Abstract
Til tross for den påviste fordelene av anti-EGFR /VEGF målrettet behandling ved metastatisk kolorektalcancer (mCRC), mange pasienter i utgangspunktet svare, men så viser tegn på sykdomsprogresjon. Nye terapeutiske strategier for å gjøre handlingen av tilgjengelige narkotika mer effektiv. Vår studie forsøkte å undersøke om samtidig målretting av EGFR /VEGF og cyklooksygenase-2 (COX-2) kan hjelpe til behandling og styring av mCRC pasienter. Den doble tyrosinkinaseinhibitor AEE788 og celecoxib ble anvendt for å inhibere EGFR /VEGFR og COX-2, henholdsvis i kolorektal kreftceller. COX-2-inhibering med celecoxib forsterket den antitumorale og antiangiogen effekt av AEE788, som indikert ved hemming av celleproliferasjon, induksjon av apoptose og G1 cellesyklus-stans, nedregulering av VEGF produksjon av cancerceller og reduksjon i cellemigrering. Disse effektene ble knyttet med en blokade i EGFR /VEGFR signale aksen. Spesielt, kombinert AEE788 /celekoksib behandling forhindret β-catenin atom akkumulering i tumorceller. Denne effekten var assosiert med en betydelig nedregulering av FOXM1 proteinnivåer og en svekkelse i samspillet med denne transkripsjonsfaktor med β-catenin, som er nødvendig for dens kjernefysiske lokalisering. Videre er den kombinerte behandling også redusert ekspresjon av stamcelle markører oktober 3/4, Nanog, Sox-2 og snegle i kreftcellene, og bidro til reduksjon av CSC undergruppe, som antydet med colonosphere formasjons analyser. I konklusjonen, den kombinerte behandlingen av AEE788 og celekoksib ikke bare vist forbedret anti-tumor effekt ved kolorektal kreftceller, men også redusert kolon cscs undergruppe ved å målrette stemness relaterte veier. Derfor kan samtidig målretting av EGFR /VEGF og COX-2 hjelp i å blokkere mCRC progresjon og forbedre effekten av eksisterende behandlinger ved kolorektalkreft
Citation. Valverde A, Peñarando J, Cañas A, López-Sánchez LM, Conde F, Hernández V, et al. (2015) Samtidig Hemming av EGFR /VEGFR og syklooksygenase-2 Targets Stemness-Related Pathways i tykktarmskreftceller. PLoS ONE 10 (6): e0131363. doi: 10,1371 /journal.pone.0131363
Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA
mottatt: 15 desember 2014; Godkjent: 01.06.2015; Publisert: 24 juni 2015
Copyright: © 2015 Valverde et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. EA ble støttet av spansk Cancer Network (RTICC), Instituto de Salud Carlos III (RD12 /0036/0038) (www.isciii.es). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarmskreft (CRC) er en av de vanligste diagnosen kreft og årsaken til kreftdødelighet i utviklede land [1]. I Europa er CRC den tredje vanligste kreftformen og etter lungekreft det var den nest hyppigste årsaken til dødelighet i 2012, med nesten 215 000 dødsfall [2]. Selv om dødeligheten av CRC har gått litt ned i løpet av de siste to tiårene, og til tross for fremskritt innen deteksjon og kirurgisk behandling, er metastatisk CRC (mCRC) assosiert med en dårlig prognose, med fem-års overlevelse i området fra 5% til 8%. Målretting av epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) har vist seg å være en effektiv terapi i CRC. Spesielt har behandling med monoklonale antistoffer (cetuximab, eller panitumumabs) mot det ekstracellulære domene av reseptoren blitt viktige terapeutiske strategier for å behandle mCRC. Men svarene på EGFR-målrettede antistoffer er relativt lav, med forbedringer i overlevelse vanligvis varer bare noen måneder, og effekten er begrenset til visse pasient subtyper [3]. Faktisk, CRC pasienter definert som «quadruple negative», med svulster mangler mutasjoner i EGFR nedstrøms effektorer KRAS, BRAF, PIK3CA, og PTEN, har høyest sannsynlighet for respons på anti-EGFR terapi [4]. På den annen side er forskjellige strategier rettet mot å blokkere vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og dens reseptorer er blitt utviklet for å hemme angiogenese i CRC-pasienter [5,6]. Til tross for den påviste fordelene med disse anti-angiogene terapier i håndteringen av CRC, vil mange pasienter med langt fremskreden sykdom i utgangspunktet svare til anti-VEGF-terapi, men da vise tegn til sykdomsprogresjon, noe som antyder resistens overfor terapi [7]. Derfor er det et klart behov for bedre karakterisering av de involverte i inefficacy av anti-EGFR prosesser /VEGF målrettet terapi og finne nye terapeutiske strategier for å gjøre handlingen av tilgjengelige narkotika mer effektive.
I løpet av det siste tiåret er det blitt vist at i tumorer det er en populasjon av celler, ofte referert til som kreft stamceller (cscs), med evne til å proliferere og generere resten av tumormassen [8,9]. Evnen til selvfornyelse av cscs tillater homeostase og vedlikehold av tumor, på lignende måte som stamceller kan gjøre i normale vev. Cscs er mye mer motstandsdyktig enn differensierte tumorceller til terapier anvendt i klinikken [8]. Således har det vist seg at risikoen for kolorektal kreft tilbakefall er proporsjonal med uttrykket i den primære tumor av en serie av spesifikke og tarm stamceller gener som også identifiserer en cellepopulasjon med CSC egenskaper i tumoren [10]. Viktigere, har nyere studier vist at cscs er involvert i de mekanismer som svulster unndrar både anti-EGFR og anti-VEGF målrettet terapi [11,12]
Celecoxib er en selektiv cyklooksygenase-2 (COX-2) -inhibitor, som brukes for å forhindre polypper dannelse i familiær adenomatøs polypose (FAP) pasienter, en populasjon med høy risiko for utvikling av kolorektal kreft [13]. Men studier tyder på at celekoksib kan ha effektive anti-tumor og anti-metastatiske egenskaper mot sent stadium CRC. Dermed har effektiviteten av en antiangiogen tyrosin kinase inhibitor (axitinib) vist seg å være betydelig forbedret når den kombineres med celecoxib i en preklinisk modell av CRC [14]. Videre utvikling av flere kinaseinhibitorer, har muliggjort samtidig inhibering av EGFR og VEGF-trasé. Dette er tilfellet med AEE788, en oral inhibitor med kraftig aktivitet mot flere tyrosinkinaser inkludert EGFR, og VEGFR [15], som er blitt vist å utøve antitumoreffekter i forskjellige humane cancermodeller [16-18]. Derfor kan den samtidige målretting av EGFR /VEGF og COX-2 også hjelpe til i å blokkere mCRC progresjon. Denne studien viser at kombinasjonen av AEE788 med den spesifikke COX-2-hemmer celecoxib ikke bare vist forbedret anti-tumor effekt i kolorektal kreftceller, men også redusert kolon cscs undergruppe ved å målrette stemness relaterte veier.
Materiale og metode
Cellekultur kultur~~POS=HEADCOMP
Caco-2-celler (ECACC, Salisbury, UK) ble dyrket i MEM med Earle s salter (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Østerrike) inneholdende 15% føtalt bovint serum. HCT-116-celler (DSMZ, Braunschweig, Tyskland) ble dyrket i McCoys 5A medium (BioWest, Nuaille, Frankrike) inneholdende 10% føtalt bovint serum (PAA Laboratories). HCT-116 celler havn en aktiverende mutasjon i KRAS (G13D), mens Caco-2 celler er KRAS villtype. Kulturmedier ble supplert med 2 mM glutamin, 1% ikke-essensielle aminosyrer, penicillin (100 U /ml), streptomycin (100 ug /ml) og amfotericin B (2,5 pg /ml). Celler ble holdt i en fuktig atmosfære ved 37 ° C og 5% CO2. Etter at kulturene ble 80% sammenflytende (vanligvis etter 3 dager), ble cellene trypsinert, sentrifugert og suspendert i friskt medium. Alle celler anvendt for eksperimenter som vises 95% levedyktighet og ble sådd ut i 96-brønners plater, 6-brønners kulturplater, 60 mm dyrkningsplater eller ultra lav-festeplater (Corning Inc, Lowell, MA, USA). Alle forsøkene ble utført i duplikat, og gjentas minst tre ganger.
Reagenser
AEE788 (Novartis Pharma AG, Basel, Sveits), NS-398 og celecoxib (Sigma-Aldrich, Madrid, Spania) ble oppløst i DMSO for å fremstille lager konsentrasjoner på 10 mM, 10 mM og 20 mM, respektivt, og lagret ved -20 ° C. Arbeidsløsninger ble fremstilt ved fortynning av tinte stocks inn i cellekulturmediet. Konsentrasjonen av DMSO i den endelige fortynningen ikke overstige 0,1% volum /volum. Human EGF ble levert fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) og oppløst i glycerol for å fremstille lager konsentrasjoner på 10% volum /volum. Human rekombinant VEGF ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich og oppløst i vann for å fremstille lagerkonsentrasjon på 10 ug /ml. For western blot-analyse ble følgende antistoffene benyttet: fosfo-EGF-reseptor (Tyr1068) kanin-pAb, fosfo-VEGF reseptor 2 (Tyr1175) (19A10) kanin-mAb, VEGF-reseptor 2 (55B11) kanin mAb, fosfo-P44 /42 MAPK (Erk 1/2) (Thr202 /Tyr204) (D13.14E) kanin mAb, fosfor-Akt (Thr308) (C31E5E) kanin mAb, fosfor-Akt (Ser473) (587F11) mus mAb, Akt kanin pAb og β-catenin kanin pAb ble kjøpt fra cellesignalisering Technologies (Danvers, MA, USA). EGFR mus mAb (0.N.268), aktin (C-2) muse-mAb, geite-anti-kanin, geit anti-mus, esel anti-geit sekundære antistoffer, og FOXM1 (K-19): sc-500 ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology. MAP kinase ERK1 /ERK2 kanin pAb var fra Calbiochem-EMD Millipore (Rica, MA, USA), COX-2-mus mAb (Clone CX229) var fra Cayman Chemical (Ann Arbor, Michigan, USA) og Ep-Cam mus mAb var fra Chemicon International (Rica, MA, USA). Propidiumjodid ble oppnådd fra Sigma-Aldrich og ble fremstilt ved å oppløse 1 mg i 1 ml fosfat-bufret saltløsning. Denne oppløsning ble beskyttet mot lys og lagret ved 4 ° C. RNase, DNase-fri ble hentet fra Roche Applied Science (Indianapolis, IN, USA). Aksje konsentrasjoner på 500 mikrogram /ml RNase var forberedt og holdt at- 20 ° C.
Cellular spredning analysen
Celleproliferering og levedyktighet ble vurdert ved hjelp av en XTT kolorimetrisk analyse (Roche Applied Science). Celler ble sådd på 96-brønners plater i en tetthet på 4000 celler /brønn og la til å feste i 24 timer. Cellene ble deretter behandlet med AEE788 (0-20 uM) som en monoterapi eller i kombinasjon med celecoxib (10 uM) i nærvær eller fravær av EGF (100 ng /ml). Styrer-celler ble behandlet med den samme konsentrasjon av DMSO kjøretøyet. Etter behandling på angitte tider og doser ble XTT analysen utført etter protokollen fra produsenten ved hjelp av en mikro absorbans leser.
Colonosphere formasjon analysen
For colonosphere dannelsen analysen, etter behandlinger celler ble tripsinized, tellet og re-sådd ut ved klonal tetthet (1 celle /ul) i 96-brønns plate med ultra-lav festeflaten (Costar, Corning, NY, USA) med serumfritt Dulbeccos MEM Nutrient Blanding F + 12 Ham medium supplert med B27 (01:50; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 10 ng /ml basisk fibroblast vekstfaktor (Peprotech, London, UK)), 20 ng /ml EGF (Santa Cruz Biotechnology) og 1% volum /volum metylcellulose (R Omvendt primer: 5′-AGCAAGGCCCACAGGGATTT-3, Effektivitet: 2; GAPDH: (240 bp), Forward primer: 5′-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3 «;
Reverse primer: 5′-TCCTTGGAGGCCATGTAGGCCAT-3′, Effektivitet: 2; Resultater ble normalisert til den av GAPDH og kvantifisering av den relative ekspresjon ble bestemt ved 2
-ΔΔCt metode.
Transient ekspresjon av mutant K-RAS-genet i Caco-2 celler
Caco -2 celler ble transient transfektert med pBabe K-Ras 12V plasmid eller tom vektor (pBABE-puro), levert av Addgene (plasmider # 12544 og # 1764). PureYield Plasmid Midiprep System (Promega) ble anvendt henhold til protokollen fra produsenten. Celler ble sådd på 90% konfluens i 6-brønners plater og etter 24 timer ble cellene transfektert hjelp Lipofectamine 3000 (Life Technologies) som transfeksjon reagens, etter produsentens anvisninger. Analyse av EGF-uavhengig aktivering av ERK1 /2 ved Western blot og celleproliferasjonsprosesser analyser ble utført i transfekterte celler.
Immunofluorescence konfokal mikros
Celler ble dyrket på poly-L-lysin-behandlede dekk for å danne en nesten sammenflytende monolag og etter 6h av de forskjellige behandlinger. Deretter ble kulturmediet fjernet, cellene ble vasket tre ganger i PBS og permeabilisert i metanol. Etter vasking med PBS, ble objektglassene inkubert med anti-β-catenin (1/250) mus-mAb (BD) og FOXM1 (1/250) kanin-pAb (Santa Cruz Biotechnology), i 1 time ved romtemperatur, vasket tre ganger i PBS og merket med et anti-mus-IgG alexa fluor 488-merket antistoff (1/500) (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) og med anti-kanin IgG (H + L) alexa fluor 594-merket antistoff (1/500) (Santa Cruz Biotechnology), i 1 time ved romtemperatur. Til slutt ble cellene inkubert med 300 nM 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol-dihydroklorid (DAPI) i PBS i 5 minutter ved romtemperatur. Dekkglass ble montert ved hjelp av Aqua Poly /Mount (Polysciences, Warrington, PA, USA) og visualisert i en Zeis LSM 5 Exciter Confocal laser-scanning mikroskop (Zeiss, Tyskland). Bilder ble analysert ved hjelp av image-J programvare (National Institutes of Health).
Co-immunoutfellingsstudier analyser
Celler ble lysert i co-IP buffer (10 mM HEPES, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl
2, 0,5 mM DTT, 0,5 mM, PMSF, 0,075% NP40 og 1% v /v proteaser /fosfatase-inhibitor cocktail), sentrifugeres og fjernet ved inkubasjon med 22,5 ul protein A /G-gel i 1 time ved 4 ° C. Den pre-erte supernatant ble underkastet IP ved bruk av de angitte første antistoff ved 4 ° C i 1 time. Deretter ble proteinkomplekser oppsamlet ved inkubasjon med 22,5 ul protein A /G-gel ved 4 ° C over natten. De oppsamlede proteinkomplekser ble vasket tre ganger med PBS-buffer, sentrifugert ved 14 000 xg, 4 ° C i 10 minutter, og analysert ved western blotting.
Statistisk analyse
Alle data er uttrykt som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av GraphPad Prism 5. Før man sammenligner to datagrupper, en normalitet test og en lik varians test ble utført. Hvis datagrupper passert begge tester, ble en sammenligning gjort av en parametrisk metode (uparet t-test). Hvis normaliteten og /eller lik varians test ble brutt, ble en sammenligning gjort av en ikke-parametrisk metode (Mann-Whitney-test). Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant ved p 0,05.
Resultater
AEE788 hemmer celledeling, induserer apoptose og endrer cellesyklus i kolorektal kreft celler
AEE788 utøves en antiproliferativ effekt i HCT-116 og Caco-2 celler med en høyere antitumoreffekt i tilfellet av Caco-2-celler, (figur 1A). De forskjellige følsomhet for AE788 mellom de to cellelinjene ble mer tydelig i tilfellet med EGF-drevet celleproliferasjon, hvori 2,5 uM AE788 redusert spredning av Caco-2-celler med 60%, mens K-Ras mutert HCT-116-celler var ikke i vesentlig påvirket (figur 1B). I overensstemmelse med disse resultater AEE788 utøves en doseavhengig apoptotisk celledød i Caco-2, men ikke i HCT-116-celler (figur 1C). Videre behandling av Caco-2-celler med forskjellige doser av AEE788 resultert i en økt prosentandel av celler i G1 fase på en doseavhengig måte, sammenlignet med ubehandlede celler, mens disse endringer i cellesyklus ikke ble observert i AE788-behandlede K -Ras mutert HCT-116 celler (figur 1D).
A) Celleproliferering ble evaluert etter 72 timer med behandling med forskjellige doser av AEE788. B) Inhibering av celleproliferasjon ved AEE788 ble testet i celler som vokser i nærvær av EGF (100 ng /ml). C) Den fraksjon av apoptotiske celler ble beregnet etter 48 timers behandling med forskjellige doser av AEE788 av celler som vokser i nærvær av EGF (100 ng /ml). D) Analyse av cellesyklusen ble utført ved flow-cytometri etter 48 timers behandling med forskjellige doser av AEE788 av celler som vokser i nærvær av EGF (100 ng /ml). Dataene er gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige forsøk (* p 0,05, sammenlignet med kontrollgruppen).
AEE788 hemmer EGFR-signalering i kolorektal kreft celler
Vi neste analysert aktiverings av EGFR, ERK og AKT kinaser å vurdere betydningen av EGFR signal blokaden i anti-tumor effekter av AEE788 (fig 2). Behandlingen med AEE788 hemmet EGFR fosforylering i både HCT-116 og Caco-2-celler. Imidlertid AEE788 effektivt inhiberte EGF signaleakse kun i Caco-2-celler, som vist ved inhiberingen av EGF-indusert fosforylering av ERK 1/2 (figur 2). Dessuten ble en inhibering av EGF-indusert fosforylering av Akt Thr observert i AEE788-behandlede Caco-2, men ikke i HCT-116-celler. Derfor er sterkt avhengig av vill-type K-Ras status de observerte anti-EGFR-aktivitet av AEE788 i kolon kreftceller.
fosforylerte og ikke-fosforylerte former av EGFR, ERK 1/2 og Akt ble detektert av Western-blot ved hjelp av spesifikke antistoffer. Celler ble dyrket i fravær eller nærvær av EGF (100 ng /ml) og behandlet med AEE788 (2,5 uM) i 5, 10 eller 15 min. Uttrykket nivået av aktin ble inkludert som lasting kontroll.
AEE788 hemmer VEGF-drevet spredning i Caco-2 celler
I tillegg til anti-EGFR aktivitet, AEE788 også retter seg mot VEGFR signalering. I dette henseende er funksjonen av VEGF er ikke begrenset til angiogenese og vaskulær permeabilitet, og det er kjent at både autokrine og parakrine VEGF-signalering forekomme i tumorceller [19]. Derfor neste undersøkte vi om AEE788 svekke VEGF signalisering i tykktarm kreft celler. Som vist i figur S1, ved behandling med AEE788 inhiberte VEGF-drevet celleproliferasjon i Caco-2, men ikke i HCT-116-celler.
COX-2-inhibering forsterker den antitumorale virkning av AEE788
det er kjent at VEGF stimulerer COX-2 ekspresjon og prostaglandin-syntese, som i sin tur induserer VEGF-produksjon [20,21]. Derfor kan den kombinasjon med COX-2-hemmere være en effektiv måte for å øke aktiviteten av AEE788. Som vist i figur 3, tilsetning av både NS-398 og celekoksib, to kjente selektive COX-2-hemmere, forbedret anti-tumoral virkning av AEE788, som indikert ved inhibering av celleproliferasjon (figur 3A). Videre er den kombinerte behandling med AEE788 og celekoksib økte prosentandelen av Caco-2-celler arrestert i G1 (figur 3B). Spesielt ble en betydelig høyere prosentandel av celler i G1 fase observeres etter den kombinerte behandling enn med enten legemidler alene. På den annen side ble det observert ingen av disse effektene i HCT-116-celler, som kan relateres til de mye lavere ekspresjonsnivåer av COX-2 i disse cellene i forhold til Caco-2 (figur 3C) og deres muterte K-Ras status. Således transfeksjon av Caco-2-celler med et mutant K-Ras-uttrykkende plasmid bekreftet at nedstrøms aktivering av EGFR-Ras-ERK reaksjonsveien, slik som vist ved den EGF-uavhengig ERK1 /2 fosforylering, avskaffet den antiproliferative aktivitet av AEE788 og /eller celecoxib (S2 fig). Videre celecoxib inhibert med mer enn 70% av PGE2 produksjon i Caco-2 celler (S3) Fig. Videre ble det funnet at AEE788 behandling reduserte COX-2 protein-ekspresjon i Caco-2-cellene, som forklarer 40% reduksjon av PGE2 produksjon, mens inhibering av COX-2-enzymatisk aktivitet med celecoxib ikke påvirker COX-2 ekspresjon (S3 Fig ). Følgelig er den kombinerte behandling av AE788 og celekoksib hemmet EGFR, ERK 1/2, og AKT (Ser /Thr) fosforylering i Caco-2-celler (figur 3D). Kvantitativ analyse ved hjelp av et antistoff panel mot signal kinaser viste at den kombinerte behandlingen av Caco-2 celler med AEE788 og celekoksib forårsaket en betydelig høyere hemming av VEGFR, Akt (Ser /Thr) og Stat3 fosforylering enn med enten stoffet alene (S4 fig).
A) EGF-drevet celleproliferasjon ble målt i celler som vokser i nærvær av EGF (100 ng /ml) og i nærvær eller fravær av AEE788 (2,5 uM), celecoxib (10 uM) og NS- 398 (10 mm). B) Analyse av cellesyklusen ble utført ved flow-cytometri etter 48 timers behandling med AEE788 (2,5 uM) og /eller celecoxib (10 uM) av celler som vokser i nærvær av EGF (100 ng /ml). C) Expression nivåer av cyklooksygenase-2 (COX-2) ble analysert ved western-blot i hele celleekstrakter danne Caco-2 og HCT-116 celler. Uttrykk for β-aktin er inkludert som lasting kontroll. D) De fosforylerte og ikke-fosforylerte former av EGFR, ble ERK 1/2 og Akt detektert ved Western-blot ved anvendelse av spesifikke antistoffer. Celler ble dyrket i nærvær av EGF (100 ng /ml) og behandlet med AEE788 (2,5 uM) og /eller celecoxib (10 uM) i 6 timer. Uttrykket nivået av aktin ble inkludert som lasting kontroll. Den tilsvarende densitometrisk analyse er også vist. Dataene er gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter (* p 0,05, sammenlignet med kontroll; # p 0,05, sammenlignet med AEE788-behandlede celler).
COX-2 inhibering forsterker anti -angiogenic aktivitet av AEE788
hemning av COX-2 i kombinasjon med anti-EGFR /VEGFR aktivitet av AEE788, forårsaket en vesentlig reduksjon i den VEGF-A mRNA-ekspresjon (fig 4A) og VEGF165 protein sekresjon nivåer (figur 4B) i Caco-2, men ikke i HCT-116-celler. Videre endoteliale rør formasjons analyser viste at den angiogene aktiviteten av Caco-2-kondisjonert medium var signifikant lavere når cellene ble behandlet med AEE788 og celekoksib enn med noen av medikamentene alene. (Fig 4C og 4D).
A) VEGF-A mRNA-ekspresjonsnivåer ble analysert ved sanntids RT-PCR i kolorektal kreft celler som vokser i nærvær av EGF (100 ng /ml) og utsatt for den indikerte behandling i 48 timer. B) VEGFA165 nivåer ble kvantifisert ved hjelp av ELISA i kondisjonert medium oppsamlet fra celler som vokser i nærvær av EGF (100 ng /ml) og behandlet med AEE788 (2,5 uM) og /eller celecoxib (10 uM) i 48 timer. Dataene er gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter (* p 0,05, sammenlignet med kontrollen). C) Den angiogene aktiviteten av media betinget av Caco-2-celler eksponert i 24 timer til de angitte behandlinger ble evaluert ved bruk av endotelial-forsøket som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Dataene er den totale lengden av rørene dannet i bildeelementer (piksler), som viser gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter (* p 0,05, sammenlignet med kontrollen). D) Representative bilder av de dannede innbyrdes forbundet nettverk etter behandling av endoteliale celler med de angitte Caco-2-celler kondisjonert medium. Omfanget av røret formasjonen ble kvantifisert som angitt i materialet og metodene delen. (Endelig forstørrelse: X40, tilsvarer skala bar til 100 mikrometer)
I tillegg til funksjonene VEGF i angiogenese og i endotelceller, fremming av kreft celle migrasjon har vist seg å være blant de. autokrine funksjoner av VEGF på kreftceller [22,23]. Derfor vi neste undersøkt effekten av AEE788 og /eller celekoksib på Caco-2 og HCT-116 celler migrering ved hjelp av ripe sårtilheling analysen.
