Abstract
Alternativ spleising innebærer differensial exon utvalg av et gen transkripsjon å generere mRNA og protein isoformene med strukturelle og funksjonelle mangfold. Unormal alternativ spleising er blitt vist å være assosiert med maligne fenotyper av kreftceller, slik som kjemoterapi-resistens og invasive aktivitet. Screening små molekyler og narkotika for å modulere RNA spleising i menneskelig leverkreft cellelinje Huh-7, oppdaget vi at amilorid, forskjellig fra fire pH-påvirker amilorid analoger, kan «normalisere» skjøting av
BCL-X, HIPK3
og
RON /MISTR1
transkripsjoner. Våre proteomikk analyser av amilorid-behandlede celler oppdaget hypo-fosforylering av spleising faktor SF2 /ASF, og reduserte nivåer av SRp20 og to un-identifiserte SR proteiner. Vi har videre observert redusert fosforylering av AKT, ERK1 /2 og PP1, og økt fosforylering av p38 og JNK, noe som tyder på at amilorid behandlingen nedregulerer kinaser og fosfataser opp-regulerer de signalveier som er kjent for å påvirke skjøting faktor protein-fosforylering. Disse amilorid effekter av «normalisert» onkogene RNA-spleising og spleising faktor hypo-fosforylering ble begge opphevet ved forbehandling med en PP1 inhibitor. Global exon matrise av amilorid-behandlede Huh-7 celler detektert spleisemønsteret endres involverer 584 eksoner i 551-gentranskriptene, hvorav mange koder for proteiner som spiller nøkkelroller i ionetransport, cellulær matrisedannelse, cytoskjelettet ombygging, og genom vedlikehold. Cellular funksjonelle analyser viste påfølgende invasjonen og migrasjon defekter, cellesyklus avbrudd, cytokinese verdifall, og dødelig DNA nedbrytning i amilorid behandlet Huh-7 celler. Andre human solid tumor og leukemiske celler, men ikke noen normale celler, viste lignende amilorid-forandres RNA-spleising med devitalized konsekvens. Denne undersøkelsen gir således mekanistiske fundamentet for å utnytte lite molekyl modulering av RNA-spleising for kreftbehandling
relasjon:. Chang J-G, Yang D-M, Chang W-H, Chow L-P, Chan W-L, Lin H-H, et al. (2011) Små Molecule Amiloride modulerer onkogene RNA alternativ spleising til Devitalize humane kreftceller. PLoS ONE seks (6): e18643. doi: 10,1371 /journal.pone.0018643
Redaktør: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center i Dallas, USA
mottatt: 6 oktober 2010; Godkjent: 11 mars 2011; Publisert: 09.06.2011
Copyright: © 2011 Chang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler NSC-95-2320-B-037-049 (JGC), NSC 95-2311-B-009-004-My3 (HDH) og NSC 97-2627-B-009-007 (HDH) fra National Science Council of Taiwan og ved DOH95-B-11-TM007 (WKY) og DOH96-TD-i-111-TM003 (WKY) fra Department of Health i Taiwan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Proteome kompleksitet blir ekspandert ved alternativ spleising (AS), i en prosess som omfatter differensial exon innlemmelse eller utelukkelse av de samme pre-mRNA molekyler produsere ulike mRNA og protein isoformene [1], [2]. Den AS prosessen styres av to svært konservert protein familier: arginin /serin dipeptid repetisjoner (ER) -relaterte proteiner og heterogene kjernefysiske ribonucleoproteins (hnRNP) -relaterte proteiner [3], [4]. SR proteiner inneholder en modulær todelt struktur som omfatter et eller to RNA-gjenkjenningsmotiver ved N-terminus og en RS domene rik på arginin /serin-dipeptid gjentar ved den C-terminale [5], [6]. Funksjonen til de N-terminale motivene i SR-proteiner omfatter sekvens-spesifikk binding til exonic skjøte exhancers. Den C-terminale domene RS tjener som en generell aktivering domene for skjøting ved å koble til en heterogen RNA bindingsmotiv [6]. SR proteiner regulere utvalg av AS nettsteder, som avviker fra kanoniske spleiseseter, derfor fremmer inkludering eller ekskludering av alternative eksoner. På den annen side er det enkelte hnRNPs, slik som hnRNPA1, kan motvirke den som funksjon av SR proteiner ved binding til exonic skjøting lyddemperelementene [7].
regulerer AS derfor genekspresjon ved å generere diskrete protein isoformene som er involvert i base funksjoner av cellulære hendelser, for eksempel apoptose, kjønnsbestemmelse, axon veiledning, celle eksitasjon, og celle sammentrekning [8], [9]. AS spiller også en avgjørende rolle i utviklingen av humane arvelige forstyrrelser og kreft [10], [11], [12], [13], [14]. Aberrant AS av proto-onkogener og /eller tumorsuppressorgener kan bidra til cellulære maligne fenotyper, slik som resistens mot apoptose, fremming av invasjon og metastase, og stimulering av tumor angiogenese [11], [12], [13], [14 ]. Postulere at moduler disse kreftrelaterte gener kan ha stor innvirkning på deres sykdomsfremkallende aktiviteter, har vi vært på leting etter små molekyler eller medikamenter med modulerende effekter på AS. I denne studien er det funnet at amilorid, et velkjent diuretikum, kan forandre onkogent AS i human leverkreft Huh-7 celler, så vel som i en rekke andre humane kreft og leukemiske cellelinjer, og følgelig utforske de underliggende molekylære og cellulære mekanismer for mulige terapeutiske implikasjoner.
Resultater
Amiloride «normaliserer» isoformen RNA spleising av
BCL-X, HIPK3 Hotell og
RON /MISTR1
i Huh -7-celler
Det er nylig blitt klart at ubalansert RNA-spleising av visse gener som er assosiert med maligne egenskaper av humane kreftceller [11], [12], [13], for eksempel, resistens mot kjemoterapi og radioterapi med
BCL-X, etter onko-utviklingshemmede udifferensiert tilstand med
HIPK3, etter og invasive metastatiske potensialer med
RON /MISTR1
. I leverkreft Huh-7 celler,
BCL-X
er alternativt skjøtes inn anti-apoptotiske store RNA isoform,
BCL-XL, etter mer enn pro-apoptotiske små RNA isoform,
BCL-XS product: [15];
HIPK3
er skjøtet inn i ekson 11-ekskludert U (-) samt ekson 11-inkludert U (+) isoformene for interaksjon med Fas /FADD å modulere apoptose i utviklingsprosessen [16]; og
RON /MISTR1
er spleiset inn i 5-kb full lengde (
flRON
) RNA og to-kb ekson 11-ekskludert
RON product: (
sfRON
) RNA-isoformer, sistnevnte som er blitt korrelert med epitelial til mesenchymal overgang i kreftcelleinvasjon og metastase [17], [18]. Etter screening mer enn 500 små molekyler og narkotika, inkludert de i klinisk bruk, fant vi at amilorid hatt en potent effekt på AS av disse genet transkripsjoner (Figur 1a). Huh-7 celler behandlet med amilorid viste: (a) relativ nedgang av
BCL-XL Hotell og økning av
BCL-XS
RNA isoformer; (B) i forhold vedlikehold av
HIPK3
U (-) og reduksjon av
HIPK3
U (+) isoformer; og (c) reduksjon av både ekson 11 (+)
flRON Hotell og ekson 11 (-)
sfRON
RNA isoformer. Slike effekter av amilorid var dose- og tidsavhengig, er påvisbar av 2 timer og merket etter 24 timers inkubering med 0,5 mM av amilorid. Disse observasjonene foreslått økt utnyttelse av oppstrøms alternativ 5′-spleisesete innenfor ekson 2 av
BCL-X
, økt ekson 11 (U) utelukkelse av
HIPK3
, og redusert skjøte komplekser dannet for produksjon av både
RON /MISTR1
exon 11 (+) og ekson 11 (-) isoformer. Dermed amilorid kan modulere AS av disse tre genet transkripsjoner mot mindre ondartet «normalisert» mønstre, i likhet med de normale sortene i tidligere rapporter [15], [16], [17], [18].
RNA ble ekstrahert fra Huh-7 celler eksponert for vekstmedium inneholdende amilorid eller andre phi modulator amilorid-derivater og undersøkt for den onkogene RNA alternativ spleising av RT-PCR, som beskrevet i Materialer og Metoder. Panel (A) viser at amilorid økt bruk av alternative oppstrøms 5′-spleisesetet i exon 2 som gir den apoptotiske BCL-XS isoform (øverste rad), økte ekson 11 (U ekson) hoppe av HIPK3 som øker apoptotiske isoformen (midterste rad), og noe økt ekson 11 hopper av RON på 0,5 mM konsentrasjon (nedre rad). Panel (B) viser at skjøte mønstre av de testede gener som ikke ble signifikant påvirket av fire amilorid derivater, herunder 5- (N-etyl-N-isopropyl) -amiloride eller EIPA; 5- (N-metyl-N-isobutyl) amilorid eller MIBA; 5- (N, N-dimetyl) amilorid eller DMA; og 5- (N, N-heksa) amilorid eller HMA, på tilsvarende konsentrasjoner av Phi modulering.
Fordi amilorid er en prototype intracellulær pH (phi) modulator narkotika, undersøkte vi fire amilorid derivater på tilsvar eller større Phi påvirker doser. Vi observerte at disse derivatene ga ingen lignende «normalisering» effekt på
BCL-X
,
HIPK3, etter og
RON /MISTR1
AS mønstre i Huh-7 celler (Figur 1B). I motsetning i en tidligere studie [19] observerte vi at 5- (N-ehyl-N-isopropyl) amilorid (EIPA), men ikke amilorid modulert AS ved å redusere sykdomsfremkallende exon7 utelukkelse av
SMN2
transkripsjoner av arvelig spinal muskelatrofi celler. Disse paradoksale observasjonene viser kompleksiteten i AS mekanismer og også foreslå at spleise valg av sted i
BCL-X
,
HIPK3, etter og
RON /MISTR1
transkripsjoner i amiloride- behandlede Huh-7 celler blir mediert gjennom celle-spesifikke spleisemekanisme (r) i stedet for bare intracellulær pH-forandring.
proteomikk påvisning av stort sett hypo-fosforylerte spleising faktor SF2 /ASF i cytoplasma og cellekjernen av amilorid-behandlede cellene
Som fosforylering status av SR proteinkomponenter i AS-komplekser er kjent for å påvirke protein-protein interaksjon for skjøting funksjon, vi neste brukte 2D-gel-elektroforese for å analysere ekspresjon av differensial serin-fosforylerte proteiner. Vi fant mer enn ti proteiner med kvantitative endringer etter amilorid behandling (figur 2). Velge syv av disse protein stedene for proteomikk identifikasjon av massespektrometri (tabell 1), fant vi en av dem for å være ASF /SF2, en spleising faktor kjent for å være involvert i AS av
RON
transkripsjon [20] . For å bekrefte dette funnet, utførte vi vestlige blotter av ASF /SF2 og funnet kraftig redusert ASF /SF2 fosforylering i både cytoplasma og kjernen av amilorid behandlet Huh-7 celler (figur 3A). Analyse av andre proteinbestanddeler i skjøte komplekser (som for eksempel SRp20, hnRNPA1, hnRNPA2 /B1, Sam68 og felles SR proteiner) viste at SRp20 og to un-identifiserte fosforylerte SR-proteinene ble også redusert i cytoplasma og cellekjernen etter amilorid behandling (figur 3B). Disse resultatene antyder at amilorid modulerer AS av
BCL-X
,
HIPK3, etter og
RON /MISTR1
gjennom hypo-fosforylering av ASF /SF2 og redusert uttrykk for SRp20 og noen andre SR proteiner.
2D-gel elektroforese analyse av proteiner utvunnet fra Huh-7 celler uten (til venstre) og med (til høyre) 0,5 mM amilorid behandling i 24 timer viste betydelige endringer for minst ti flekker, hvorav syv (antydet med piler) ble isolert for nano-LC-MS /MS-spektrometri analyse og protein identifikasjon, slik som vist i tabell 1.
Western blot-analyse av subcellulære fraksjoner av Huh-7-celler med og uten 0,5 mM amilorid 24-timers behandling ble utført ved anvendelse av spesifikke antistoffer mot forskjellige spleiseproteinfaktorer og β-tubulin. (Panel A) amilorid behandling økte defosforylert SF2 /ASF former i både cytoplasma og kjernefysiske fraksjoner. (Panel B) amilorid behandling redusert uttrykk for SRp20 og to un-identifisert fosforylerte SR proteiner i både C (cytoplasma) og N (kjernefysisk) cellulære fraksjoner.
Amiloride nedregulerer fosforylering av AKT-kinase og PP1 fosfatase
Nyere studier har vist at amilorid hemmer fosforylering av kinaser og fosfataser som er knyttet til PI3K-AKT-reaksjonsveien [21], [22], [23], og som AKT-kinase og PP1 fosfatase kan regulere aktiviteten av SR-proteiner [23], [24], [25], [26], [27], [28]. Vi har fastslått derfor virkningene av amilorid på de fosforylerte formene for Akt-kinase og beslektede fosfataser i Huh-7 celler. Reduserte nivåer av Ser (473) p-AKT og Thr (320) p-PP1 ble observert i cytoplasma og cellekjernen, noe som tyder på hemming av AKT-kinase-aktivitet og aktivering av PP1 fosfatase-aktivitet (figur 4A). For å bestemme hvorvidt inaktivering av Akt-kinase og for seg ville spille en rolle i regulering av alternativ spleising, ble Huh7-celler behandlet med PI3K-AKT sti-inhibitorer, inkludert LY294002, Wortmannin og triciribine; 1 uM triciribine men ikke LY294002 eller Wortmannin redusert nivået av p-Akt. Men triciribine ved denne konsentrasjonen utøves ingen effekt på alternativ spleising av
BCL-X Hotell og
HIPK3
transkripsjoner (Figur S1). Interessant, til forbehandling av cellene med okadasyre hemme PP1 fosfatase aktivitet opphevet effekten av amilorid på
BCL-X Hotell og
HIPK3
spleising, samt effekten av amilorid på defosforylering av SF2 /ASF og redusering av den SRp20 nivå, men okadainsyre som utøves ingen klar effekt på ekspresjonen av hnRNP A1 og hnRNP A2B1 (figur 4B). Tatt sammen tyder disse resultater på at PP1 spiller en viktig rolle ved modulering av phosporylation av SR spleise faktorer og dermed moduleringen av onkogen AS i Huh-7-celler etter behandling amilorid.
(panel A). Western blot viser betydelige reduksjoner av cytoplasma p-Akt, kjerne p-Akt og atom p-PP1 i Huh-7 celler behandlet med amilorid på 0,3 mm og oppover. (Panel B) RT-PCR og western blot analyser viser at forbehandling med en PP1 inhibitor, okadainsyre, oppheves den amilorid effekter på BCL-X og HIPK3 onkogene RNA-spleising, fosforyleringen av ASF2 /ASF skjøting faktor og nivået av SRp20 i Huh-7 celler.
Genome-wide exon-arraydeteksjon av endret RNA spleising av mange funksjonelle gener i amilorid-behandlede celler
Det er mulig at effekten av amilorid på fosforylering og intracellulær lokalisering av skjøte faktorer og mRNA eksport [29] kan påvirke spleising av andre genet transkripsjoner i tillegg til
BCL-X, HIPK3 Hotell og
RON /MISTR1
. Bruke genet array-chips (Affymetrix GeneChip® Menneskelig Exon 1,0 ST Array av 518000 eksoner av 42974 gener) for exon rekke analyse (sett parametere av korrelasjonskoeffisient ≥0.7, spleising indeks ≤-1,585, og logge
2 ratio ≤- 1,585), fant vi at amilorid påvirket spleise mønstre av 551 gener som involverer minst 584 eksoner, som inkluderte 495 kjente proteinkodende gener som involverer 526 eksoner (Tabell S1, MIAME sjonsnummer # GSE24581). Disse 495 kjente proteinkodende gener kan deles inn i undermenyer som involverer cytoskjelettet ombygging, celle adhesjon, ion transport, transkripsjonsfaktorer, immunrespons, og muskelkontraksjon (figur 5A-C og tabell S2). For å bekrefte disse ekson matrise resultater, valgte vi syv (
APF-en, CRK, MBNL2, MIZF, WAC, PAPDS Hotell og
survivin
) for analyse av RT-PCR og faktisk bekreftet tydelig AS mønster endringer av disse genet transkripsjoner i amilorid-behandlede celler (figur 5D).
bioinformatiske analyser av 495 genet transkripsjoner med amilorid-modifisert alternativ spleising, som påvises ved genom-wide exon-array-målinger ble utført i henhold til genet ontologi kategorier av biologisk prosess (A), Molecular Funksjon (B) og Cellular Komponent (C). Amilorid-endret AS mønstre av
APAF1, CRK, MBNL2, MIZF, WAC, PAPD5 Hotell og
SU
R
VIVIN
spesifikke protein-kodende gen transkripsjoner oppdaget av exon- rekke analyse ble validert ved RT-PCR av skjøtes RNA isoformer (Panel D)
på detalj genet ontologi (GO) nivåer, RNA transkripsjoner viser amilorid rammede AS følger: a.). 4 av 5 gener (80,0%) av «fila motorisk aktivitet» (GO 0.000.146) og 28/132 (21,2%) av gener i «motor aktivitet» (GO 0003774); b). 5 av 7 (71,4%) av «kation: klorid symporter aktivitet» (GO 0.015.377), 5/18 (27,8%) av «anion-nger symporter» (GO 0.015.296), 3/10 (30,0%) av «natrium kalium utveksling ATPase «(GO 0.005.391), og 2/8 (25,0%) av uorganiske anion utveksling aktivitet» (GO 0005452); c). 2 av 3 (66,7%) nitric- syntase-aktivitet (GO 0.004.517); d) 16/29 gener (62,1%) av «ekstracellulære matrise strukturelle bestanddel overdragelse strekkfasthet» (GO 0.030.020), 38/346 gener (11,0%) av «cytoskeletal proteinbinding» (GO 0.030.020), 2/7 (28,6% ) av kollagen binding (GO 0005518); 2/8 (25,0%) av «myosin bindende» (GO 0.017.022), og andre. Av 213 apoptose relaterte gener, 6 (
CCAR1, EP3000, KIAA1967, PRKDC, og PRPF8
) viste endret alternativ spleising av amilorid. Av 608 kreftrelaterte gener, 32 inkludert
RON /MISTR1, ATM plakater (ataksi teleangiectasis mutert) og
FANCM plakater (Fanconi anemi M protein) ble påvirket av amilorid. Som
ATM
spiller en viktig rolle i DNA-skade reparasjon mens
FANCM
er involvert i monteringen av fanc protein komplekser som opprettholder genom integritet og stabilitet [30], endret AS av disse to genet transkripsjoner av amilorid kan resultere i kromatin degradering, som bekreftet i våre etterfølgende eksperimenter. Men
RON /MISTR1
, men ikke
BCL-X Hotell og
HIPK3
, var blant de 495 genene oppdaget å ha amilorid-endret skjøting mønstre av exon rekke analyse, antagelig på grunn av de strenge kvantitative kriterier fastsatt, og /eller korte skjøtes sekvenser av
BCL-X
.
Ved hjelp av kjente konsensus nukleotidsekvensene skjøting regulatoriske elementer, vi videre identifisert mulig skjøting enhancer og lyddemper elementer i alternativ spleising ekson, 5′-flankerende intron og 3′-flankerende intron regioner av 495 gener som påvirkes av amilorid (tabell S3). Disse spleise cis-elementer er bindingsstedene for ASF /SF2, SRp55 og andre ukjente regulatoriske forhold. I løpet av interaksjoner av SF2 /ASF og andre SR proteinfaktorer med cis-elementer i skjøtekompleksene, kan den funksjonelle tilstand av protein-protein-bindingskomplekser moduleres ved fosforyleringen status av proteinene [21], [23], [31] , [32]. Dette innebærer at den endrede spleising av disse genet transkripsjoner ble formidlet gjennom amilorid-indusert hypo-fosforylering av SF2 /ASF og andre SR proteiner.
Redusert celle mobilitet /invasjonen aktiviteter og utarmet cytoskeletal strukturer følgende AS endringer av involverte gener etter amilorid eksponering
Fordi endret
RON /MISTR1
skjøting formidlet av SF2 /ASF har vist seg å føre til økt mobilitet og invasive aktiviteter celler [20] undersøkte vi den funksjonelle effekten av amilorid indusert reduksjon av ekson 11 (+) fl
RON Hotell og ekson 11 (-) sf
RON
isoformene (figur 1C) og reduksjon av ekson 13 og ekson 20 inkludering oppdaget av ekson rekke analyse (tabell S1). Migrasjon av celler fra en skrapt mono kant ble svekket med 0,4 mM amilorid (Figur 6A). Fluorescent phalloidin bindende demonstrert endring av F-aktin cytoskeletal stillasene fra en peri-kjernenettverksstrukturen i kontrollceller til en celleoverflate fordeling med en tilsynelatende rigid innhegning av flere kjerner i amilorid-behandlede celler, og også alvorlig uttømming av cytoplasmatiske innhold, inkludert F-aktin, etter eksponering for 0,4 mm eller høyere konsentrasjoner av amilorid (figur 6B). Disse observasjonene av svekket celle mobilitet og unormal cytoplasma organisering av F-aktin er i samsvar med våre ekson matrise funn av endret RNA spleising av mange viktige samspill protein komponenter av den ekstracellulære matrise, inkludert kollagen familier for cytoskeletal nettverk og myosin familier og deres binding proteiner (Tabell S1), i tillegg til
RON /MSTIR Hotell og tilhørende regulatoriske molekyler.
(Panel A). Cellemigrering ble bestemt i sammenflytende Huh-7-cellemonolag skrapt med en plastskrape, utsatt for vekstmedium med eller uten 0,45 mM amilorid i 48 timer, renset 2x med PBS og videre matet vekstmedium uten amilorid. Serie mikroskopiske fotografier av samme områdene (merket grønn eller rød på undersiden av retter) tatt ved 48 og 96 timer viser fullstendig hemming av cellemigrasjon fra kanten av amilorid behandlet enkeltlag. (Panel B) Celler som utsettes for de angitte konsentrasjoner av amilorid i vekstmedium i 36 timer ble fikset med paraformaldehyde, permealized og farget med DAPI og FITC-phalloidin for observasjon av konfokal mikroskopi. DAPI-farget kjerner er magenta-pseudocolored i fusjonerte confocal fotografier. (Panel C) Hemmende effekt av amilorid på cytokinese ble observert med mitotiske Huh-7 celler rystet av fra fatet, re-belagt i vekstmedium som inneholder ulike konsentrasjoner av amilorid. Skillet dattercellene ble fastsatt til 24, 48 og 72 timer, farget og fotografert mikroskopisk. (Panel D) Måling av avstander mellom de to kjerner av å dele eller delt dattercellene viser at amilorid hemmer post-mitotisk cytokinese og separering av datterceller. Diameteren av cellekjernen er angitt som 10. gjennomsnitt og standardavvik for hver prøve punkt er fra 15 til 20 dattercelleparene.
forstyrrelse av cellesyklusprogresjon og mitotisk cytokinese av amilorid
Vår ekson rekke analyse av amilorid behandlet Huh-7 celler (Tabeller S1 S2) oppdaget endringer av RNA spleising hovedsakelig av proteiner involvert i cytokinese, forbundet med oppløst stoff transport, og funksjoner av aktin, mikrotubuli, og cytokinesis- relaterte kinaser [33]. I tillegg endret RNA spleising av
CENPE plakater (cent protein E 312kDa),
CEP250 plakater (centrosomal protein 250kDa) og
CEP192 plakater (centrosomal protein 192kDa) forventes til å resultere i ineffektiv kromatid separasjon i løpet av cellesyklusen. Faktisk spredning av Huh-7-celler ble inhibert ved 0,3 mM amilorid eller høyere i vekstmediet (figur 7A). Videre var det en oppsamling av G2 /M tetraploide celler som begynner ved 24 timer, og ble merket i 48 timer (figur 7B). Av lys mikroskopisk undersøkelse, var det mange bi-kjernedannelse og sene stadier anaphase celler som var antagelig G2 /M tetraploid cellepopulasjon observert av fluorocytometry. Under cellesyklusprogresjon og datter celleseparasjon i nærvær av varierende konsentrasjoner av amilorid, mitotiske celler eksponert for amilorid på 0,3 mM eller mer utviklet seg til bi-kjernedannede former ved 24 timer, men deretter ikke klarte å generere adskilte datterceller (figur 6C og 6D) . Disse tre observasjonene innebærer at gjennom å endre RNA AS gener forårsaker amilorid forstyrrelse av cytokinese ved å hemme mitotiske celler fra å passere gjennom sent anaphase prosesser abscission, divisjon, og separering av datterceller. Til slutt fikk vi bekreftet en tidligere rapport som Huh-7 celler uttrykker Prominin /AC133 /CD133, en immunologisk markør av «kreft stamceller-like» celler [34], og videre funnet at amilorid på 0,3 mm eller mer nedregulert CD133 uttrykk Huh-7-celler (figur S2-A), som resulterer i undertrykkelse av antall og størrelse på cellekoloni formasjoner (fig S2-B).
(panel A) Huh-7-celler sådd ut i 6-brønners skåler ved 3 x 10
5 celler per brønn over natten ble endret til vekstmedium inneholdende forskjellige konsentrasjoner av amilorid; celleantall ble bestemt en og tre dager senere. Celletall på 24 timer viser veksthemming av amilorid på 0,4 mm og oppover. Ytterligere celler avtar var tydelig ved 72 timer på grunn av celledød og løsrivelse i medium som inneholder amilorid på 0,3 mm og oppover. (Panel B) cytofluorometriske analyse viser amilorid inhibering av cellesyklusprogresjon med opphopning av G2 /M-fase celler. (Panel C) Apoptose er tydelig av cytofluorometriske påvisning av annexinV bindende i Huh-7 celler ble behandlet med 0,5 mM av amilorid. (Panel D) Merkede nukleært DNA degradering ble observert i Huh-7-celler behandlet med 0,4 mM amilorid, men ikke med 0,2 mM amilorid, særlig bemerket ved 48 og 72 timer.
Celledød med alvorlig DNA degradering Etter amilorid-indusert endret skjøting av funksjonelle molekyler i apoptose og DNA reparasjon trasé
i amilorid-behandlede celler, spleising endringer av
BCL-X Hotell og
HIPK3
RNA ( figur 1A) ville forutsi endrede cellulære apoptose mekanismer, og endret AS på
ATM Hotell og
FANCM
RNA (tabell S1) ville endre DNA-reparasjon og cellulære genomet beskyttelsesmekanismer. Huh-7-celler kultur i nærvær av 0,3 til 0,5 mM amilorid demonstrert ikke bare manglende cellevekst, men også etterfølgende tap av opprinnelig belagte Huh-7 celler (figur 7A). Apoptose ble tydelig av økte prosentandeler av annexinV binde celler etter eksponering for 0,3 til 0,5 mM amilorid i 24 eller 46 timer (figur 7C). Videre fluorocytometric analyse av cellulær DNA viste omfattende kjernefysisk DNA-fragmentering og degradering i flere celler enn de vist seg å være under apoptose; etter eksponering for 0,4 mM amilorid, bare 48,2%, 6,5% og 1,2% av Huh-7-celler hadde intakte cellulær DNA-profiler etter 24, 48 og 72 timer henholdsvis (figur 7D).
Lignende modulerende effekter av amilorid på oncognic RNA spleising i andre menneskers solid tumor og leukemicellelinjer
for å bestemme det generelle amilorid effekter observert i Huh-7 celler, brukte vi ytterligere 10 etablerte humane kreft og leukemi cellelinjer, inkludert to hepatoma HepG2 og Hep3B; rabdomyosakrom TE671; 3 glioblastom multi 8401, ASCG13T1xm og ASCG7T (4); 2 tykktarmskreft invasive cellelinjene HT29 og COH; og 3 leukemias K562, HL60 og MOLT4 celler, og en normal beinmarg-avledet mesenchymale stromal linjen KP-HMSC samt noen få normale blod lymfocytter kulturer, for å utføre ulike forgrunnen nevnte eksperimenter. Våre resultater viste at generelt amilorid tendens til å påvirke den maligne fenotype-assosierte AS mer enn den normale AS i cellen. Først, i hovedsak som i Huh-7 celler (figur 1), fant vi amilorid-modulert «normalisering» av abornal
BCL-X Hotell og
HIPK3
skjøting mønstre i hepatoma Hep G2, rabdomyosakrom TE671, glioblastom 8401, leukemi K562, HL60 og MOLT4 (f.eks supplerende data fra [35]). Viktigst, amilorid kan modulere transkripsjon /skjøting av
BCR-ABL
fusjonsgenet og re-sensitize kjemoresistent
Bcr-Abl
T3151 mutante celler til imatinib [35]. Tvert imot, ved hjelp av amilorid opp til 2 mm i vekstmediet, vi har oppdaget noen endring i
BCL-X Hotell og
HIPK3
skjøting mønstre i dyrkede aktiverte normale perifere mononukleære blodceller (tilleggs data fra [35]) eller i udødelig benmarg stromal KP-HMSC celler. Konsekvent, amilorid i området fra 0,02 mM-0,5 mM var cytotoksisk for kreftcellene, men ikke til normale celler i kultur (figur S3 A og B). Ved hjelp av en 72-timers
in vitro
kultur analysen, fant vi at 50% vekst hemmende doser av amilorid var omtrent 0,02 mM for TE671, 0,10 mM for K562, 0,20 mM for Huh-7, 0,3 mm for to andre HCC Hep-G2 og Hep-3B, og 0,2-0,4 mm for de tre glioblastom multi linjer, men (. Figur S3-B) 3 mm eller unmeasurable for normal cellelinjer. Videre, utførte vi global exon rekke analyse på myeloid leukemiblaster K562 og glioblastom 8401, med og uten amilorid behandling, for sammenligning med Huh-7 (Tabeller S1, S2 og S3). Krysstilpasning av de 200 topp-scores amilorid-modulerte gener av hver av de tre cellelinjene viste en ganske vanlig trekk ved amilorid-modulert spleising, nemlig at 187 gener eller 93,5% av disse 200 var de samme for de tre celler; 188 (187 pluss
DNAH8
) for Huh-7 og 8401; 189 (187 pluss
LRP2 /RyR2
) for Huh-7 og K562; og 190 (187 pluss
ABL1, ColSA2, NAALAD2
) for 8401 og A549 (figur S4-A). GO analyse av de 187 felles genene i henhold til de biologiske prosesser (figur S4-B), molekyl funksjoner (fig S4-C) og cellekomponenter (fig S4-D) kategorier viste prosentvise fordeling lik den amilorid-modulert 495 gener Huh-7 celler (figur 5), noe som tyder på at, i K562 og 8401-celler som i Huh-7 celler, amilorid-modulert som forårsaker lignende virkninger på cytoskeletal struktur, cytokinese, og DNA-reparasjon, så vel som på apoptose mekanisme og det oppløste transportsystemet.
Diskusjoner
Denne studien er basert på vår første funn som amilorid endret alternativ RNA spleising av
BCL-X, HIPK3 Hotell og
RON /MISTR1
transkripsjoner fra onkogene mønstre mot normale mønstre i menneskelig leverkreft Huh-7 celler. I oppfølgingseksperimenter, observerte vi hypo-fosforylering av SR spleise faktorer, spesielt SF2 /ASF, samt i oppstrøms protein kinaser og fosfataser, noe som tyder på at amilorid kan påvirke funksjonell tilstand av ekson inkludering /ekskludering komplekser. Globalt exon analyse faktisk avdekket endringer av AS i mange genet transkripsjoner av mobilnettverk. Som en konsekvens av amilorid-behandlede Huh-7 celler viste nedsatt migrasjon /invasjons cytokinetic evner, stående cellesyklusprogresjon med mitotiske defekter, økt apoptotiske skilt, alvorlige cellulære DNA-skader og maksimal celledød. Utforsking i ettertid, har vi nå oppnådde resultater som amilorid behandling kan produsere lignende AS modulasjon og devitalizing effekter på flere andre humane ondartede faste kreftformer og leukemiske cellelinjer, i tillegg til leverkreft Huh-7, men tilsynelatende ikke på noen dyrkede normale celler vi testet (Tall S3 og S4).
En distinkt egenskap av amilorid i moduler AS-mediert ondartede fenotyper
Amiloride, 3,5-diamino-6-klor-N- (diaminomethylene) pyrazinkarboksamid monohydrochloride ble utviklet på 1960-tallet [36] og har vært et stoff som brukes klinisk for behandling av ødem og hypertensjon basert på natrium transport og væske Homeostase effekter [37]. Derfor trodde vi først at dens virkning på onkogene RNA-spleising ville være mediert av endringer i intracellulær pH og ion bevegelse. Men ingen tilsvar AS endringer ble påvist i Huh-7 celler behandlet med fire mer potente Phi påvirker amilorid analoger, inkludert EIPA, som vi tidligere viste å modulere patogene
SMN2
avskrift i celler i spinal muskelatrofi pasienter . Således er evnen til å forandre AS av onkogene RNA synes å være en distinkt egenskap av amilorid.
As AS kontrolleres av høyt konserverte SR familieproteiner [1], [3], [5] og spiller en viktig
