Abstract
Transforming growth factor-SS1 (TGF-β1) er et multifunksjonelt cytokin som er involvert i ulike patofysiologiske prosesser, inkludert kreft progresjon og fibrotiske lidelser. Her viser vi at behandling med TGF-β1 (5 ng /ml) indusert nedregulering av syklooksygenase-2 (COX-2), som fører til redusert syntesen av prostaglandin E2 (PGE2), i humane lungekreft A549-celler. Behandling av celler med spesifikke inhibitorer av COX-2 eller PGE2-reseptoren resulterte i vekstinhibering, noe som indikerer at COX-2 /PGE 2 pathway bidrar til spredning på en autokrin måte. TGF-β1 behandling indusert veksthemming, som ble dempet med eksogent PGE2. TGF-β1 er også en potent induser av epitelial mesenchymale overgang (EMT), en fenotype endring i hvilket epitelceller differensierer til fibroblastoid celler. Tilskudd med PGE2 eller PGE2-reseptoren EP4 agonist PGE1-alkohol, sammenlignet med EP1 /3 agonist sulproston, inhiberte TGF-β1-indusert ekspresjon av fibronectin og collagen I (ekstracellulære matriks-komponenter). Eksogent PGE2 eller PGE2-reseptoragonister trykkes også actin remodellering indusert ved TGF-β1. Disse resultatene tyder på at PGE2 har en anti-fibrotisk virkning. Vi konkluderer med at TGF-β1-indusert nedregulering av COX-2 /PGE2 signalering er involvert i tilrettelegging av fibrotisk EMT respons i A549 celler
Citation. Takai E, Tsukimoto M, Kojima S (2013) TGF-β1 nedregulerer COX-2 uttrykk som fører til nedgang på PGE2 Produksjonen i human Lung Cancer A549-celler, som er involvert i Fibrotiske Response til TGF-β1. PLoS ONE 8 (10): e76346. doi: 10,1371 /journal.pone.0076346
Redaktør: Ruby John Anto, Rajiv Gandhi Senter for Bioteknologi, India
mottatt: May 23, 2013; Godkjent: 23 august 2013; Publisert: 02.10.2013
Copyright: © 2013 Takai et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Transforming growth factor-SS1 (TGF-β1) ble opprinnelig oppdaget som et utskilt protein som induserer utviklingen og veksten av normale fibroblaster [1], og det er nå godt etablert til å være involvert i forskjellige fibrotiske lidelser, så som pulmonær og hepatisk fibrose [2-4]. Faktisk, er TGF-β1 et multifunksjonelt cytokin som regulerer forskjellige fysiologiske prosesser, inkludert cellevekst, differensiering og tumorigenesis. Det utskilles i kreft microenvironments fra mange kreftceller og fungerer som en svulst promoter ved å indusere angiogenese, immun-flukt og metastase [5-7]. Lungefibrose, så som idiopatisk pulmonal fibrose (IPF), er godt kjent for å være assosiert med økt risiko for lungekreft. På den annen side er det også blitt foreslått at fibrose i lungetumor er et sekundært fenomen i stedet for et forstadium for kreft, og det ble demonstrert at graden av fibrose er korrelert med kreft progresjon og prognose [8,9]. Imidlertid er mekanismene for utvikling av fibrose i lungetumor ikke godt forstått.
I epitelceller, TGF-β1 induserer en fenotype endring kalt epiteliale mesenkymale overgang (EMT), som er den prosessen som epitelceller differensiere inn i fibroblast-lignende mesenchymale celler. EMT er en normal fysiologisk prosess avgjørende for riktig embryogenese og vev morfogenese. På den annen side er EMT også involvert i sårhelbredelse og progresjon av kreft hos voksne vev [10,11]. Selv om et bidrag av EMT-avledet fibroblast-lignende celler til fibrose har blitt foreslått [12,13], signalerings mekanismene bak TGF-β1-induserte biologiske aktiviteter i kreftceller er ikke fullt ut forstått.
Cyclooxygenase (COX ) er det hastighetsbegrensende enzym i prostanoid syntese. Mens COX-1 blir konstitutivt uttrykt, COX-2 er induserbar, og er godt kjent for å være involvert i inflammasjon. Ekspresjon av COX-2 er forhøyet i mange tumor vev, inkludert lungekreft [14,15]. Prostaglandin E2 (PGE2), som er den dominerende prostaglandin, utøver sine biologiske virkninger via G protein-koblede reseptorer (dvs. EP1-EP4) [16]. Det har blitt rapportert at PGE2 er involvert i tumorvekst, immunsuppresjon, eller angiogenese [17-20]. Det har også blitt rapportert at COX-2 er overuttrykt i mange lungekreft, og PGE2 er involvert i proliferasjon, resistens mot apoptose og induksjon av T-regulerende celler [21-24]. I ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), overekspresjon eller aktiverende mutasjon av epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) fører til avvikende proliferasjon eller migrasjon. Derfor er EGFR etablert som en molekylær markør for NSCLC, og er mye brukt for prediksjon av prognose eller for behandling valg. COX-2, så vel som EGFR, er en mulig molekylær markør for NSCLC [14].
Vi har nylig rapportert at behandling av humane NSCLC-A549-celler med TGF-β1 induserer EMT som fører til forbedring av cellemigrering [ ,,,0],25]. I den foreliggende undersøkelse, for å avsløre mekanismen for TGF-β1-indusert lungecancer progresjon, undersøkte vi effekten av TGF-β1 på ekspresjon av COX-2 i A549-celler. Tidligere er det blitt rapportert at TGF-β1 induserer COX-2 ekspresjon i løpet av EMT i mammary epitelceller [26]. I motsetning til hva tilfellet er i mammary epitelceller, har vi funnet for første gang at TGF-β1 nedregulerer COX-2 i humane NSCLC-A549-celler. Vi viser her at denne effekten er relatert til veksthemming og tilrettelegging av fibrotisk EMT reaksjon, noe som tyder på at COX-2 /PGE2 signalering er viktig for kontroll av cellulære prosesser i A549-celler.
Materialer og Metoder
Reagenser og antistoffer
DMEM, humant rekombinant TGF-β1, SB431542, cycloheximide og metylacetat ble kjøpt fra Wako Pure Chemical (Osaka, Japan). FBS ble kjøpt fra BioWest (Nuaille, Frankrike). AH6809, L798106, L161982, ble sulproston, butaprost og PGE1-alkohol kjøpt fra Cayman Chemical (Ann Arbor, Michigan, USA). Prostaglandin E2, actinomycin D og anti-N-cadherin antistoff ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). Spesifikk hemmer av Smad3 (SIS3) og NS-398 ble kjøpt fra Merck (Darmstadt, Tyskland). Rhodamine phalloidin ble kjøpt fra Cytoskjelett, Inc. (Denver, CO, USA). Kanin polyklonale anti-COX-2 antistoff ble kjøpt fra Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA). Kanin polyklonale anti-høy mobilitet gruppeboksen 1 (HMGB1) antistoff ble kjøpt fra Abcam (Cambridge, UK). Kanin polyklonalt anti-COX-1-antistoff og monoklonalt muse anti-actin-antistoff ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA). Mus monoklonalt anti-E-cadherin antistoff (Klon 36B5) ble kjøpt fra Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Mus monoklonalt anti-fibronektin antistoff ble kjøpt fra BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA).
Cell kultur
A549 humane adenokarcinomceller ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Celler ble dyrket i DMEM supplementert med 10% føtalt bovint serum, penicillin (100 enheter /ml) og streptomycin (100 mg /ml) i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 i luft ved 37 ° C.
Immunoblotting
Cellene ble lysert i PBS inneholdende 10 mM HEPES-NaOH, pH 7,4, 1% Triton X100, 5 mM EDTA, 30 mM natriumpyrofosfat, 50 mM natriumfluorid, 1 mM natriumortovanadat, 1,04 mM 4- (2-aminoetyl) benzensulfonyl fluorid, 0,8 uM aprotinin, 21 uM leupeptin, 36 uM bestatin, 15 uM pepstatin A og 14 pM E-64, ved 4 ° C i 30 min. Lysatene ble sentrifugert ved 10.000 x g i 15 min. Etter fjerning av cellerester, ble proteininnholdet i hver prøve ble bestemt ved bruk av Bio-Rad Protein Assay kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Like mengder av protein lysatet ble løst opp i 2 x prøvebuffer (50% glycerol, 2% SDS, 125 mM Tris, 10 mM DTT) og kokt i 10 min. Porsjoner av prøver inneholdende 6 ug protein ble analysert ved hjelp av 7,5 til 15% SDS-PAGE og båndene ble overført på en PVDF-membran. Blottene ble blokkert over natten i TBST med 1% BSA, 5% skummet melk ved 4 ° C, og deretter inkubert med kanin COX-2-antistoff (1: 1000), kanin COX-1-antistoff (1: 1000), kanin HMGB1 antistoff ( 1: 1000), mus aktin-antistoff (1: 1000), mus E-cadherin antistoff (1: 1000), mus N-cadherin antistoff (1: 1000) eller mus fibronektin-antistoff (1: 1000) over natt ved 4 ° C. Etter å ha blitt vasket med TBST, ble blottene inkubert med geite-HRP-konjugert anti-kanin-IgG-antistoff (Cell Signaling Technology, Inc.) eller geite-anti-muse-IgG-antistoff-HRP (Santa Cruz Biotechnology) i 90 minutter ved romtemperatur. Blottene ble igjen vasket med TBST, og spesifikke proteiner ble visualisert ved hjelp av ECL Western blotting gjenkjenning reagenser (GE Healthcare) i henhold til produsentens instruksjoner. Bandet intensiteter ble kvantifisert ved densitometrisk analyse ved hjelp ImageJ programvare (National Institutes of Health).
PGE2 EIA
PGE2 produksjon fra celler ble bestemt med et enzym immunoassay (EIA) kit (Cayman Chemical) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble PGE2-acetylcholinesterase-konjugat, muse-monoklonalt anti-PGE2-antistoff, og enten standard eller prøve ble tilsatt til hver brønn av en EIA-plate belagt med geit polyklonale anti-mus IgG. Etter inkubering i 18 timer ved 4 ° C ble platen vasket fem ganger for å fjerne alle ubundne reagenser. Ellmans reagens ble deretter tilsatt til hver brønn, og den utviklede platen ble avlest ved 405 nm med en Wallac ARVO SX multilabel teller (PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA).
Sanntids RT-PCR
Total RNA ble isolert fra A549 celler ved hjelp av en rask Pure RNA kit (Takara Bio). Den første tråd cDNA ble syntetisert fra total RNA med PrimeScript revers transkriptase (Takara Bio). CDNA ble brukt som en mal for real-time PCR-analyse: reaksjoner ble utført i en Stratagene Mx3000P
® QPCR system (Agilent Technologies, La Jolla, CA, USA). Sekvensene til primerne spesifikke for human COX-2 ble 5′-GAGAAAACTGCTCAACACCGGA-3 «(sense) og 5′-CACAACGTTCCAAAATCCCTTG-3′ (antisense), de for human COL1A1 var 5»-CACACGTCTCGGTCATGGTA-3 «(sense) og 5 «- AAGAGGAAGGCCAAGTCGAG-3» (antisens). Glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) mRNA ble bestemt som en positiv kontroll. Hver prøve ble analysert i en 20 ul reaksjonsblanding inneholdende forsterkning cDNA, primere (5 pM av hver av sense- og antisense-primere) og 2x KAPA SYBR
® FAST qPCR Master Mix (KAPA Biosystems, Woburn, MA, USA). Forsterkningen Programmet omfattet 40 sykluser av 95 ° C i 3 sekunder og 60 ° C i 30 sek. Fluorescerende produkter ble detektert ved det siste trinn i hver syklus. De oppnådde verdier var innenfor det lineære området av standardkurven og ble normalisert til GAPDH-mRNA-ekspresjon.
cellesyklusanalyse
cellesyklusen ble analysert med propidiumjodid (PI) farging. A549-celler ble trypsinert og fiksert med 70% etanol i 60 minutter på is. RNA ble fjernet ved behandling med RNase A (0,34 mg /ml), deretter ble cellene inkubert med 50 mg /ml PI i 30 min på is. Fargede celler ble analysert ved hjelp av en FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), og ti tusen celler ble vurdert. DNA-profilen er angitt den relative overflod av cellepopulasjonen i G0 /G1, S og G2 /M-fasene. Prosentene av celler i hver fase av cellesyklusen ble bestemt ved statistisk analyse ved hjelp av Cell quest software (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).
spredningsanalyse
celleproliferasjon analyser var utføres ved hjelp av bromdeoksyuridin (BrdU) (kolorimetrisk) celleproliferasjon ELISA (Roche, Mannheim, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Kort sagt ble A549-celler sådd ut i 96-brønners plater og behandlet med bærer eller reagenser i et sluttvolum på 100 pl /brønn. Deretter ble 10 ul av BrdU-merking-løsning tilsatt til hver brønn, og inkuberingen ble fortsatt i 2 timer. Etter fjerning av BrdU-merkingen løsning ble cellene tørket og inkubert med settets FixDenat-løsning i 30 minutter ved romtemperatur. Etter denaturering av DNA, ble prøvene inkubert med peroksydase-konjugert anti-BrdU-antistoff i 90 min. Ubundet antistoff ble vasket av, og 100 ul av den luminescens substratet ble tilsatt. Den luminescens ble kvantifisert ved hjelp av en Wallac ARVO SX multilabel teller.
Celleproliferering ble også analysert ved å telle celler. A549-celler ble sådd ut i 24-brønners plater og behandlet med TGF-β1 og PGE2. Etter inkubering ble cellene trypsinert og telt ved bruk av en TC10
TM Automatisert celleteller (Bio-Rad Laboratories).
Fluorescens avbildning
For F-aktin-farging ble cellene fiksert med 4 % paraformaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur, og permeabilisert med 0,5% Triton X-100 i 5 min på is. Fikserte celler ble inkubert med 100 nM rhodamin phalloidin i 30 minutter ved romtemperatur. Kontra med Hoechst 33258 (10 ug /ml) ble anvendt for å bekrefte plasseringen og integriteten av kjernene. Fargede celler ble analysert ved hjelp av en konfokal laser scanning mikroskop (TCS SP2, Leica, Mannheim, Tyskland) er utstyrt med en HCX PLApo 63 x 1,32 NA olje objektiv. Leica konfokal programvare (TCS SP2, versjon 2.6.1) ble brukt for bildeopptak og prosessering.
Cell migrasjon analysen
Cell migrasjon ble analysert ved hjelp av 24-brønnen Transwell plater (6,5 mm diameter ; 8 um porestørrelse polykarbonat membran, Corning, Lowell, MA, USA). Det øvre kammeret ble podet med A549-celler (2 x 10
4 celler) i basaldyrkningsmedium. Etter 24 timer ble mediet erstattet med friskt medium inneholdende TGF-β1. Det øvre kammer inneholdt 5% FBS i stedet for 10%. Etter inkubering i ytterligere 24 timer ble cellene fiksert med 4% paraformaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur, og inkubert med 50 ug /ml PI i 30 minutter ved romtemperatur. Ikke-migrerte celler på den øvre overflaten av membranen ble fjernet og cellene som hadde migrert gjennom membranen til den nedre overflate ble talt ved hjelp av et fluorescens mikroskop (BZ-9000; KEYENCE).
statistikker
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SE. Den statistiske signifikans av forskjeller mellom kontroll og andre grupper ble beregnet ved å bruke Dunnetts test eller uparet t-test med INSTAT versjon 3.0 statistikkpakke (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Kriteriet for signifikans ble satt til P 0,05.
Resultatene
TGF-β1 nedregulerer COX-2 ekspresjon og PGE2 produksjon i A549-celler
I mange typer kreft, TGF-β1 blir utskilt inn i svulsten mikromiljøet og fungerer som en svulst promoter. For å undersøke TGF-β1-indusert progresjon av human lungekreft, stimulerte vi humane lungekreft A549 celler med TGF-β1. COX-2 er konstitutivt uttrykt i A549 cellene under standard celledyrkningsforhold. Overraskende fant vi at ekspresjon av COX-2-proteinet ble dramatisk redusert ved behandling med 5 ng /ml TGF-β1 (figur 1A). Reduksjonen av COX-2-protein ved 24 timer etter stimuleringen var TGF-β1 doseavhengig (figur 1B). På den annen side, ekspresjon av COX-1 i A549-celler var lav, og ble ikke forandret av TGF-β1 behandling (figur 1 A, B). TGF-β1 aktiverer TGF-p-serin /treonin-kinase-reseptorer. Etter ligand bindings, TGF-β type I-reseptor (TßRI) og type II reseptor (TßRII) danner en tetramer reseptor hetero som fører til fosforylering av Smad proteiner, de viktigste nedstrøms effektor molekyler for disse reseptorene, av kinase-aktiviteter av cytoplasmisk domene TßRI. Behandling med TßRI inhibitor SB431542 eller Smad3 inhibitor SIS3 [27] blokkert COX-2 nedregulering av TGF-β1 (figur 1C). Resultatene tyder på at TGF-β1-indusert nedregulering av COX-2 er assosiert med aktivering av TGF-p-reseptorer og Smad signalveien.
(A) Ekspresjon av COX-2-proteinet ble påvist ved immunblotting som beskrevet i materialer og metoder. Behandling med TGF-β1 (5 ng /ml) undertrykket ekspresjon av COX-2, men ikke COX-1 i A549-celler. HMGB1 ble målt som en lasting kontroll. (B) Doseavhengig nedregulering av COX-2 av TGF-β1. Tjuefire timer etter TGF-β1 stimulering (1-10 ng /ml), ekspresjon av COX-2 og COX-1 ble detektert. (C) SB431542 (10 uM) eller SIS3 (30 uM) blokkerte TGF-β1-indusert COX-2-nedregulering. Celler ble forbehandlet i 60 minutter med inhibitor, og deretter inkubert med eller uten TGF-β1 (5 ng /ml) i 24 timer. (D) TGF-β1 trykkes COX-2-produksjon i A549-celler. -Celler ble behandlet med TGF-β1 (1-10 ng /ml) eller NS-398 (50 uM) i 24 timer, deretter ble konsentrasjonen av PGE2 i kulturmediet ble målt ved EIA som beskrevet i Materialer og Metoder. Hver verdi representerer gjennomsnitt ± SE (n = 4). Signifikante forskjeller mellom de angitte grupper og kontrollgruppen indikeres med ** (P 0,01).
COX enzymer konvertere arakidonsyre til prostaglandin H2, som er videre bearbeidet til ulike prostaglandiner, inkludert PGE2 , den dominerende prostaglandin i lungene [28,29]. For å evaluere PGE2 produksjon i A549-celler, målte vi den ekstracellulære konsentrasjon av PGE2 i kulturmedium ved bruk av enzymimmunoanalyse. Som vist i figur 1D, ble ekstracellulær konsentrasjon av PGE2 ble redusert ved behandling med TGF-β1 i 24 timer. En selektiv inhibitor av COX-2, NS-398, fullstendig eliminert PGE2 fra kulturmediet, noe som indikerer at produksjonen av PGE2 i A549-celler i hovedsak avhenger av funksjonen av COX-2. Disse resultater viser at TGF-β1 stimulering sterkt undertrykker ekspresjon av COX-2 og resulterer i en reduksjon av PGE2 produksjon i A549-celler.
Suppresjon av COX-2 ekspresjon av TGF-β1 medieres av transkripsjonen undertrykkelse
ved siden undersøkte mekanismen for TGF-β1-indusert COX-2 nedregulering i A549-celler. COX-2 protein uttrykk kan bli påvirket av protein degradering, endret mRNA stabilitet og endret transkripsjon rate. Ved hjelp av sanntids-RT-PCR-analyse, undersøkte vi ekspresjon av COX-2-mRNA ved TGF-β1 behandling fra 0,5 til 3 timer. Som vist i figur 2A, er COX-2-mRNA ble redusert raskt, og nådde omtrent 50% av kontrollen innen 30 min etter stimulering. Dette resultatet indikerer at reduksjonen av COX-2-protein etter TGF-β1 stimulering er hovedsakelig et resultat av en reduksjon av COX-2-mRNA. For å undersøke hvorvidt TGF-β1 påvirker COX-2-mRNA-stabilitet, ble celler forbehandlet med den transkripsjonelle inhibitor actinomycin D før TGF-β1 stimulering. Deretter ble COX-2-mRNA-nivå undersøkt ved hjelp av sanntids-RT-PCR. Kontrollceller behandlet med actinomycin D alene viste en signifikant reduksjon i COX-2-mRNA. Behandling med TGF-β1 påvirket ikke COX-2 mRNA stabilitet, som nedbrytningshastigheten var identisk med det som ble observert i kontrollceller (figur 2B). Videre undersøkte vi COX-2 proteinstabilitet ved hjelp av proteinsynteseinhibitor cykloheksimid (CHX). Celler ble behandlet med CHX eller CHX pluss TGF-β1, og deretter COX-2-protein-nivå, ble undersøkt ved immunblotting. Som vist i figur 2C, er COX-2-protein ble redusert i kontrollceller behandlet med CHX alene og TGF-β1 påvirket ikke COX-2 proteinstabilitet. Disse resultatene tyder på at TGF-β1 ikke påvirker COX-2-protein og mRNA degradering stabilitet, men snarere virker på transkripsjonsnivået.
(A) tidsavhengig reduksjon av COX-2-mRNA-ekspresjon ved behandling med TGF -β1 (5 ng /ml). COX-2-mRNA-nivået ble målt ved hjelp av sanntids-RT-PCR, som beskrevet i Materialer og Metoder. (B) Celler ble forbehandlet med actinomycin D (5 ug /ml) i 1 time og inkubert med eller uten TGF-β1 (5 ng /ml) i de angitte tidsrom. TGF-β1 påvirke ikke reduksjonen av COX-2-mRNA ved hjelp av actinomycin D. COX-2-ekspresjonsnivåer ble normalisert til GAPDH ekspresjonsnivåer og uttrykt som en prosentandel av den i ikke-behandlede celler (kontroll). Hver verdi representerer gjennomsnitt ± SE (n = 3). (C) Cellene ble inkubert med CHX (50 ug /ml) eller CHX pluss TGF-β1 (5 ng /ml) i de angitte tidsrom og COX-2 protein-ekspresjon ble påvist ved immunblotting. TGF-β1 påvirke ikke reduksjonen av COX-2-protein ved CHX. Bånd intensiteter ble kvantifisert og COX-2 /aktin-verdier ble uttrykt som relativ til de av kontrollen. Hver verdi representerer middelverdien ± SE (n = 4).
nedregulering av COX-2 er knyttet til TGF-β1-indusert veksthemming av A549 celler
For å klargjøre betydningen av TGF-β1-indusert COX-2 nedregulering, vi neste undersøkt hvilke roller COX-2 PGE2 og spille i de biologiske funksjonene til A549-celler. PGE2 aktiverer EP-reseptorer, som er klassifisert i 4 undergrupper; GQ protein-koblet EP1, Gi protein-koblet EP3, Gs protein-koblet EP2 og EP4. Disse EP-reseptorer har blitt implisert i proliferasjonen av forskjellige kreftceller [22,30-32]. Det ble også foreslått at PGE2 og EP-reseptorer er involvert i proliferasjon av NSCLC-celler [33]. Vi undersøkte involvering av COX-2 /PGE2 i cellesyklusen til A549-celler. Behandling med COX-2-inhibitor NS-398 i 3 dager resulterte i en reduksjon av S-fase og en økning av G0 /G1 fase (figur 3A). Som vist i figur 3B, EP1 /2-antagonist AH6809, EP3 antagonister L798106 eller EP4 antagonist L161982 også betydelig redusert forholdet mellom S-faseceller. Vi videre undersøkt celleproliferasjon ved hjelp BrdU analysen; inkorporering av BrdU indikerer DNA-syntese under celledeling. Behandling med disse EP-antagonister trykt BrdU innlemmelse i A549 celler (Figur 3C). Vi har også analysert ekspresjonen av EP-reseptorer i A549-celler ved RT-PCR, og bekreftet ekspresjon av alle 4 reseptor-subtyper (data ikke vist). Disse resultater indikerer at konstitutiv produksjon av PGE2, i det minste i en viss grad bidrar til spredning av A549-celler via EP-reseptorer under standard dyrkningsbetingelser.
(A) A549 celler ble inkubert med NS-398 (50 uM) i 3 dager og cellesyklus ble analysert som beskrevet i Materialer og Metoder. Behandling med NS-398 reduserte forholdet mellom S-faseceller. Hver verdi representerer gjennomsnitt ± SE (n = 3). (B) Celler ble behandlet med AH6809 (30 uM), L798106 (30 uM) eller L161982 (30 uM) i 3 dager, deretter cellesyklusen ble analysert, og andelen av S-fasen ble beregnet. Hver verdi representerer gjennomsnitt ± SE (n = 5-7) (C) Behandling med AH6809 (30 uM), L798106 (30 uM) eller L161982 (30 uM) i 3 dager undertrykte proliferasjonen av A549-celler. Celleformering ble undersøkt av BrdU-analyse som beskrevet i Materialer og Metoder. BrdU-inkorporering nivåer ble uttrykt i forhold til den i ikke-behandlede celler (kontroll). Hver verdi representerer gjennomsnitt ± SE (n = 6). Signifikante forskjeller mellom de angitte grupper og kontrollgruppe er angitt med * (P 0,05) og ** (P 0,01)
Derfor TGF-β1-indusert nedregulering av COX-2. kunne påvirke formering av A549-celler. Stimulering med TGF-β1 også redusert i S-fasen og øket G0 /G1 fase av A549-celler (figur 4A). Denne cellesyklus-stans ble observert fra 3 dager etter behandling, når A549 celler som kan uttrykke mindre COX-2. Faktisk, TGF-β1-indusert reduksjon i S-faseceller hadde en tendens til å bli opphevet av eksogent PGE2 i en doseavhengig måte (figur 4B). For ytterligere å undersøke effekten av TGF-β1 på proliferasjonen av A549-celler, målte vi celleproliferasjon ved hjelp av BrdU analysen. Vi har bekreftet at BrdU-inkorporering ble redusert med TGF-β1 stimulering i 3 dager, og dette TGF-β1-indusert undertrykkelse av BrdU-inkorporering ble delvis svekket i nærvær av PGE2 (figur 4C). Vi har også funnet at TGF-β1 ikke påvirker ekspresjonen mønster av EP-reseptor-subtyper i A549-celler (data ikke vist). Disse resultatene støtter teorien om at TGF-β1-indusert COX-2 nedregulering er forbundet med undertrykkelse av formering av A549-celler. Faktisk ble celletallet i prøvene som er behandlet med TGF-β1 i 3 dager redusert, sammenlignet med tilfellet med ikke-behandlede celler, og tilsetning av PGE2 øket celletallet av TGF-β1-behandlede celler (Figur 4D). Således våre resultater tyder på at TGF-β1-indusert veksthemming av A549 celler er delvis mediert ved nedregulering av COX-2. Siden cellevekstarrest ved G0 /1 fase er essensielt for celledifferensiering, kan TGF-β1-indusert veksthemming av A549-celler være forbundet med EMT indusert av TGF-β1 i A549-celler.
(A) A549 cellene ble behandlet med TGF-β1 (5 ng /ml) i de angitte tidsrom og cellesyklusen ble analysert. Behandling med TGF-β1 minsket forholdet av S-faseceller. (B-D) Tjuefire timer etter inkubering med og uten TGF-β1 (5 ng /ml), ble celler supplert med PGE2 (10, 25 uM) og videre inkubert i 2 dager. Proliferasjon ble undersøkt ved cellesyklusanalyse (B), BrdU assay (C) og celle-telling (D) som beskrevet i Materialer og Metoder. PGE2 avskaffet TGF-β1-indusert veksthemming. Hver verdi representerer gjennomsnitt ± SE (n = 3-5). Signifikante forskjeller mellom de angitte grupper og kontrollgruppe er angitt med * (P 0,05) og ** (P 0,01)
nedregulering av COX-2 akselererer TGF-β1-indusert fibrotisk. EMT reaksjon
TGF-β1 er godt kjent for å være en potent induser av EMT, som er en fenotype endring som omfatter differensiering av epitelceller i fibroblastoid-lignende celler. I prosessen med EMT, epiteliale markørproteiner, så som E-cadherin, går tapt og mesenkymale proteiner, inkludert N-cadherin og fibronektin, blir oppregulert. Vi bekreftet reduksjon av E-cadherin og økning av N-cadherin ved 48 timer etter TGF-β1 stimulering. På samme tid, ble ekspresjon av fibronektin forhøyet (figur 5A). For å undersøke involvering av COX-2 downregulation i disse TGF-P1-indusert EMT responser ble cellene costimulated med TGF-β1 og PGE2. Som vist i figur 5B, PGE2 (25 uM) påvirket ikke tapet av E-cadherin og oppregulering av N-cadherin indusert av TGF-β1. På den annen side ble den TGF-β1-indusert oppregulering av fibronektin markert inhibert av eksogent PGE2. PGE2 trykkes TGF-β1-indusert ekspresjon fibronektin ved doser så lave som 5-10 uM (figur 5C). Deretter undersøkte vi også effekten av EP-reseptoragonister på fibronektin uttrykk. Behandling med EP2-reseptor-agonist eller butaprost EP4 reseptor agonist PGE1-OH hemmet økning av fibronektin indusert av TGF-β1, mens EP1 /3-reseptor-agonist sulproston ikke hadde noen effekt (figur 5D). Disse resultatene tyder på at EP2 og EP4-reseptorer medierer den undertrykkende virkning av PGE2 på TGF-β1-indusert ekspresjon fibronektin.
(A) A549-celler ble behandlet med TGF-β1 (5 ng /ml) i de angitte tidsrom og ekspresjon av E-cadherin, N-cadherin og fibronektin ble påvist ved immunblotting. (B) Førtiåtte timer etter inkubering med TGF-β1 (5 ng /ml) og PGE2 (25 uM), ekspresjon av E-cadherin, N-cadherin og fibronektin evaluert. (C) Cellene ble inkubert med TGF-β1 (5 ng /ml) og PGE2 (5-25 uM) i 48 timer og ekspresjon av fibronektin ble undersøkt. PGE2 trykkes fibronektin induksjon av TGF-β1. (D) Celler ble behandlet med TGF-β1 (5 ng /ml) og kjøretøy (metylacetat), sulproston, butaprost eller PGE1-OH (20 uM) i 48 t og ekspresjon av fibronektin ble evaluert. Behandling med butaprost eller PGE1-OH inhiberte TGF-β1-induserte økningen av fibronektin uttrykk. HMGB1 ble oppdaget som en lasting kontroll. Båndintensitetene ble kvantifisert ved densitometri og uttrykt som i forhold til de av hver kontroll.
Fibronektin er en komponent av ECM og endres fibronectin ekspresjon er assosiert med fibrotiske forstyrrelser. Vi har videre undersøkt om TGF-β1 induserer ekspresjon av kollagen I, som er en viktig komponent i ECM fibrøse vev [34-36]. Den COL1A1 (som koder for kollagen I) transkript nivået ble hevet ved stimulering med TGF-β1 (5 ng /ml) i en tidsavhengig måte (figur 6A). Dette TGF-β1-indusert uttrykk for COL1A1 ble svekket av tilskudd med eksogene PGE2 (figur 6B). Samt PGE2, PGE1-OH sterkt undertrykt COL1A1 induksjon av TGF-β1, mens butaprost og sulproston utstilt bare beskjedne undertrykkende effekter (figur 6C). Sammen viser disse resultatene at nedregulering av COX-2 og PGE2 produksjon av TGF-β1 er involvert i ECM-komponentproduksjon i A549-celler.
(A) Celler ble stimulert med TGF-β1 (5 ng /ml) i de angitte tidsrom; deretter total RNA ble ekstrahert og COL1A1 genekspresjon ble undersøkt ved hjelp av sanntids-RT-PCR. (B) Tjuefire timer etter behandling med TGF-β1 (5 ng /ml) og PGE2 (5-25 uM), ble COL1A1 genekspresjon undersøkt. PGE2 avskaffet TGF-β1-indusert COL1A1 genuttrykk. (C) Cellene ble behandlet med TGF-β1 (5 ng /ml) og kjøretøy (metylacetat), sulproston, butaprost eller PGE1-OH (20 uM) i 24 timer, og det COL1A1 mRNA-nivået ble målt. PGE1-OH trykkes COL1A1 induksjon av TGF-β1. COL1A1 genekspresjon nivåer var normalisert til GAPDH-ekspresjon og er vist som en prosentandel av det i TGF-ß1-behandlede celler. Hver verdi representerer gjennomsnitt ± SE (n = 3). Signifikante forskjeller mellom de angitte grupper og kontrollgruppen indikeres med ** (P 0,01).
TGF-β1-indusert undertrykkelse av PGE2 produksjonen er involvert i aktin ombygging i A549 celler
Vi undersøkte også actin spenning fiberdannelse, som har vært ansett som et kjennetegn på fibroblastoid celler, så vel som en del av EMT. Som vist i figur 7A, TGF-β1 (5 ng /ml) indusert påfallende aktin polymerisasjon, mens aktin spennings fibre ble nesten ikke detektert i PGE2-behandlede celler. Behandling med butaprost eller PGE1-OH også inhiberte TGF-β1-indusert aktin spenning fiberdannelse. På den annen side, sulproston svakt trykkes aktin polymerisasjon av TGF-β1. Siden aktin stresset fiber er knyttet til cellemotilitet, vi også undersøkt cellemigrasjon av Transwell analysen. Som vist i figur 7B, stimulering med TGF-β1 øket cellemigrasjon i løpet av 24 timer, mens antallet migrerte celler ble redusert i nærvær av PGE2. Disse resultatene tyder på at TGF-β1-indusert undertrykkelse av PGE2 produksjon er relatert til aktin spenning fiberdannelse og migrering av A549-celler.
(A) A549 celler ble inkubert med TGF-β1 (5 ng /ml) og PGE2 (10 uM), kjøretøy (metylacetat), sulproston, butaprost eller PGE1-OH (20 uM) i 12 timer. Deretter F-aktin ble farvet ved anvendelse av rodamin phalloidin (rød) og fargede celler ble analysert ved bruk av en konfokal laser-scanning mikroskop ved forstørrelse x63. TGF-β1-indusert aktin spenning fiberdannelse ble undertrykt av PGE2, butaprost eller PGE1-OH. For å bekrefte plasseringen av kjerner ble cellene farget med Hoechst33258 (blå). (B) Cellemigrering ble undersøkt av Transwell-analyse som beskrevet i Materialer og Metoder. A549-celler ble behandlet med TGF-β1 (5 ng /ml) og PGE2 (10 uM) i 24 timer;
