Abstract
Bakgrunn
Crude ekstrakter av
Selaginella
tamariscina
, en orientalsk medisinsk urt, er dokumentert til å behandle flere sykdommer hos mennesker. Denne studien undersøkte mekanismer som
Selaginella
tamariscina
hemmer invasivitet av menneskelig oral plateepitelkreft (OSCC) HSC-3 celler.
metodikk /hovedfunnene
Heri, viser vi at
Selaginella
tamariscina
svekket HSC-3 celle migrasjon og invasjon på en doseavhengig måte. Den anti-metastatiske aktivitet av
Selaginella
tamariscina
forekom i det minste delvis på grunn av den nedregulering av matriks-metalloproteinaser (MMP) -2 og MMP-9 aktivitet gelatinase og nedregulering av protein uttrykk. Ekspresjon og funksjon av både MMP-2 og MMP-9 ble regulert ved
Selaginella
tamariscina
ved en transkripsjonsnivået, slik det er vist ved kvantitativ real-time PCR og reporter-analyser. Kromatin immunoutfelling (chip) data videre indikert at binding av cAMP responselementet bindende (CREB) protein og aktiverende protein-1 (AP-1) til MMP-2 promoteren redusert ved det høyeste doseringsnivå på
Selaginella
tamariscina
. Den DNA-bindende aktivitet av spesifisitet protein 1 (SP-1) til MMP-9-promoteren ble også undertrykket ved samme konsentrasjon.
Selaginella
tamariscina
ikke påvirke mitogen-aktivert protein kinase signalveien, men gjorde hemme effekten av gelatinase ved å redusere aktivering av serin-treonin kinase Akt.
konklusjoner
Disse resultatene viser at
Selaginella
tamariscina
kan være en potent adjuvant terapeutisk middel i forebygging av kreft i munnhulen
Citation. Yang JS, Lin CW, Hsin CH, Hsieh MJ, Chang YC (2013)
Selaginella
tamariscina
demper metastaser via Akt Pathways i Oral kreftceller. PLoS ONE 8 (6): e68035. doi: 10,1371 /journal.pone.0068035
Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, Taiwan
mottatt: 12. april 2013, Godkjent: 23 mai 2013; Publisert: 14 juni 2013
Copyright: © 2013 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av en forskningsstipend fra National Science Council, Taiwan (NSC100-2632-B-040-001-My3). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
hode og nakke plateepitelkreft står for ca 3% av alle krefttilfeller i USA, og oral plateepitelkreft (OSCC) er den vanligste formen for hode og nakke kreft [1]. Den høye frekvensen av metastaser til livmorhals lymfeknuter fører til dårlig overlevelse av kreft i munnhulen [2]. Kreftceller vanligvis spres ved å skille ulike molekyler som forringer ekstracellulære matriks (ECM), invadere blodårene, og migrere til fjerne organer [3]. Matriks-metalloproteinaser (MMP) er en større gruppe av enzymer som regulerer ECM preparat i løpet av normal utvikling og patologiske responser [4]. Selv om forskjellige MMP’er bidra til cancercellemetastasering, har gelatinaser MMP-2 og MMP-9 er mest intensivt studerte [5]. MMP-2, også kjent som gelatinase A, er et 72-kDa-protein uttrykt i de fleste vev og celler [6]. I motsetning til dette, MMP-9 (Gelatinase B), et 92-kDa-proteinet, er betinget observert i leukocytter [7]. Forhøyet MMP-2 og MMP-9 uttrykk har blitt observert i invasive og metastatiske tilfeller av human kreft i munnhulen [8-10]. Derfor har konsentrert innsats er gjort for å utvikle MMP-hemmere (MMPIs) for å stoppe spredningen av kreftceller [11].
Selaginella
tamariscina
er en urt som tradisjonelt brukes i orientalsk medisin som utviser flere terapeutiske evner. Først fordi
Selaginialla tamariscina
har vist seg å redusere blodsukkeret og serum lipid peroxide nivåer, viser det potensielle bruker i behandlingen av diabetes [12,13]. For det andre, bioflavonoider isolert fra
Selaginella
tamariscina
demonstrert antibakterielle og soppdrepende effekt [14-16]. Tredje, råolje utdrag fra
Selaginella
tamariscina
har hemmet human mesangial celleproliferasjon, og har redusert interleukin-1beta og tumornekrosefaktor-alfa produksjon [17]. Fjerde,
Selaginella
tamariscina
kan være en potensiell chemopreventive middel mot ulike humane kreftcellelinjer, for eksempel magekreft [18], lungekreft [19], brystkreft [20], og livmorhalskreft [21]. Målet med denne studien var å belyse effekten av
Selaginella
tamariscina
på menneskelige OSCC HSC-3 celler. Våre resultater viste at
Selaginella
tamariscina
stanset oral cancer cellemigrering gjennom nedregulering av MMP-2 og MMP-9-ekspresjon og ved å redusere DNA-bindende aktivitet til promotorelementer. I tillegg ble de anti-metastatiske virkninger knyttet til inaktivering av serin-treonin kinase Akt.
Materialer og metoder
Utdrag fra
Selaginella
tamariscina
Selaginella
tamariscina
ble kjøpt fra urt butikker og tørkede hele planter (100 g) ble ekstrahert to ganger med 500 ml 50% etanol i destillert vann. De samlede ekstrakter ble filtrert og konsentrert ved 70 ° C ved anvendelse av en rotasjonsfordamper under lavt trykk. Det konsentrerte rå ekstrakt ble frosset ved -80 ° C i 2-3 dager, og da det ble frysetørket i en frysetørkeapparatet og lagret ved -20 ° C. Ekstraksjonen Utbyttet var 2,8% (vekt /vekt) og den kjemiske profilen til Selaginella tamariscina ekstrakt (STE) ble analysert ved hjelp av høytrykksvæske kromatogrammer (HPLC) vekt- spektrometer [19]. I korthet
Selaginella
tamariscina
ble analysert ved HPLC-massespektrometer ved anvendelse av en HPLC (Hitachi L-6200 med en L-4500 Diode Array detektor) med et PE Sciex Qstar Pulsar ESI-TOF masse spektrometer. Prøver (10 ul) ble injisert på en Merck LiChrospher 100 RP-18 kolonne (4 x 250 mm). Kolonnen ble ekvilibrert i 0,05% eddiksyre /vann (oppløsning A) og eluering av komponentene ble oppnådd ved å øke konsentrasjonen av oppløsning B (100% acetonitril) fra 0 til 100% i 30 minutter ved en strømningshastighet på 1 ml /min. Absorbans ble overvåket ved 254 nm. De molekylære masser av toppene ble bestemt fra elektro ionisering massespektra hjelp multipliser-ladet ion profil [19]. Ekstraktet ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO) (Sigma Co., USA) og var forberedt på ulike konsentrasjoner for de påfølgende forsøkene.
Cell kultur og
Selaginella
tamariscina
ekstrakt (STE) behandling
HSC-3, en human tunge squamous cell carcinoma cellelinje oppnådd fra ATCC (Manassas, VA, USA), ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (Life Technologies, Grand Island, NY , USA), 10% føtalt bovint serum (Hyclon Laboratories, Logan, UT, USA), 2 mM glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Alle cellekulturer ble opprettholdt ved
oC 37 i en fuktet atmosfære av 5% CO
2. For STE behandling, ble passende mengder av stamløsning av STE tilsatt til kulturmediet for å oppnå de angitte konsentrasjoner og deretter inkubert med cellene i angitte tidsperioder, mens dimetylsulfoksyd oppløsning uten STE ble anvendt som blank reagens.
Bestemmelse av cellelevedyktighet (MTT måle)
for celleviabilitet eksperiment, en mikrokultur-tetrazolium (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid) kolorimetrisk analyse ble utført for å bestemme cytotoksisitet av STE. HSC-3-celler ble sådd ut i 24-brønners plater i en tetthet på 5 x 10
4 celler /brønn og behandlet med STE i en konsentrasjon mellom 0-100 mikrogram /ml ved
° C 37 i 24 timer. Etter eksponeringsperioden, ble mediet fjernet, og cellene ble vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS) og deretter inkubert med 20 ul MTT (5 mg /ml) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) for fire h. Den levedyktig celle nummer per parabolen er direkte proporsjonal med produksjonen av formazanforbindelsen, som kan måles spektrofotometrisk ved 563 nm etter løselighet med isopropanol.
In vitro lukking av sår
HSC-3 celler (en x 10
5-celler /brønn) ble sådd ut i 6-brønners plater i 24 timer, såret ved å skrape med en pipettespiss og deretter inkubert med DMEM-medium inneholdende 0,5% FBS og behandlet med eller uten STE (0, 25, 50 , 75 og 100 ug /ml) i 0, 12 og 24 timer. Celler ble fotografert ved hjelp av et fasekontrastmikroskop (x 100).
cellemigrering og invasjons assays
Cell migrering og invasjon ble undersøkt i henhold til metodene beskrevet av Yang et al. [19]. Etter en behandling med STE (0, 25, 50, 70 og 100 ug /ml) i 24 timer, ble overlevende cellene høstet og sådd ut i Boyden kammer (Neuro Probe, Cabin John, MD, USA) ved 10
4 celler /brønn i serumfritt medium og deretter inkubert i 24 timer ved
oC 37. For invasjon assay, 10 ul Matrigel (25 mg /50 ml; BD Biosciences, MA, USA) ble påført på 8 um porestørrelse polykarbonat membranfiltrene og den nederste kammer inneholdt standard medium. Filtrene ble deretter lufttørket i 5 timer i en laminær strømningshette. Den invaderte celler ble fiksert med 100% metanol og farget med 5% Giemsa. Celleantallet ble tellet under et lysmikroskop. Migrasjonen Analysen ble utført som beskrevet i invasjonen analysen uten belegg av Matrigel.
Bestemmelse av MMP-2 og MMP-9 ved gelatin-zymografi
Virksomheten til MMP-2 i betinget medium ble målt ved hjelp av gelatin-zymografi protease-analyser. I korthet ble samlet medier med et passende volum (justert med vital cellenummer) fremstilt med SDS-prøvebuffer uten koking eller reduksjon og underkastet 0,1% gelatin-8% SDS-PAGE-elektroforese. Etter elektroforese, ble gelene vasket med 2,5% Triton X-100, og deretter inkubert i reaksjonsbuffer (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM CaCl
2 og 0,01% NaN3) i 12 timer ved 37
oC . Deretter gel ble farget med Coomassie brilliant blue R-250.
Fremstilling av total celle-lysater
For totale cellelysatene til bearbeiding, ble cellene skylt to ganger med PBS og skrapt med 0,2 ml kald RIPA-buffer inneholdende protease inhibitorer cocktail, og deretter vortex-blandet ved
oC 4 i 10 min. Cellelysater ble utsatt for en sentrifugering med 10.000 rpm i 10 min ved
oC 4, og det uoppløselige pellet ble kastet. Proteinkonsentrasjonen av de totale cellelysatene ble bestemt ved Bradford-analysen.
Western blot-analyse
20 pg prøver av totale cellelysater eller atom fraksjoner ble separert ved SDS-PAGE på 10% polyakrylamidgeler og overført til en nitrocellulosemembran ved hjelp av Mini-Protean Tetra Electrophoresis System som tidligere beskrevet [22]. Blottet ble deretter inkubert med 5% ikke-fettholdig melk i Tris-bufret saltvann (20 mM Tris, 137 mM NaCl, pH 7,6) i 1 time for å blokkere ikke-spesifikk binding, og deretter over natten med polyklonale antistoffer mot MMP-2, MMP -9, TIMP-1, TIMP-2, tre MAPK (ERK 1/2, 1/2 JNK og p38), eller Akt med de spesifikke antistoffer til ufosforylerte eller fosforylerte former av det tilsvarende ERK 1/2, 1/2 JNK , p38 og Akt. Blottene ble deretter inkubert med et pepperrotperoksidase geit-anti-kanin eller anti-mus IgG i 1 time. Etterpå signal ble påvist ved hjelp av forbedret chemiluminescence (ECL) kommersielt sett (Amersham Biosciences) og relativ fotografisk tetthet ble kvantifisert ved å skanne de fotografiske negativer på en gel dokumentasjon og analysesystem (AlphaImager 2000, Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA, USA ).
RNA forberedelse og TaqMan kvantitativ real-time PCR
Total RNA ble isolert fra orale kreftceller ved hjelp Trizol (Life Technologies, Grand Island, NY) i henhold til produsentens instruksjoner. Kvantitativ real-time PCR-analyse ble utført ved anvendelse av Taqman ett-trinns PCR Master Mix (Applied Biosystems). 100 ng av total cDNA ble tilsatt pr 25 ul reaksjon med MMP-2, MMP-9 eller GAPDH-primere og TaqMan prober. MMP-2, MMP-9 og GAPDH primere og prober ble utformet ved hjelp av kommersiell programvare (ABI PRISM Sequence Detection System, Applied Biosystems). Kvantitative real-time PCR-analyser ble utført i tre eksemplarer på en StepOnePlus sekvens detection system. Terskelen ble satt over den ikke-mal kontroll bakgrunn og innenfor den lineære fasen av målet genamplifisering å beregne syklusen nummeret som karakterutskriften ble oppdaget.
Transfeksjon og MMP-2, MMP-9 promoter-drevet luciferase-analyser
HSC-3-celler ble sådd ut ved en konsentrasjon på 5 x 10
4 celler per brønn i 6-brønners cellekulturplater. Etter 24 timers inkubering, pGL3-basis (vektor), MMP-2 eller MMP-9-promotor plasmidet ble ko-transfektert med et β-galaktosidase-ekspresjonsvektoren (pCH110) inn i celler ved hjelp Turbofect (Fermentas, Carlsbad, CA). Etter 12 timer med transfeksjon, ble cellene behandlet med bærer eller STE (0 eller 100 ug /ml) i 24 timer. Cellelysatene ble høstet og luciferase-aktiviteten ble bestemt ved anvendelse av et luciferase-analysesett. Verdien av luciferase-aktiviteten ble normalisert til transfeksjonseffektivitet og overvåkes av β-galaktosidase-ekspresjon.
Chromatin immunoutfellingsanalyse (chip)
Chromatin immunoutfellingsanalyse ble utført som beskrevet tidligere [23,24] . DNA-immunopresipitert med anti-CREB, anti-SP1 eller anti c-fos ble renset og utvunnet ved hjelp av fenol-kloroform. Immunopresipitert DNA ble analysert ved PCR eller kvantitativ PCR ved å bruke spesifikke primere som tidligere beskrevet [23].
Statistisk analyse
For alle målingene, analyse av varians etterfulgt av Scheffe posteriori sammenligningen ble det brukt for å vurdere de forskjeller mellom kontroll og celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av STE. En forskjell på p 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant, og forsøkene ble gjentatt tre ganger.
Resultater
Effekter av
Selaginella
tamariscina
på HSC-3 celleviabilitet og motilitet
HSC-3 cellelevedyktighet i nærvær av forskjellige konsentrasjoner (0-100 pg /ml) av
Selaginella
tamariscina
i 24 timer er vist i Figur 1A . Selv den høyeste konsentrasjonen, 100 mikrogram /ml, ikke har en cytotoksisk effekt på HSC-3 celler. Vi brukte 0-100 mg /ml
Selaginella
tamariscina
å utføre følgende eksperimenter. Figur 1B viser resultatene av å bruke en ripe sår analyse for å beregne migrasjon evne HSC-3 celler behandlet med ulike konsentrasjoner av
Selaginella
tamariscina
. Resultatene viser at
Selaginella
tamariscina
betydelig redusert cellemotilitet både tids- og doseavhengig (p 0,001). (Figur 1B og 1C)
(A) HSC-3-celler ble behandlet med STE (0, 25, 50, 75 og 100 ug /ml) i 24 timer før den ble utsatt for et MTT-assay for celle-levedyktighet. Verdiene representerer gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter. (B) HSC-3-celler ble såret, og deretter behandlet med bærer (DMSO) eller STE (0, 25, 50, 75 og 100 ug /ml) i 0h, 12 timer og 24 timer i 10% FBS-inneholdende medium. På 0, 12 og 24 timer, ble fase kontrast bilder av sårene på tre forskjellige steder tatt.
Effekter av
Selaginella
tamariscina
om migrasjon og invasjon av HSC-3 celler
for å undersøke effekten av
Selaginella
tamariscina
på celle migrasjon og invasjon, brukte vi en Boyden kammer analyse for å påvise cellemotilitet. Figur 2a viser at
Selaginella
tamariscina
betydelig hemmet migrasjon i en konsentrasjonsavhengig måte i 24 timer. Tilsvarende indikerer figur 2B at invasivitet av HSC-3-celler ble også redusert etter inkubasjon med ulike konsentrasjoner (0-100 pg /ml) av
Selaginella
tamariscina
i 24 timer.
(A) et cellemigrering og (B) celle invasjon ble målt ved bruk av et Boyden kammer i 16 timer og 24 timer med polykarbonatfiltere henholdsvis. Migrasjons og invasjons evner av HSC-3-celler ble kvantifisert ved telling av antall celler som invaderte til undersiden av den porøse polykarbonat som er beskrevet i
Materialer og metoder
delen. Verdiene representerer gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05 sammenlignet med kjøretøygruppe.
Effekter av
Selaginella
tamariscina
på MMP-2 og MMP-9 protein uttrykk og enzymaktivitet
evnen til
Selaginella
tamariscina
å undertrykke trekkende og invasive evner av HSC-3 celler ved å redusere MMP-2 og MMP-9 uttrykk ble evaluert ved hjelp av gelatin zymografi. Figur 3A viser at enzymaktiviteten av MMP-2 og MMP-9 ble undertrykket ved
Selaginella
tamariscina
på en konsentrasjonsavhengig måte. Den høyeste konsentrasjonen av
Selaginella
tamariscina
, 100 ug /ml, hemmet MMP-2 og MMP-9 aktivitet med 57% og 51%, respektivt (figur 3B).
Selaginella
tamariscina
også betydelig redusert MMP-2 og MMP-9 protein uttrykk når oppdages ved hjelp av western blotting (Figur 3C). Derfor foreslår vi at anti-metastatisk evne
Selaginella
tamariscina
minst delvis hemmet MMP-2 og MMP-9 uttrykk. Undersøkelse av virkningene av STE på proteinet ekspresjonen av MMP’er endogene inhibitor, TIMP-1 og TIMP-2, viste at STE indusert TIMP-1 og TIMP-2 oppregulering på en konsentrasjonsavhengig måte (figur 3C og 3D)
(A og B) HSC-3-celler ble behandlet med STE (0-100 pg /ml) i 24 timer og deretter utsatt for gelatin zymografi for å analysere aktiviteten av MMP-2 og MMP-9, henholdsvis. (C) HSC-3-celler ble behandlet med STE (0-100 pg /ml) i 24 timer og deretter underkastet Western-blotting for å analysere protein nivåene av MMP-2, MMP-9, TIMP-1 og TIMP-2. (D) Kvantitative resultater av MMP-2, MMP-9, TIMP-1 og TIMP-2-proteinnivåer, som ble justert med β-aktin proteinnivå. Verdiene representerer gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05 sammenlignet med kjøretøygruppe.
Effekter av
Selaginella
tamariscina
på MMP-2 og MMP-9 mRNA uttrykk og DNA-bindende aktivitet
effekten av
Selaginella
tamariscina
på MMP-2 og MMP-9 mRNA uttrykk ble også undersøkt. Et lavt nivå av MMP-2 og MMP-9-mRNA-ekspresjon ble observert ved den høyeste dose på
Selaginella
tamariscina plakater (100 ug /ml) i 6 timer (figur 4A og 4B). For ytterligere å undersøke hvordan
Selaginella
tamariscina
regulerer transkripsjonen aktivitet av MMP-2 og MMP-9, gjennomførte vi en luciferase reporter analysen der både
Selaginella
tamariscina
og kontroll-celler ble transfektert med en MMP-2 og MMP-9-promoteren konstruksjon. Figur 4C viser at MMP-2 promoter-aktivitet ble redusert med
Selaginella
tamariscina
på en doseavhengig måte. Samtidig er omtrent 50% inhibering av MMP-9-promoter-aktivitet var tydelig ved 100 ug /ml
Selaginella
tamariscina
(figur 4D). Disse observasjonene tyder på at
Selaginella
tamariscina
regulerer MMP-2 og MMP-9 aktivitet på transkripsjonsnivået.
HSC-3-celler ble behandlet med STE ( 0, 25, 50, 75 og 100 ug /ml) i 24 timer og deretter underkastet kvantitativ real-time PCR for å analysere mRNA ekspresjon av MMP-2 (A), eller MMP-9 (B). (C) MMP-2 eller (D) MMP-9-promoteren reporter analyse for å analysere aktiviteten av promoteren MMP’er. Luciferase-aktivitet, bestemt in triplo, ble normalisert til p-galaktosidase-aktivitet. Verdiene representerer gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05 sammenlignet med bærergruppen.
Tidligere studier har vist at MMP-promotorer er regulert av flere transkripsjonsfaktorer, slik som AP-1, NFKB, CREB, og SP-1 [23,25,26]. Vi utførte en kromatin immunoprecipitation (chip) analyse for å evaluere involvering av transkripsjonsfaktorer i de hemmende effekter av
Selaginella
tamariscina
på MMP-2 og MMP-9 aktivitet (figur 5A og 5B) . ChIP analyse og kvantitativ real-time PCR viste at
Selaginella
tamariscina
vesentlig undertrykkes binding av CREB og SP-1 til MMP-2 promoter (figur 5A). Figur 5B viser at
Selaginella
tamariscina
betraktelig hemmet AP-1, men ikke NF-kB-DNA-binding til MMP-9-promoteren. Disse resultatene indikerer at
Selaginella
tamariscina
hemmet MMP-2 og MMP-9 uttrykk ved å regulere bindingsaktiviteten av transkripsjonsfaktorer på cis-element av MMP arrangører.
HSC-3-celler ble behandlet med STE 100 ug /ml i 24 timer og deretter den nukleære fraksjon ble fremstilt som beskrevet i «
Materialer og metoder
«. ChIP analyse av foreningen av ulike transkripsjonsfaktorer med MMP-2 (A) eller MMP-9 (B) promoter-regionen i HSC-3 celler. Verdiene representerer gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05 sammenlignet med kjøretøygruppe.
Effekter av
Selaginella
tamariscina
på MAPK og Akt trasé
For ytterligere å undersøke de underliggende mekanismene for oppstrøms signalveier av MMP-2 og MMP-9, brukte vi western blotting for å evaluere effekten av
Selaginella
tamariscina
på MAPK og Akt veier. Figur 6A-6C viser at den MAPK-reaksjonsveien, som inkluderer ERK, JNK og p38 proteinkinaser, var ikke særlig inhibert. Men
Selaginella
tamariscina
redusert fosforylering av Akt på en doseavhengig måte (figur 6D). Derfor foreslår vi at aktiveringen av Akt signalveien er nødvendig for
Selaginella
tamariscina
å undertrykke MMP-2 og MMP-9.
HSC- 3-celler ble dyrket i forskjellige konsentrasjoner av STE (0, 25, 50, 75 og 100 ug /ml) i 24 timer, og deretter cellelysatene ble underkastet SDS-PAGE etterfulgt av western blots med (A) anti-ERK1 /2, (B) anti-JNK, (C) anti-p38 og (d) anti-Akt (total og fosforylert)-antistoffer som beskrevet i Materialer og Metoder. Bestemte aktivitetene til disse proteinene ble deretter kvantifisert ved densitometrisk analyse med den for kontroll er 100% som vist rett under gel-data. Verdiene representerer gjennomsnitt ± SD av minst 3 uavhengige eksperimenter. * P 0,05 sammenlignet med kjøretøygruppe.
Diskusjoner
Mange medisinske planter har blitt studert for kreft programmer, for eksempel
Dioscorea
nipponica
Makino [23 ] og
Terminalia
Catappa [26]. I løpet av det siste tiåret,
Selaginella
tamariscina
har blitt en tradisjonell behandling for ulike sykdommer [14,15,18,19]. I denne studien foreslår vi at
Selaginella
tamariscina
oppviser gunstige effekter på kreft i munnhulen cellen behandling ved (1) å hemme HSC-3 munnhulekreft celle migrasjon og invasjon, (2) å redusere MMP- 2 og MMP-9-genekspresjon og enzymaktivitet, (3) å hemme fosforylering av AKT, (4) reduksjon nukleær translokasjon av CREB og SP-1 til et MMP-2 promoter, og (5) reduksjon nukleær translokasjon av AP-1 til en MMP-9-promoteren. Mange flavonoider er funnet i de grove ekstrakter av
Selaginella
tamariscina Hotell som utviser ulike farmakologiske effekter. Amentoflavone markert arrestert cellesykluser og indusert apoptose av menneskelig brystkreft og livmorhalskreftceller [21,27,28]. I tillegg sumaflavone som utøves anti-inflammatorisk virkning ved å blokkere iNOS uttrykk gjennom AP-1-inhibering [29]. Videre Mirzoeva et al viste at apigenin oppviser antiangiogen potensial i prostata carcinoma celler ved å hemme Smad2 /3 og Src /FAK /Akt trasé [30]. De tidligere studier har antydet at flavonoider spille en avgjørende rolle i anti-metastatiske effekten av
Selaginella
tamariscina
, men de underliggende mekanismene for denne prosessen krever ytterligere forklaring.
metastase, noe som fører til omtrent 90% av kreftdødsfall, er prosessen som kreftceller spre seg fra det opprinnelige tumorstedet for å fjerne organer [31]. Nedbrytning av ECM komponenter og basalmembran er et kritisk punkt i metastasering. Det finnes flere typer av proteaser som styrer ECM degradering og ombygging. MMP-2 og MMP-9 er den mest omfattende studerte av MMP-familien på grunn av sin høye tilknytning til kreft migrering og invasjon [5]. Flere tidligere studier har indikert at naturlige produkter hemme kreftmetastase ved å hemme MMP-2 og MMP-9 uttrykk [23,26]. Våre resultater tyder på at
Selaginella
tamariscina
hemmet MMP-2 og MMP-9 enzymaktivitet, så vel som protein ekspresjon. En reduksjon i migrasjons og invasjons egenskaper som følge av hemming av MMP-2 og MMP-9-aktivitet er blitt foreslått. Resultatene er lik vår forrige undersøkelse, hvor anti-metastatiske effekten av
Selaginella
tamariscina
på lungekreft celler skjedd gjennom redusert gelatinase uttrykk [19]. Utallige rapporter indikerer at MMP-genekspresjon ble spesifikt regulert ved mitogenaktiverte proteinkinaser (MAPK), en familie av serin /treonin kinaser inkludert ERK, JNKs, og p38 [31-33]. Men vår studie Resultatene indikerte at ingen observerbare effekter på MAPK signalveien resultat av reguleringen av MMP produksjon av
Selaginella
tamariscina
. I tillegg har involvering av fosfoinositid-3-kinase (PI3K) /AKT signaltransduksjonsbane i MMP genekspresjon og cellevandring tilstrekkelig studert. Wang et al viste at isoliquiritigenin hemmet ekspresjon og gelatinolytisk aktiviteten til MMP-2 og MMP-9 ved å regulere oppstrøms AKT signalveier hos brystkreft MDA-MB-231-celler [34]. En annen studie konkluderte med at berberine, en isokinolin alkaloid, hemmet brystkreft celle metastase ved å modulere AKT vei [35]. Våre data også foreslått at PI3K /AKT signalveien er involvert som et oppstrøms trigger av MMP-2 og MMP-9 regulering.
Uttrykket av MMP kan reguleres på flere nivåer, inkludert transkripsjon, post-transkripsjon , oversettelse, proenzym-aktivering, og undertrykkelse nivåer, med spesifikke hemmere [36]. Det er foreslått at
Selaginella
tamariscina
regulert MMP-2 og MMP-9 på transkripsjonsnivået fordi arrangøren aktivitet og mRNA uttrykk ble hemmet. MMP-promotorer har flere cis-elementer som kan transactivated av flere transkripsjonsfaktorer, så som NF-kB, AP-1, CREB, og SP-1. Tidligere studier har indikert at AKT /SP-1 veien regulert MMP-2 promoteraktivitet og påvirket migrering evnen av kreftceller [24,37]. Satpathy et al viste at vevet transglutaminase 2 modulerer CREB aktivering og MMP-2 transkripsjon i eggstokkreft [38]. Den oppstrøms promotorsekvens av MMP-9-genet inneholder AP-1 og NF-kB-områder. Epigallocatechin gallate (EGCG) utøver sin anti-invasiv effekt ved å undertrykke AP-en aktivering i humane mage kreftceller [39]. I tillegg regulerer NF-kB ekspresjonen av MMP-9 i forskjellige cancere [33,40,41]. Selv MMP-9 mRNA uttrykk ble regulert av
Selaginella
tamariscina
, vi ikke observere en merkbar effekt på NF-kB DNA-bindende aktiviteter. Vår studie viser at MMP-2 uttrykk ble regulert av CREB og SP-1 DNA-bindende aktiviteter når berørt av
Selaginella
tamariscina
, og AP-1 området var nødvendig for hemming av MMP -9 uttrykk.
resultatene fra denne studien viser at
Selaginella
tamariscina
redusert oral cancer migrasjon og invasjon ved å hemme MMP-2 og MMP-9 genuttrykk, og enzymaktivitet. Disse anti-tumor virkning på OSCC er forbundet med undertrykkelse av AKT og undertrykkelse av DNA-bindende aktivitet på MMP-2 og MMP-9 promotorer. OSCC invasjon og metastasering er et stort hinder for kreftbehandling. Derfor hemming av metastase av
Selaginella
tamariscina
kunne gi viktige forebyggende og terapeutiske fordeler for behandling av kreft i munnhulen.
