (figurene 3, 4). Full lengde isoformene er tilstede i atomfraksjonen av proksimale kolon lysatene, noe som indikerer at Meis1d
27 ikke binder andre Meis1 isoformer i cytoplasma (figurene 3, 4). Ytterligere bevis indikerer at Meis1d
27 er ikke uttrykt i de samme cellene som Meis1a eller Meis1b, hindrer enhver form for dominant negativ interaksjon (figur 4). Den cytoplasmatiske form av Meis1d kan fortsatt binde andre ukjent transkripsjonsfaktorer og hindre atom lokalisering. Isoformen kan også ha en roman homeodomain-uavhengig funksjon som ikke er relatert til transcriptional aktivering.
Den potensielle funksjon Meis1d
27 er uklart fordi dataene ikke passer enten kjent mekanisme homeodomain-mindre Tale proteiner. Proteinet kan ikke fungere som en dominant negativ, siden den ikke blir uttrykt i de samme cellene som andre Meis1 isoformer. Meis1d
27 heller ikke kan aktivere transkripsjon nedstrøms inne i kjernen, fordi proteinet er lokalisert til cytoplasmaet. Den kjernefysiske form av Meis1d kan imidlertid likevel montere et av disse mekanismene i lamina propria eller muskel som omgir tykktarmen. Den kjernefysiske lokalisering av Meis1d
32 betyr at protein kunne fungere som en bindende partner for andre transkripsjonsfaktorer. Meis1d
32 fortsatt opprett motivene som kreves for PBX samhandling og homodimerization [36]. Disse data tyder på at den avkortede isoformen kan likevel fungere som en ko-faktor med disse andre homeodomen proteiner. Den Meis1d
32 protein kan også fungere som dominant negativ isoform inne i kjernen, hindrer sammenheng mellom full lengde Meis1 proteiner og promoter regioner i DNA. Ytterligere disseksjon av lamina propria og det underliggende muskellaget er nødvendig å bestemme om Meis1d
32 og potensielle bindingspartnere er uttrykt i den samme populasjon av celler. Identifisering av funksjonelle roller for både Meis1d
32 og Meis1d
27 vil bidra til å forklare relevansen av
Meis1
skjøting i tarmfunksjonen og homeostase.
Til tross for mangelen på en definert funksjon
