Abstract
ovarialcancer (OC) er den mest dødelige gynekologisk kreft. Til tross for fremskritt i behandlingen av OC med kombinatoriske regimer, inkludert kirurgi og platina-basert kjemoterapi pasienter generelt utviser dårlig prognose på grunn av høy kjemoterapi motstand. Heri, testet vi hypotesen om at DNA skade respons (DDR) veier er involvert i motstanden av OC pasienter til platina kjemoterapi. Valgte DDR signaler ble evaluert i to humane ovarie carcinom cellelinjer, en følsom (A2780) og en resistent (A2780 /C30) til platina behandling samt i perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra OC pasienter, følsom (
n
= 7) eller resistente (
n
= 4) til påfølgende kjemoterapi. PBMC fra friske frivillige (
n
= 9) ble studert parallelt. DNA-skade ble evaluert ved immunfluorescens γH2AX farging og kometmetoden. Høyere nivåer av indre DNA-skade ble funnet i A2780 enn i A2780 /C30-celler. Dessuten, den iboende DNA-skade nivåene var signifikant høyere hos OC pasientene, i forhold til friske frivillige, så vel som i platina-sensitive pasienter i forhold til platina-resistente de (all
P
0,05). Etter carboplatin behandling, A2780 celler viste lavere DNA-reparasjon effektivitet enn A2780 /C30 celler. Også etter karboplatin behandling av PBMC
ex vivo
, DNA reparasjon effektivitet var signifikant høyere hos friske frivillige enn i platina-resistente pasienter og lavest i platina-sensitive de (t
1/2 for tap av γH2AX foci: 2,7 ± 0,5 timer, 8,8 ± 1,9 H og 15,4 ± 3,2H, henholdsvis ved hjelp av kometmetoden, t
1/2 av platina-indusert skade reparasjon: 4,8 ± 1,4 H, 12,9 ± 1,9 H og 21,4 ± 2.6h, henholdsvis alle
P
0,03). I tillegg er karboplatin-indusert apoptose hastigheten var høyere i A2780 enn i A2780 /C30 celler. I PBMC ble apoptose priser inverst korrelert med DNA-reparasjons effektiviteten av disse cellene, som er betydelig høyere i platina-sensitive enn i platina-resistente pasienter og lavest hos friske frivillige (alle
P
0,05). Vi konkluderer med at forstyrrelser av DNA reparasjon pathways målt i PBMC fra OC pasienter korrelerer med stoffet følsomhet av disse cellene og reflektere individuell respons til platina-basert kjemoterapi
Citation. Stefanou DT, Bamias A, Episkopou H , Kyrtopoulos SA, Likka M, Kalampokas T, et al. (2015) Aberrant DNA Damage Response Pathways Kan forutsi utfallet av Platinum Kjemoterapi i eggstokkreft. PLoS ONE 10 (2): e0117654. doi: 10,1371 /journal.pone.0117654
Academic Redaktør: Goli Samimi, Garvan Institute of Medical Research, AUSTRALIA
mottatt: 16 juli 2014; Godkjent: 12 november 2014; Publisert: 06.02.2015
Copyright: © 2015 Stefanou et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Datatilgjengelighet: Data er tilgjengelig fra Helios Digital Repository. https://helios-eie.ekt.gr/EIE/handle/10442/14421
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet delvis av Athens University Medical School stipend ELKE 097, og ved ECNIS (Environmental Cancer, ernæring og individuell følsomhet) Network of Excellence for den europeiske union (kontrakt nr. 513943). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft (OC) er den femte vanligste krefttypen hos kvinner og den ledende årsaken til dødelighet for gynekologiske kreftformer, med epithelial karsinom er den vanligste variasjon [1,2]. OC er vanligvis diagnostisert i avansert stadium og ofte bærer en forferdelig kamp prognose, selv om dagens behandlingsstrategier inkludert aggressiv kirurgisk cytoreduksjon og platina-paclitaxel kjemoterapi synes å ha betydelig forbedret den relative overlevelsen av disse pasientene til en 5-års overlevelse på over 40% [3]. Etablerte prognostiske faktorer for OC omfatter stadium, histologisk subtype, tumortype og -mengde av restsykdom etter cytoreduktiv kirurgi [4,5].
Tre forskjellige platinaforbindelser, nemlig cisplatin, karboplatin og oksaliplatin, er for tiden brukes i klinisk praksis, med mange indikasjoner, som dekker et bredt spekter av solide svulster [6]. Deres cytotoksiske virkning utøves ved reaksjon med DNA og utviklingen av DNA-skade ved dannelse av tverrbindinger, Pt-d [GPG] (1,2-intrakjede kryssbindinger, 65%), Pt-d [APG] ( 1,2-intrakjede kryssbinder, 25%) og i mindre grad Pt-d [GpNgG] (1,3-intrakjede kryssbindinger), interstrand kryssbindinger (ICLs, den mest cytotoksiske) og enkelt-nukleotid skade guanin [7]. Nukleotid excision reparasjon (NER) er den viktigste prosessen som platina intrakjede tverrbindinger og enkelt-nukleotid skade av guanin er reparert [8,9]. På den annen side, er ICL reparasjon komplisert og krever en kombinasjon av NER, fanconi anemi reparasjon vei, translesion syntese og homolog rekombinasjon [10-12]. Interessant, ICLs reparasjon fortsetter via dannelsen av DNA dobbel-tråd pauser (DSB sin) som representerer den mest dødelige formen for DNA-skade [13]. Dannelsen av DSB blir alltid etterfulgt av fosforylering av histon H2AX, en variant av den H2A protein familien, som er en komponent av histon octamer i nucleosomes. Den histone H2AX fosforyleres av kinaser som ataksi telangiectasia mutert (ATM) og ATM-Rad3 relaterte (ATR) i PI3K veien [14]. Dette nylig fosforylert protein, γH2AX, er første skritt i å rekruttere og lokalisere DNA-reparasjonsproteiner.
pattedyr genomet er beskyttet mot gentoksiske fornærmelser av et nettverk av DNA-skader respons (DDR) veier, som er utløst av påvisning av DNA lesjoner gjennom spesifikke sensorer [15]. Det etterfølgende trinn er initiering av en signaltransduksjon kaskade, som aktiverer forskjellige genom-beskyttelses veier. Siden DDR er en omfattende signal prosess som bestemmer cellen skjebne enten ved å reparere DNA-skader eller gjennomgår apoptose, har sin rolle vært innblandet i sykdomsprosessen og i suksessen til kjemoterapi. Faktisk har det blitt vist at unormalt i DNA-reparasjonsbaner spiller en viktig rolle i den maligne transformasjon av OC [16]. Også uttrykk for DNA reparasjon proteiner, slik som brystkreft 1 (BRCA1) og excision reparasjon kryss complementation gruppe 1 (ERCC1) har korrelert med dårlig overlevelse i avansert OC og ble funnet å være markører for motstand mot platinabaserte legemidler [17- 19]. I tillegg er våre tidligere studier fokusert på nivåene av DNA-skader i perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra pasienter med myelomatose har vist at DNA-skade kan prospektivt skille mellom pasienter med ulike grader av terapeutisk respons, noe som gir grunnlag for pre-screening og utvalg av disse pasientene mer sannsynlig å dra nytte av denne behandlingen [20-24].
Heri, gjennomførte vi en studie for å teste hypotesen om at DDR, en viktig mekanisme for celle overlevelse, er involvert i motstanden mot platina kjemoterapi . Vi fant at OC pasienter er kjennetegnet ved høyere iboende DNA-skade sammenlignet med friske frivillige, og at effektiviteten av DNA-reparasjon som målt i PBMC fra OC pasienter korrelerer med medikamentsensitivitet av disse cellene og gjenspeiler den individualiserte respons på platinabasert kjemoterapi.
Materialer og Metoder
pasienter
Alle pasienter inkludert i denne analysen ble forvaltet på en enkelt institusjon (Alexandra Hospital, Aten, Hellas). Blodprøver ble tatt fra atten (
n
= 18) pasienter som gjennomgår kirurgi for mistanke om kreft i eggstokkene (gjennomsnittsalder 62 år, range 34-77) (tabell 1) før noen terapeutisk behandling. Nine (
n
= 9) friske individer, alders- og kjønns tilpasset pasienter (alle kvinner, gjennomsnittsalder 60 år, range 29-73) ble servert som kontroller. Alle pasientene ble iscenesatt i henhold til FIGO iscenesettelse system. Kjemoterapi ble initiert innen én måned fra kirurgi. Paclitaxel på 175 mg /m
2 over 3 timer umiddelbart etterfulgt av karboplatin 5-6 AUC over 60 minutter ble administrert hver 3. uke. Seks sykluser med kjemoterapi ble administrert. Sju pasienter har ikke fått post kirurgi kjemoterapi: 3 hadde border svulster, en pasient døde i den postoperative perioden, mens 3 pasienter nektet enhver behandling etter operasjonen. Platinum følsomhet for de 11 pasientene som fikk første linje kjemoterapi ble vurdert i henhold til Gynekologisk kreft Intergroup Committee (GCIC) kriterier [25]. Ved disse kriteriene, var det fire platina-motstandsdyktige og 7 platina-sensitive pasienter. Overlevende pasienter bør ha et minimum oppfølging av 2 år. Alle deltakerne ga skriftlig informert samtykke i henhold til Helsinkideklarasjonen prinsipper, og studien ble godkjent av Institutional Review Board of Alexandra Hospital.
Cell behandling
platina-sensitive A2780 og platina-resistente A2780 /C30 cellelinjer [26] ble vennlig levert av Dr. George Koukos (Ovarian Cancer Research Center, University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania, USA). Celler ble dyrket i monolag ved bruk av RPMI 1640 inneholdende 10% føtalt kalveserum, 100 ug /ml streptomycin, 100units /ml penicillin, 0,3 mg /ml glutamin og 0.3unit /ml insulin i en 37 ° C inkubator kontinuerlig gasset med 5% CO
2. Cellene ble behandlet med cisplatin (0-100μg /ml for 0-24 t), etterfulgt av inkubasjon i stoff-fri medium for 0-24 eller carboplatin (0-300μg /ml for 0-24 t), etterfulgt av post-inkubasjon i narkotika -gratis medium for 0-24.
PBMC ble isolert fra nytappet perifert blod ved bruk av standard metoder [23]. Deretter ble cellene stimulert i proliferasjon ved bruk av 10 ug /ml fytohemagglutinin (PHA) i 48 timer ved 37 ° C i RPMI 1640 supplementert med 10% FCS, 50 mg /l penicillin, 50.000lU /l streptomycin og ble deretter behandlet med cisplatin (0-300μg /ml for inntil 3 h), etterfulgt av inkubasjon i stoff-fri medium for 0-24 eller carboplatin (0-1800μg /ml i opptil 24 timer), etterfulgt av post-inkubasjon i stoff-fri medium for 0-24 t.
Cvtotoksisitetsmålinq
etter behandling, levedyktige celler ble talt ved trypan blått fargestoff-utelukkelse [27]. I korthet, etter inkubasjon med medikamentet, cellene ble vasket og resuspendert i fullstendig medium. Et like stort volum av 0,4% trypanblått-reagens ble tilsatt til cellesuspensjonen og den prosentandel av levedyktige celler ble evaluert. Analysene ble utført i tre eksemplarer.
encellede gelelektroforese (Comet assay)
Den encellede gel elektroforese analyse ble utført under alkaliske betingelser som beskrevet tidligere [28]. I korthet ble alikvoter av 5×10
4 ubehandlede eller platinalegemiddelbehandlede celler ble suspendert i lavt smeltepunkt agarose (1%) i PBS (135mmol /l NaCl, 2,5 mmol /l KCl, pH 10) ved 37 ° C, og spredning på fullstendig matt objektglass på forhånd er dekket med et tynt lag av 1% normal smeltende agarose (Biozyme, Hameln, Tyskland). Cellesuspensjonen ble umiddelbart dekket med et dekkglass og objektglassene ble holdt ved 4 ° C i 1 time for å tillate størkning av agarose. Etter fjerning av dekkglass ble cellene utsatt for lyseringsbuffer (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 10, 1% Triton X-100) ved 4 ° C i 1 time. Deretter ble platene plassert i en horisontal gelelektroforese kammer. Kammeret ble fylt med kaldt elektroforese buffer (1 mM EDTA, 300 mM NaOH, pH 13) og objektglass ble holdt ved 4 ° C i 40 min for å tillate DNA for å slappe av. Elektroforese ble utført i 40 min (1V /cm, 255mA). Etter elektroforese, ble objektglassene vasket med nøytralisering buffer (0,4 M Tris-HCl, pH 7,5) i 10 minutter og deretter med H
2O i 10 minutter. Alle fremstillingstrinn ble utført i mørket for å hindre ytterligere DNA-skade. Platene ble farget med 20 ul av 1 ug /ml DAPI og analysert med et fluorescens-mikroskop (NIKON Eclipse 400) er utstyrt med et CCD-4230A videokamera. Digitale bilder ble kjøpt opp av et digitalt bildeanalysesystem (Kinetic Analysis, Wirral, UK). Olive Tail Moments [OTM = (Tail Mean-Head Mean) x (% av DNA) /100] av 100 celler /behandling tilstand ble vurdert.
immunfluorescens antigen farging og konfokal laser scanning mikroskop analyse
Alikvoter av 2×10
4 ubehandlede eller platinalegemiddelbehandlede celler ble festet til dekkglass belagt med 1 M HCl og 50 mg /ml poly-D-lysin før bruk, festet ved tilsetning av en 4% paraformaldehydløsning i 6 min ved romtemperatur og lagret ved -70 ° C inntil analyse av pATM (serin-1981, Santa Cruz), patr (serin-428, cellesignalisering), pChk1 (serin-345, Santa Cruz), pChk2 (treonin-68, Abcam) og γH2AX (serin-139, Cell Signaling) [29]. Cellene ble vasket med kald PBS og blokkert med 0,5 ml per brønn blokkeringsbuffer (0,1% Triton X-100, 0,2% skummet tørrmelk i PBS) i 1 time ved romtemperatur i en fuktet boks. Blokkerte celler ble inkubert med antistoffer mot pATM, patr, pChk1, pChk2 eller γH2AX i blokkering buffer ved 4 ° C over natten. Etter vasking med blokkeringsbuffer, ble celler inkubert med geite-anti-mus-antistoff, FITC-merkede, sammen med geite-anti-kanin, TRITC merket, for dobbel merking (Invitrogen) ved en fortynning på 1: 4000 i blokkeringsbuffer i 1 time ved romtemperatur i mørket. Dekk ble brukt, og kantene ble forseglet med klar neglelakk. Bilder ble visualisert med en Leica TCS SP-en konfokal laser scanning mikroskop. Foci ble tellet manuelt på 200 celler /behandling tilstand og resultatene er uttrykt som% av γH2AX positive celler (gjennomsnitt ± SD) fra tre uavhengige eksperimenter; positive celler er definert som celler med mer enn 5 foci per celle.
apoptose analysen
Apoptose ble evaluert ved hjelp av Cell ELISA-PLUS Død Detection kit (Roche Applied Sciences), i henhold til produsentens bruksanvisning. I korte trekk ble celler behandlet med forskjellige doser av karboplatin (cellelinjer, 0-300μg /ml; PBMC, 0-1800μg /ml) i 24 timer, etterfulgt av inkubering i medikamentfritt medium i 24 timer. Deretter ble cellene samlet opp for å fremstille de cytosoliske fraksjoner som inneholdt DNA-fragmenter. Like volumer av disse cytosoliske fraksjoner ble inkubert i anti-histon antistoff-belagte brønner (96-brønners plater), og histoner av DNA-fragmenter ble tillatt å binde til anti-histon-antistoffer. De peroksidase-merket DNA-mus-monoklonale antistoffer ble brukt til å lokalisere og påvise det bundne fragmentert DNA ved bruk av fotometrisk påvisning med 2,29-azino-di- (3-etylbenztiazolin-sulfonat) som substrat. Testen kvantifiserer apoptose som gangers økning (uttrykt som anrikningsfaktor, EF) i nivået av apoptose i behandlede prøver med ubehandlede prøver. Vi har beregnet den spesifikke anrikning av mono- og oligo-nukleosomer slippes ut i cytoplasmaet ved anvendelse av følgende formel: (EF) = [(absorbans av de behandlede celler) /(absorbans av cellene uten behandling)]. Til slutt ble den individuelle apoptose hastigheten uttrykt som den carboplatin dose som er tilstrekkelig til å utløse induksjon av en viss Enrichment faktor (EF = 3).
Statistisk analyse
Effektiviteten av DNA-reparasjon og induksjon av apoptose ble sammenlignet mellom grupper av individer med ikke-parametriske tester. Spesielt ble Kruskal Wallis analyse brukes for sammenligninger på tvers av alle tre gruppene, og Wilcoxon rank sum test for parvise sammenligninger. Korrelasjoner mellom verdiene for de forskjellige DDR-relaterte parametre innenfor cellelinjer eller PBMC ved de forskjellige OC pasienter ble vurdert av Spearman korrelasjonskoeffisienten (alle grupper kombinert). For å vurdere den lineære sammenhengen mellom DNA-skade og platina medikamentdose, apoptose og DNA-skade, så vel som apoptose og pan-nukleær farging, ble lineær regresjon av disse parametre utført. En
P
-verdi mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Å redegjøre for multiple sammenligninger den Bonferonni korreksjon ble brukt.
Resultater
DNA reparasjon av platina-indusert skade i ovarialcancer cellelinjer korrelerer med stoffet følsomhet av disse cellene
for å undersøke de molekylære mekanismene involvert i narkotika følsomheten av platina kjemoterapi ble endringer i viktige molekyler av mobil DDR pathway (pATM, patr, pChk1, pChk2, γH2AX) evaluert i to ovarialcancer cellelinjer: en platinum-sensitive (A2780) og en platina-resistente (A2780 /C30) [26]. Celler ble behandlet med forskjellige doser av cisplatin (0-100μg /ml) i 0-24 t, etterfulgt av inkubering i medikamentfritt medium i 0-24 t. Begge cellelinjer viste en doseavhengig økning i dannelsen av alle viktige molekyler under studien (Fig. 1 A, D). Maksimale nivåer av disse molekylene ble observert ved 6 timer etter behandling, gjenværende stabil eller svakt synkende deretter (fig. 1B). Interessant, γH2AX viste de høyeste induksjons priser blant de viktigste molekylene undersøkt. Den laveste konsentrasjon ved hvilken cisplatin γH2AX induksjon kunne bli detektert var 2,5 ug /ml i 1 time (fig. 1C). Videre ble cellene behandlet med carboplatin (0-300μg /ml) for 0-24 etterfulgt av post-inkubasjon i stoff-fri medium for 0-24. Lignende resultater som de som oppnås fra cisplatin eksperimenter ble funnet. Det vil si, i begge cellelinjene ble det observert en doseavhengig økning i dannelsen av alle viktige molekyler (fig. 1 E, F). Dessuten ble maksimale nivåer av disse molekylene observert ved slutten av den 24 timers behandling, reduseres deretter. Igjen, γH2AX viste de høyeste induksjons priser blant de viktigste molekylene undersøkt. Samlet utgjør disse resultatene indikerer at immunfluorescens kvantifisering av γH2AX foci er en kraftfull tilnærming for å måle DNA-skade indusert av platina narkotika.
A2780 /C30 celler (representant for de to OC cellelinjer) ble behandlet (A) med cisplatin (0-100μg /ml) i 3 timer, eller (B) med 100 ug /ml cisplatin, deretter inkubert i medikamentfritt medium i forskjellige tidsperioder (0-24), eller (C) med forholdsvis små doser (0- 15μg /ml) av cisplatin i opp til 3 timer, og analysert ved slutten av behandlingen ved hjelp av konfokal mikroskopi. Positive celler: celler med mer enn 5 brennpunkter per celle. Feilstolpene representerer standardavvik. I (D) typiske bilder som viser de viktigste molekylene som studeres ved hjelp av mikroskop analyse av A2780 /C30 celler behandlet med 100 ug /ml cisplatin for 3t; øvre bilder, immunfluorescens antigen flekker; bunn bilder, cellekjerner merket med DAPI. (E) A2780 /C30-celler ble behandlet med karboplatin (0-300μg /ml) i 24 timer, eller (F) med 100 ug /ml karboplatin i forskjellige tidsperioder (0-24) og analysert ved hjelp av konfokal mikroskopi. Feilstolpene representerer standardavvik. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer.
Nivåene av platina-indusert DNA-skader i begge cellelinjer ble også vurdert å bruke alkaliske kometmetoden. Denne versjonen av kometen analysen påviser DNA migrasjon forårsaket av trådbrudd, alkaliske labile områder, og forbigående reparasjon nettsteder [30]. Etter behandling av cellene med 0-150μg /ml cisplatin i 3 timer (fig. 2A, C) eller 0-300μg /ml karboplatin i 24 timer (fig. 2B, C), en lineær doseavhengig økning av DNA-skade nivåer ble oppnådd i begge cellelinjer, noe som indikerer at fremgangsmåten har de følsomhet og nøyaktighet for å påvise og kvantifisere platina-indusert DNA-skade.
A2780 /C30-celler (representative av de to cellelinjene OC) ble behandlet med (A), cisplatin ( 0-150μg /ml) i 3 timer, eller (B) karboplatin (0-300μg /ml) i 24 timer og analysert ved slutten av behandlingen ved hjelp av komet analysen. Feilstolpene representerer standardavvik. I (C) typisk komet analysebilder av A2780 /C30-celler ikke-behandlede (NT), behandlet med 50 ug /ml cisplatin (cis-50), 100 ug /ml cisplatin (cis-100), 150μg /ml karboplatin (karbo-150 ) eller 300μg /ml karboplatin (karbo-300). Alle analyser ble utført i tre eksemplarer.
Videre, ved hjelp av de to effektive metoder validerte ovenfor, nivåene av den iboende DNA-skade ble bestemt i ubehandlede cellelinjer. Begge immunfluorescens γH2AX farging og alkalisk komet analyse viste signifikante forskjeller mellom de to cellelinjer, med den iboende DNA-skade blir høyere i A2780 enn i A2780 /C30-celler. Spesielt ved bruk av γH2AX immunfluorescens farging, A2780 celler viste 28,8 ± 3,4% positive celler (dvs. celler med mer enn 5 foci per celle) og A2780 /C30 17,4 ± 3,4% positive celler (
P
= 0,01; Tabell 2 ). Videre, ved hjelp av kometmetoden, A2780 celler viste OTM verdier på 33,9 ± 5,5 vilkårlige enheter, mens A2780 /C30 celler viste 14,4 ± 2,9 enheter (
P
0,001; tabell 2).
for å vise den DNA-reparasjon effektivitet i disse to cellelinjer ble cellene behandlet med carboplatin (0-300μg /ml) for 24 timer, etterfulgt av post-inkubasjon i stoff-fri medium for 0-24 og den induserte DNA-skader ( dvs. total DNA-skade normalisert ved den iboende DNA-skade) ble analysert ved slutten av medikamentbehandling. Begge immunfluorescens γH2AX farging og komet analyse viste signifikante forskjeller mellom de to cellelinjer. Det vil si, i begge cellelinjene DNA-skade nådd høyeste nivå ved slutten av medikamentbehandling, med DNA-skade blir betydelig høyere enn i i A2780 A2780 /C30-celler (data ikke vist). Deretter ble karboplatin-indusert DNA skade nivåer reduseres og omfanget av reparasjonen var betydelig lavere i A2780 enn i A2780 /C30 celler (
P
0,03). Spesielt brukte konfokalmikroskopi de γH2AX foci fjernes med t
1/2 = 5.2 ± 0,7 H i A2780 /C30 celler og 11,7 ± 2.6h i A2780 celler. Ved å bruke kometmetoden, t
1/2 verdier for karboplatin-indusert skade reparasjon i A2780 /C30 og A2780 celler var henholdsvis 9,9 ± 1.3h og 16,7 ± 3.4h,.
Dessuten er området under kurven (AUC) for karboplatin-indusert DNA-skade, er en parameter som gjenspeiler den totale DNA skade belastningen som følge av initial formasjonsskade og DNA-reparasjon ble beregnet (tabell 2). Ved å bruke γH2AX immunfluorescens farging, A2780 celler viste AUC-verdier [uttrykt som (% av γH2AX positiv farging celler) x (carboplatindosen)] fra 17200 ± 3650, og A2780 /C30 celler 12400 ± 2140 (
P
= 0,01). Videre bekreftet kometmetoden ovennevnte funn med A2780 celler viser AUC-verdier [uttrykt som (OTM x carboplatindosen)] fra 14900 ± 3280 mens A2780 /C30 celler viste AUC-verdier på 9400 ± 1150 (
P
= 0.01 ).
i tillegg ble begge celletyper behandlet med forskjellige doser av karboplatin (0-300μg /ml) i 24 timer og induksjon av apoptose ble målt 24 timer etter behandling. Vi fant at apoptose priser var høyere i A2780 celler enn i A2780 /C30 celler (
P
= 0,001; tabell 2). Spesielt A2780 celler som viste tegn på apoptose ved karboplatin doser så lave som 43,8 ± 5.6μg /ml, mens A2780 /C30-celler kreves en dose på 78,5 ± 9.2μg /ml, noe som indikerer at medikamentsensitivitet av celler omvendt korrelert med deres DNA reparasjon kapasitet (tabell 2).
en bemerkelsesverdig funn var at følgende carboplatin behandling, en brøkdel av celler viste diffus, lysende pan-atom γH2AX farging. Tidligere studier har vist at pan-nukleær farging γH2AX betegner en pre-apoptotiske signal forbundet med ATM- og JNK-avhengig apoptose i løpet av replikasjonen [31]. I tråd med resultatene fra DNA-reparasjon effektivitet eksperimenter, vi observerte høyere nivåer av pan-atom γH2AX flekker [uttrykt som AUC (% av pan-nukleære flekker celler) x (carboplatindosen)] i A2780 celler (13400 ± 2850) enn i A2780 /C30 celler (7500 ± 1760) (
P
= 0,001, Tabell 2).
Mangel DNA reparasjon av platina-indusert skade i PBMC av OC pasienter korrelerer med bedre klinisk resultat
Slå til PBMC, i overensstemmelse med tidligere studier [32], fant vi ut at etter behandling av ikke-dele PBMC med platina narkotika, svært lav eller null induksjons priser av de viktigste molekylene i henhold til studien ble observert. Derfor vi først behandlet PBMC fra ni friske frivillige med forskjellige doser av PHA i opp til 72 timer for å indusere proliferasjon av cellene. Optimale resultater ble oppnådd etter 48 timer inkubasjon av PBMC med 10 ug /ml PHA (data ikke vist). Deretter PBMC ble behandlet med cisplatin (0-300μg /ml for inntil 3 h) etterfulgt av inkubasjon i stoff-fri medium for 0-24 eller med carboplatin (0-1800μg /ml i opptil 24 timer), etterfulgt av post-inkubasjon i stoff-fri medium for 0-24. I henhold til resultatene fra cellelinjer eksperimentene, ved en av de platina legemidler, ble en dose-avhengig induksjon av alle viktige molekyler observert (fig. 3A, C), med den γH2AX igjen viser de høyeste induksjonsfrekvenser (fig. 3B , D). Dessuten, ble nivåene av platina-indusert DNA-skade i PBMC fra de samme ni friske frivillige målt ved anvendelse av alkalisk komet analysen. Vi fant også at
ex vivo
behandling av PBMC med cisplatin (Fig. 3E) eller karboplatin (Fig. 3F) viste en doseavhengig økning av DNA skade nivåer. Til sammen resultatene fra begge cellelinjer og PBMC eksperimenter tyder på at immunfluorescens kvantifisering av γH2AX foci og alkalisk kometmetoden er to effektive metoder for kvantifisering av platina-indusert DNA-skader i kliniske prøver.
PBMC fra ni sunt frivillige var
ex vivo
behandlet (A) med cisplatin (0-300μg /ml) i 3 timer eller (B) med 150μg /ml cisplatin, deretter inkubert i stoff-fri medium for ulike tidsperioder (0- 24), og analysert deretter bruker konfokalmikroskopi. Også PBMC fra de samme friske frivillige ble behandlet (C) med karboplatin (0-1800μg /ml) i 24 timer, eller (D) med 1400μg /ml karboplatin i forskjellige tidsrom (0-24) og analysert ved slutten av behandlingen ved hjelp konfokalmikroskopi. Feilstolpene representerer standardavvik. Til slutt, PBMC ble behandlet med (E) cisplatin (0-150μg /ml) i 3 timer, eller (F), karboplatin (0-1800μg /ml) i 24 timer og analyseres deretter ved hjelp av komet analysen. Boks plott viser statistisk fordeling av nivåene av DNA-skade. De horisontale linjer i boksene representerer medianverdier og de vertikale linjer som strekker seg over og under boksen viser maksimums- og minimumsverdier, henholdsvis. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer.
Deretter bruker disse analysene vi undersøkt de reelle nivåer av DNA-skader i ubehandlede PBMC fra de tre grupper av individer (friske frivillige, pasienter som er sensitive og pasienter som er resistente mot platina kjemoterapi ). Både γH2AX immunfluorescens farging og kometmetoden viste signifikante forskjeller mellom de tre gruppene av individer (alle
P
0,05; Tabell 3), med den iboende DNA skader er høyere i OC pasienter enn hos friske frivillige. Interessant, i tråd med resultatene fra ovarian carcinoma cellelinjer eksperimenter, høyere nivåer av indre DNA-skade ble observert i PBMC fra pasienter som er følsomme i forhold til de motstandsdyktig mot påfølgende platina kjemoterapi (γH2AX,
P
= 0,05; komet analysen,
P
= 0,003, Tabell 3; fig 4A-D).. Spesielt, ved bruk av γH2AX immunfluorescens farging, platina-sensitive pasienter viste 16,8 ± 2,3% positive celler, platina-resistente pasienter 8,9 ± 2,4%, mens friske frivillige viste 3,9 ± 1,2% positive celler (tabell 3, Fig. 4A). Ved å bruke komet assay pasienter følsomme for platina kjemoterapi viste OTM verdier på 20,1 ± 5,5 vilkårlige enheter, platinaresistent 7,8 ± 2,5, mens friske frivillige viste 2,4 ± 1,1 enheter (Tabell 3 Fig. 4C). Interessant, for å bekrefte at forskjellene i DDR-signalene er virkelig representative for platina følsomhet snarere enn tumortype, ble pasientene som bærer den samme histotype delt inn følsomme og resistente overfor platina terapi og den iboende DNA-skadenivåer ble sammenlignet. Selv om hver undergruppe inneholder et lite antall prøver, viste resultatene at forskjeller i de iboende DNA skadenivåer er reflektert av platina følsomhet. For eksempel, i serøse tumorer bare, ved hjelp av γH2AX farging, sensitive pasienter (
n
= 6) viste høyere iboende DNA-skade (middelverdi, 16,6% positive celler; rekkevidde, 13,1 til 23,2%) enn motstandsdyktig pasient (
n
= 1; 7,5%). I tillegg, i klart celle eggstokkreft bare, følsom pasient (
n
= 1) viste 18,5% positive celler, mens resistente pasienter (
n
= 3) bare 9,4% (range, 6.3 -13,7%). Lignende resultater ble oppnådd ved bruk av komet assay.
(A) Boks plott som viser statistisk fordeling av innholdet av den indre DNA-skade hos ubehandlede PBMC ved hjelp av immunfluorescens kvantifisering av γH2AX. HV, friske frivillige; Sens: OC pasienter følsomme for påfølgende platina terapi; Res: OC pasienter som er resistente mot påfølgende platina terapi. (B) Typiske bilder fra konfokal laser scanning mikroskop analyse av PBMC fra de tre gruppene; øvre bilder, γH2AX flekker; bunn bilder, cellekjerner merket med DAPI. (C) Boksplott som viser statistisk fordeling av nivåene av den iboende DNA skader i ubehandlede PBMC bruker alkalisk kometmetoden. (D) Typiske komet bilder fra ubehandlede PBMC av de tre grupper av individer. Boksplott som viser statistisk fordeling av nivåene av DNA-skader i PBMC stimulert til spredning ved hjelp av PHA og behandlet med carboplatin (0-1800μg /ml) for 24 timer, bruker (e) immunfluorescens kvantifisering av γH2AX og (F) alkalisk kometmetoden. De horisontale linjer i boksene representerer medianverdier og de vertikale linjer som strekker seg over og under boksen viser maksimums- og minimumsverdier, henholdsvis. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer.
For å undersøke DNA-reparasjon effektiviteten i de tre grupper av enkeltpersoner, etter 48t inkubasjon av PBMC med 10 ug /ml PHA ble cellene behandlet med carboplatin (0 -1800μg /ml) for 24 timer, post-inkubert i stoff-fri medium for 0-24 og den induserte DNA-skade ble analysert. Både γH2AX immunfluorescens farging og kometmetoden viste lignende resultater. Det vil si, i alle personer analysert DNA-skade nådd høyeste nivå ved slutten av medikamentbehandling, med DNA-skade å være høyere hos pasienter OC enn hos friske frivillige; platina-sensitive pasienter viste høyere nivåer av DNA-skade enn platinaresistent de (data ikke vist). Deretter ble DNA-skade nivåer elimineres og utstrekningen av reparasjons var høyere hos friske frivillige enn i pasienter. Interessant, i tråd med resultatene fra cellelinjer eksperimenter, platina-sensitive pasientene viste betydelig lavere reparasjon effektivitet enn platina-resistente de (
P
0,03). Spesielt brukte konfokalmikroskopi de γH2AX foci fjernes med t
1/2 = 2,7 ± 0,5 timer hos friske kontroller, 8,8 ± 1,9 H i platina-motstandsdyktig og 15,4 ± 3,2H i platina-sensitive pasienter.
