Abstract
Hypoksi induserbar faktor (HIF) er viktig for kreftceller med begrenset oksygentilførselen signalveien, som det er vist å være involvert i prosessen med proliferasjon og angiogenese. Gitt sin sentral rolle i kreft biologi, robuste analyser for sporing av endringer i HIF uttrykk er nødvendig for å forstå sin regulering i kreft samt utvikle terapier som er rettet mot HIF signalering. Her rapporterer vi en roman HIF reporter konstruksjon innehold tandem repetisjoner på minimum HIF bindingssteder oppstrøms EYFP kodende sekvens. Vi viser at reporter-konstruksjonen har en utmerket signal til bakgrunnsforhold og reporteraktiviteten er avhengig av HIF og korrelerer direkte med HIF proteinnivåer. Ved å benytte denne nye konstruksjonen, vi analysert HIF aktivitet i forskjellige kreftcellelinjer dyrket i forskjellige grader av hypoksi. Denne analysen avslører en overraskende kreftcellelinje spesifikk variant av HIF-aktivitet i den samme grad av hypoksi. Vi viser videre at i to livmorhalskreft cellelinjer, ME180 og HeLa, de ulike HIF aktivitetsnivået observert korrelerer med nivåene av HSP90, en kofaktor som beskytter HIF mot VHL uavhengig nedbrytning. Denne romanen HIF reporter konstruere fungerer som et verktøy for å raskt definere HIF aktivitetsnivå og dermed den terapeutiske kapasitet på potensielle HIF repressors i enkelte kreftformer
Citation. Zhou W, Dosey TL, Biechele T, Moon RT, Horwitz MS , Ruohola-Baker H (2011) Vurdering av Hypoksi induserbare Factor nivåer i kreftcellelinjer ved hypoksisk Induksjon Bruke en Novel Reporter Construct. PLoS ONE 6 (11): e27460. doi: 10,1371 /journal.pone.0027460
Redaktør: Gangjian Qin, Northwestern University, USA
mottatt: 4 mai 2011; Godkjent: 17 oktober 2011; Publisert: 23.11.2011
Copyright: © 2011 Zhou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av R01GM083867-01, R01GM097372-01, og 1P01GM081619 fra National Institute of General Medical Sciences og en Breast Cancer Research Program Pilotprosjekt tilskudd til HR-B. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Hypoksi er velkjent for en fundamentalt regulere mange aspekter av cellebiologi. Mesteparten av effektene av hypoksi involvere hypoksi induserbar faktor (HIF), et sterkt konservert og avgjørende oksygen regulert heterodimer transkripsjonsfaktor som består av en alfa (α) og en beta (β) subenhet. Begge disse subenheter hører til PER-ARNT-SIM (PAS) gruppe i basic-helix-loop-helix (bHLH) familie av transkripsjonsfaktorer [1]. To gener som koder for pattedyr HIFα subenheter (HIF1α, HIF2α) er godt studert: HIF1α er allestedsnærværende uttrykt mens HIF2α utstillings mer begrenset vevsdistribusjon [2]. I normoxia, HIFα gjennomgår prolyl hydroksylering og binder seg til et ubiquitin E3-ligase, von Hippel-Lindau (VHL) protein, noe som fører til polyubiquitination og hurtig proteosomal nedbrytning av HIFα [3], [4]. Under hypoksi, er HIFα hydroksylering hemmet, noe som resulterer i akkumulering av HIFα og dannelse av HIFα-HIFβ heterodimerer. De heterodimerer ytterligere komplekse med coactivator p300, og binder seg til arrangører av HIF målgener å indusere genekspresjon [5]. I tillegg til hypoksi, kan mange andre veier påvirke HIF stabilisering [6], [7]. Kofaktorer, slik som PACF P300 /CBP assosiert faktor [8] og HSP90 [9], [10], også bidra HIF stabilisering og forbedre HIF aktiviteter. HSP90 har vist seg å beskytte mot HIFα VHL uavhengig degradering som kan oppstå i hypoksi [11].
godt studert HIF målgener inkluderer de som er involvert i oksygentilførsel og celleproliferasjon, slik som vaskulær endotelial vekst faktor (
VEGF
) [12], [13] og
p21 product: [14]. I tillegg HIF forenkler tilpasning til oksygenmangel ved å regulere gener involvert i glukoseopptak og metabolisme, slik som karboanhydrase (
CA9
) [15], som opprettholder cellulær pH
i homeostase etter hypoksi. Det ble nylig rapportert at HIF og målet genet,
Oct4
, er ansvarlig for hypoksi indusert kreft stamcelle fenotype som er tenkt å drive progresjonen og aggressivitet i enkelte svulster [16]. Gitt sin sentral rolle i angiogenese og tumorprogresjon, er HIF en terapeutisk attraktivt mål og blokkerer HIF, spesielt kombinert med konvensjonell terapi har vist gunstige effekter [17], [18].
For å undersøke HIFs «temp og romlig uttrykk i vev, flere direkte og indirekte reporter systemer utviklet for å spore HIF protein uttrykk
in vivo
. Enten full lengde HIF cDNA, eller et fragment i henhold til oksygenavhengig regulering har vært knyttet til fluorescerende protein [19], eller ildflue luciferase [20] for å konstruere HIF-fusjonsproteiner. Alternativt, siden HIF fusjonsprotein studiene ikke avsløre om HIF komplekset er transkripsjonelt aktiv, promoter basert journalister har også blitt utviklet. Typisk 5-8 gjentakelser av hypoksi responselementer (HRes) (5′-GCCCTACGTGCTGTCTCACACAGC-3 «) fra 3′-enhancer område av human Epo-gen, eller det HRE fra VEGF (5′-CACAGTGCATACGTGGGCTCCAACAGGTCCTCT-3′) er forbundet i tandem med en minimal promoter for å drive ekspresjonen av et reportergen nedstrøms [21], [22]. Det er verdt å merke seg at i disse konstruksjonene, inneholder HRE ikke bare HIF-1α eller HIF2α konsensusbindingsseter (5»-CGTG-3 «og 5′-TRCGTG-3», henholdsvis), men også
Epo
eller
VEGF
promoter spesifikke sekvenser. Nylig
Oct4
har vist å bli indusert av HIF etter hypoksi [16], men
Oct4
promoter inneholder kun tre ganger i CGTG, selve HIF-bindingssetet, men ikke de HRE sekvenser observert enten i
Epo
eller
VEGF
promoter.
for å maksimere den spesifisitet og sensitivitet av reporterkonstruksjon, en strategi for å bruke den mest primitive transkripsjonsfaktor-bindingssete i tandem i en reporter har blitt benyttet tidligere i tilfellet med Wnt-reaksjonsvei-analyse [23], [24]. I den foreliggende undersøkelse, benyttet vi en lignende strategi for å bygge opp en promotor basert reporter, bare som omfatter den minimale HIF1α og HIF2α bindingsseter sammen (CGTGTACGTG) i tandem i promotoren. Vi viser at denne nye HIF reporter med HIF bindende repetisjoner (HBR) har et godt signal til bakgrunnsforhold og signal dynamikk i deoksygenering og Reoksygeneringen. Vi viser også at signalet er avhengig av HIF som åpenbart av HIF RNAi-studier, og den korrelerer med cellulære HIF proteinnivå i forskjellige cellelinjer. Ved å benytte den nye konstruksjon, viser vi at HIF aktivitetsnivået varierer betydelig i forskjellige kreftcellelinjer dyrket i samme grad av hypoksi. Vi avslører videre at i to livmorhalskreft cellelinjer, forskjellene i HIF aktivitet korrelerer med nivået av HIF kofaktor, HSP90, som beskytter HIF mot VHL uavhengig nedbrytning.
Resultater
Vi har konstruert en lentiviral plasmid, hvori ekspresjon av forbedrede gul fluorescerende protein (EYFP) ble under regulering av tolv tandemrepetisjoner av ubetydelige HIF-bindingsseter (CGTGTACGTG), etterfulgt av en minimal menneskelig tymidin kinase (TK) promoter (12U- HBR). Dessuten ble et 770 bp p-globin intronsekvenser innlemmet mellom TK-promotoren og EYFP for bedre transkripsjon av EYFP (figur 1a, Figur S1). For å analysere konstruksjonen funksjon
in vitro
, omformet vi viruset inn i HeLa-celler og dyrket dem i enten normoksiske (20% O
2) eller hypoksisk (2% O
2) tilstand. Etter 24 timer ble det observert at cellene under hypoxi jevnt uttrykt EYFP (~70% av EYFP positiv), mens de under normoxia bare fått fluorescens med sterkt redusert intensitet (~6% av EYFP positiv, figur 1b og fig S2).
3, 6 eller 12 tandem enheter av HIF bindende repetisjoner (3U, 6U eller 12U-HBR) og en TK minimal promoter sammen regulere EYFP uttrykk. b-c) Optimalisering av antallet av HIF bindings gjentas. b) 6U-HBR HeLa-celler slår EYFP på i 2%, men ikke i 20% oksygen. Lik mengde celler (5 × 10
4) ble belagt i både kultur retter og mikroskopi og FACS-analyse ble utført etter 2 dager; c) signal-til-bakgrunnsforhold er representert ved FACS-analyse. HeLa-celler ble transdusert med HIF-HBR reporter lentivirale partikler i 24 timer og deretter dyrket under normoxia (20% O2) eller hypoksi (2% O2) i 48 timer før FACS-analyse. Nøkkeltall er av geometriske hjelp av EYFP intensitet i 2% til 20% oksygen.
For ytterligere å optimalisere signal til bakgrunn ratio, vi redusert antall HIF-bindingsseter, og dermed skape HIF-journalister med 3 tandem bindingsseter (3U-HBR) eller med 6 sider (6U-HBR) (Figur 1a). Ved analyse i HeLa-celler, observerte vi at 6U-HBR konstruksjonen oppnås et bedre signal-til-bakgrunn ratio enn 3U-HBR og 12U-HBR konstruksjoner (33.4, 5.8 og 15.1, henholdsvis. Figur 1c). Å sammenligne spesifisitet og sensitivitet overfor andre hypoksi journalister, vi spesifikt fått en av de mye brukt HIF reporter 5HRE_hCMV_Luc [25]. Etter transient transfektert 5HRE_hCMV_luc reporter i HeLa-celler, observerte vi 50-100 ganger større luciferaseaktiviteten i henhold til 2% O
2, sammenlignet med celler som vokser i 20% O
2, som var i overensstemmelse med den opprinnelige funn. Til sammenligning viser vår HBR_eYFP reporter om 30-40 ganger økning i 2% O
2, en økning som faller i en lignende skala som sett med 5HRE_hCMV_luc reporter. Med likheten i signalintensiteten, men de to HIF rapportør konstruksjoner er ikke direkte sammenlignbare, fordi de har forskjellige ryggrads sekvenser, forskjellige minimale promotere og rapportørgener, som alle kunne gjengi dem forskjellig oppførsel og dynamikk i henhold til hypoksi. I denne studien ble 6U-HBR brukes for videre optimalisering og karakterisering.
neste preget dynamikken i konstruksjonen i ferd med deoxygenation og Reoksygeneringen. Når overført fra normoxia til hypoksi (2%), 6U-HBR-HeLa-celler som hadde rask respons (figur 2a); imidlertid, når de overføres fra hypoksi tilbake til normoxia, redusert fluorescentintensiteten langsomt (72 timer for å oppnå basalnivået, figur 2b). For en konstruksjon med bedre evne til å reflektere rettidig omsetningen av HIF, endret vi EYFP og genererte en destabilisert versjon ved å feste mus ornitindekarboksylase 422-461 domene, en region som er ansvarlig for rask nedbrytning av proteinet [26], til C-terminus av EYFP, derfor skaper konstruere av 6U-destabilisert-HBR (6UD-HBR). Vi observerte at 6UD-HBR hadde en redusert fluorescens men lignende dynamikk sett med 6U-HBR (figur 2a). Når overført tilbake til normoxia, det fluorescente signalet fra 6UD-HBR-celler viste dramatisk reduksjon nådd sitt laveste nivå i 10 timer. Basert på disse observasjonene, er 6U-HBR mer sensitiv i å oppdage endringer i prosessen med deoxygenation mens 6UD-HBR bedre gjenspeiler endringer i prosessen med Reoksygeneringen.
5 × 10
4 celler ble sådd ut på 35 mm plater og deretter dyrket under enten normoxia (20% O
2) eller hypoksi (2% O
2). På ulike tidspunkter ble cellene høstet og fast for FACS analyse. Mener og feilfelt er fra tre biologiske gjentas.
For å bekrefte HIF-avhengighet av reporteren, utførte vi RNAi eksperimenter rettet mot HIFs etter hypoksi. Når banke ned tre HIFs (HIF1α, HIF1β og HIF2α), hadde 6U-HBR-HeLa celler under hypoksi sterkt redusert fluorescens, nær nivået sees under normoxia (figur 3a-f, omtrent like mange celler observert i a-d) . Videre har vi vist at overekspresjon av ikke-nedbrytbart HIF1α eller HIF2α alene var tilstrekkelig til å aktivere ekspresjon av konstruksjonen (figur 4a og 4b). For å teste om signalet indusert av HIFα over-uttrykk (OE) ble direkte forårsaket av den kanoniske aktivitet HIFα introduserte vi RNAi mot viktig kofaktor HIFα, HIF1β, i HIFα OE celler. Vi viste at når transfektert med HIF1β RNAi, den EYFP intensitet indusert av HIFα OE ble sterkt redusert (figur 4b-d). Det er verdt å merke seg at i de RNAi eksperimenter utført i en high-throughput-plattform, celler viste tilsvarende intensitet på tvers av brønner i den samme behandlingsgruppen (figur 4b-d). Disse eksperimentene demonstrerer anvendeligheten og følsomheten til 6U-HBR-konstruksjon i en high-throughput-plattformen. Følsomheten av konstruksjonen til både HIF1α og HIF2α ble ytterligere bekreftet ved resultatene når banket ned individ HIFα eller HIFs med forskjellige kombinasjoner i HeLa-celler (Figur S3). Til sammen viser vi at reporteren er direkte sensing HIF signalering i cellene.
6U-HBR HeLa celler transfektert med sirnas mot tre HIFs (HIF1α, HIF1β og HIF2α) er EYFP negativ etter hypoksi, demonstrert av både mikros (øvre panel a-d) og resultatene FACS (nedre panel e og f). Lik mengde celler (5 × 10
4) ble belagt i kultur retter og mikroskopi og FACS-analyse ble utført etter 2 dager etter siRNA transfeksjon.
a) 6U-HBR konstruere i A549 er aktiveres enten med ndHIF1α eller ndHIF2α, men ikke med tom vektorkonstruksjon. b-d) HIF1β siRNA alene reduserer i stor grad fluorescerende signaler forårsaket av ndHIF1α /ndHF2α over-uttrykk (ndHIFα OE) i HeLa-celler, noe som indikerer at EYFP signalene er reversible ved å manipulere nivåene av HIF faktorer. Begge mikroskopi bilder (b) og fluorescerende kvantifisering (c og d) vises.
I pattedyr embryogenese og utvikling, vev utvikle seg i en microenviroment med ulike nivåer av oksygen. Det har vist seg at hypoksi, på den ene side er avgjørende for hjerte formasjon [27], [28], [29] og endochondrial bendannelse [30], [31], [32], [33]; Men på den annen side, den svekker fettvev utvikling [34], [35] og hud myofibroblast differensiering [36]. Gitt den kritiske rollen HIF signalering i hypoksi, er en grunnleggende spørsmålet om cellene får vevsspesifikke svar på deres lave oksygen miljøet ved forskjellig regulering HIF veien. For å finne ut hvordan celler fra forskjellige vev opprinnelse svare på hypoksi i form av HIF nivåer og aktiviteter, undersøkte vi 5 6U-HBR karsinom cellelinjer, nemlig 786 + VHL fra nyrecelle adenokarsinom, A549 fra lungekarsinom, ME180 fra epidermoid carcinoma in cervix , U251 fra glioma, og HeLa fra cervical adenokarsinom. Celler ble inkubert i forskjellige oksygennivåer (20%, 5%, 3%, 2%, 1% eller 0,3%) i 4 dager, og den gjennomsnittlige 6U-HBR fluorescens ble bestemt ved FACS-analyse. Disse cellene kan ha vært forventet å oppføre seg på lignende måte i henhold til hypoksiske forhold på grunn av det faktum at de er tilpasset til dyrkningsforhold; imidlertid, observerte vi at de reagerte utpreget, under den samme grad av oksygen. For eksempel, ME180 og HeLa begge hadde liten respons på 3% oksygen, men når oksygennivået var under 3%, ME180 oppviste dramatisk økning av signalet, mens HeLa hadde relativt lav økning (figur 5). På den annen side signalet fra U251 øket langsomt ved 5% og 3% oksygen, mer dramatisk i 2% og 1% oksygen, og utpreget fortsatte å øke i og med 0,3% av oksygen (figur 5).
Fem kreft-cellelinjer infisert med 6U-HBR lentivirus ble dyrket under varierende grad av hypoksi, inkludert 20%, 5%, 3%, 2%, 1% og 0,3% for O
2. Deres EYFP intensiteter ble bestemt etter 4 dager i kultur ved FACS analyse. Graden av hypoksi presenteres som log relativ O
2 nivå til normoxia (20% O
2).
Vi ytterligere bekreftet at 6U-HBR signaler i disse cellelinjene korrelert med intracellulære HIF protein nivåer. Siden 1% oksygen miljø utviste den største forskjellen i 6U-HBR signaler mellom ME180, U251 og HeLa-celler, vi brukte dette nivået av oksygen for å bestemme HIF mRNA og protein. Mens HIF1α mRNA-nivåer var lik blant disse cellelinjene, HIF2α mRNA-nivåer varieres (fig S4), som var i overensstemmelse med en tidligere studie [2]. For protein nivå, må vi først viste at fire timer i hypoksi-indusert høyere HIF1α protein nivåer i ME180, U251 og A549 enn i HeLa og 786-O + VHL (figur 6a-b). Siden det har tidligere blitt rapportert at i langvarig hypoksi, forringer HIF1α protein mens HIF2α viser minimal endring [37], hypotese vi at ikke bare de totale HIF protein nivåer, men også stabiliserings dynamikken i proteiner er ansvarlig for ulike 6U-HBR reporter aktiviteter i disse cellelinjene. Vi analyserte derfor forskjellene i nedbrytningskinetikken til HIFα proteiner i alle fem cancercellelinjer in 1% oksygen. Denne analysen viste at HIF1α i HeLa-celler er mindre stabilt under langvarig hypoksi enn i noen andre celletyper analysert (figur 6c og d). Når man sammenligner HIF2α nivåer i 1% hypoksi versus normaxia, er forskjellen mellom disse fem cellelinjer redusert i forhold til de totale proteinnivå og degraderingsmønster (figur S5). Imidlertid, mens ingen HIF1α protein ble observert i 786-O + VHL-celler, ble HIF2α protein indusert i hypoksi i denne cellelinjer, explaning respons av denne cellelinje til den 6U-HBR reporter (figur S5; figur 5). Til sammen viser dataene at høyere nivåer av mer stabile HIFα proteiner er observert i ME180, A549 og U251 forhold til HeLa og 786-O + VHL celler, støtter funnene avdekket ved 6U-HBR reporter at disse fem cellelinjene vise distinkte HIF aktiviteter i samme grad av hypoksi.
a) HIF1α i ME180, U251, A549, HeLa og 786-O + VHL celler underkant av 1% O
2 i 4 timer. b) Kvantifisering for HIF1α protein vist i a). Kvantifisering ble utført på skannede filmbilder hentet fra separate vestlige blotter. c) HIF1α nivåer og d) kvantifisering i ME180, U251, A549, HeLa og 786-O + VHL celler underkant av 1% O
2 ved tre tidspunkter: 4 timer, 12 timer og 48 timer, sammenlignet med nivåene i henhold 20% O
2 som kontroller.
Vi valgte HeLa og ME180 for videre studier siden de begge er livmorhalskreft cellelinjer som viser svært forskjellige reaksjoner på hypoksi. For å forstå regulering av HIFα i disse to cervikale kreftcellelinjer, analyserte vi mRNA mikroarray data som tidligere er utført på disse cellelinjer i 2% hypoksi [38]. Interessant, identifiserte vi HSP90 mRNA forskjellig uttrykt mellom HeLa og ME180. Vi først validert dette funnet ved real-time PCR-analyse og viste at ME180 har høyere nivåer av HSP90 både i normoxia og hypoksi (figur 7). For å avgjøre om høyere nivåer av HSP90 i ME180 kan være årsaks for høyere HIF aktivitet, reduserte vi HSP90 binding til HIF1α i ME180 ved å inkubere cellene med 17-allylamino-demethoxygeldamycin (17-AAG) i 2% hypoksiske forhold. 17-AAG inhiberer ATP-binding til HSP90, og derved forhindre interaksjonen av HSP90 og dens målprotein [39]. Siden HSP90 interaksjon med HIF1α er vist å øke HIF1 stabilitet i hypoksi [11], bør 17-AAG redusere HSP90 avhengig HIF1 aktivitet. Følgelig 6U-HBR ME180 inkubert med 17-AAG viste lavere nivåer av 6U-HBR reporter aktivitet enn observert i kontrollgruppen (figur 8a). Videre er det mRNA-ekspresjon av målgen HIF1α CA9 ble signifikant redusert (figur 8b), hvilket antyder at HIF-aktivitet ble redusert i ME180 da HSP90 ble gjort inaktive. Disse data støtter hypotesen om at forskjellen i HSP90-nivå er årsaks for forskjellen i HIF aktivitet observert i de to cervikale kreftcellelinjer. Vi har utelukket muligheten for reduksjon av HIF aktivitet forårsaket av generelle transkripsjonsregulering i cellene ved å vise stabil ekspresjon av et endogent husholdningsgenet i begge celletyper (WYHAZ, figur 8c).
Celler ble enten inkubert på under 1% hypoksi eller 20% normoxia i 48 timer før kvantifisering av HSP90 mRNA nivå av real-time PCR. Feilstolpene er presentert som prøve feil av gjennomsnittet (SEM) fra tre uavhengige biologiske eksperimenter.
Resultater av tre uavhengige eksperimenter er oppsummert og feilstolpene er presentert som prøve feil av gjennomsnittet (SEM ). a) fluorescensstyrkene HeLa i DMSO, ME180 i DMSO og ME180 i 100 nM 17-AAG i 2% hypoksi er normalisert til det i 20% normoxia. b) De brettede forandringer av CA9 mRNA-nivåer normalisert til 20% normoxia i de celler antyder at forskjellen, i form av HIF-aktivitet, reduseres i nærvær av 17-AAG. c) Den stabile uttrykk for et annet husholdningsgenet, tyrosin 3-monooksygenase /tryptofan 5-monooksygenase aktivering protein, zeta polypeptid (YWHAZ), demonstrerer generelt normale transkripsjons aktiviteter i disse cellene behandlet enten med DMSO eller 17-AAG.
Diskusjoner
Her lager vi og karakterisere en roman HIF reporter konstruere, der EYFP uttrykk er regulert av tandem gjentakelser av minimal HIF1α og HIF2α bindingssteder. Ved anvendelse av celler som er infisert med lentivirus av HIF-HBR konstruksjon, viser vi at celler med 6 tandem gjentar som promotor i konstruksjonen (6U-HBR) gir bedre signal-til-bakgrunnsforhold enn de med 3 eller 12 gjentas. Også, i form av rapportørkinetikk, oppnår 6U-HBR konstruere et sterkere signal i ferd med å deoksygeneringen, mens celler med 6U-destabiliseres-HBR-konstruksjonen mer nøyaktig utregning av reduksjon av HIF nivåer i ferd med å reoksygenering. Videre gjennom siRNA studier mot HIF1α, HIF2α og HIF1β samt over-uttrykk studier av ndHIF1α og ndHIF2α, viser vi at konstruksjonen er HIF spesifikk og er i stand til å svare på både HIF1α og HIF2α. Utnytte 5 ulike kreftcellelinjer infisert med 6U-HBR konstruere, ser vi at ulike kreftcellelinjer har forskjellige EYFP signaler under de samme oksygennivået, som korrelerer med den totale mengden av HIF1 α og HIF2 a proteiner i disse cellelinjene.
Vi utnyttet reporter for å utforske forskjell i hypoksisk respons av HeLa og ME180 livmorhalskreftcellelinjer. Vi har observert at disse to kreftcellelinjer har forskjellige 6U-HBR signaler som korrelerer med mengden av HIFα proteiner som reaksjon på det samme nivå av hypoksi. På samme måte er de forskjellige virkemåter mellom HeLa og ME180 under hypoxi også observert i angiogen vekstfaktor uttrykk [40], [41], så vel som i proteosomet, histon deacetylase [42] og HSP90 handling [43]. Blant dem er HSP90 av spesiell interesse. I henhold til foregående analyse [43], viser vi at ME180 har høyere nivåer av HSP90 mRNA enn HeLa både henhold normoxia og hypoksi. Høyere basalnivå av HIF kofaktor HSP90 i ME180 kunne bidra til den observerte høyere HIF-aktivitet, siden HSP90 binding til HIF er blitt rapportert å beskytte mot HIFα VHL-uavhengig degradering [9], [11]. Lavt oksygennivå inaktivere PHD /VHL avhengig nedbrytning av HIF, som resulterer i stabilisert og aktiv HIF transkripsjonsfaktor. Imidlertid er HIFα til slutt nedbrutt i hypoksiske forhold. Dette VHL-uavhengig nedbrytning av HIF1α har vist seg å være RACK1 avhengig [11]. HSP90 konkurrerer med RACK1 binding til HIF1α, og dermed beskytter HIF1α mot hypoksisk degradering. I foreliggende undersøkelse, viser vi at ME180-celler har høyere nivåer av HSP90 og mer stabile HIFα proteiner sammenlignet med HeLa (figur 6). Vi viser videre at reduksjon av HSP90 i ME180 minsker differansen av HIF nivå og aktivitet sammenlignet med HeLa. Disse dataene tyder på at forskjellige HSP90-nivå kan være kausal for de ulike HIF aktivitetsnivå observeres i de to cervikale kreftcellelinjer i henhold til den samme grad av hypoksi. Det vil være interessant å teste i fremtiden hvorvidt oksygen /PDH /VHL-uavhengig HIFα nedbrytning er generelt nøkkelen regulator av HIF aktivitet forskjellene som ble observert i cancercellelinjer under samme grad av hypoksi.
Det er kjent at cervikale kreftceller er ofte infisert med en onkogen-type humant papillomavirus (HPV), og HeLa omformes av HPV18 mens ME180 av HPV68. HPV av forskjellige typer varierer i ekspresjon og regulering av de to primære HPV-onkogener, E6 og E7 [44], som er tilstrekkelig til å endre HIF-1α nivå. HPV11 E6 og HPV31 E6 kan stimulere HIF-1α uttrykk som en konsekvens av ubiquitin-avhengig nedbrytning av p53 [45], mens HPV16 E7 kan samhandle med en Cullin-2-ubikvitin-ligase kompleks som medierer VHL-avhengig nedbrytning HIFα [46]. Det vil være interessant å avdekke i fremtiden om ulike reaksjoner på hypoksi observert i HeLa og ME180 er assosiert med den type onkogene HPV de er smittet med.
I denne studien rapporterer vi en roman HIF reporter konstruksjon innehold tandem gjentakelser av minste HIF bindingsseter oppstrøms EYFP kodende sekvens. Vi viser at signalet fra reporteren er HIF avhengig og korrelerer med de cellulære HIF proteinnivåer i forskjellige cellelinjer. Ved å benytte denne nye konstruksjon, finner vi overraskende en variant av HIF-aktivitet i forskjellige cancercellelinjer under samme grad av hypoksi. Denne romanen HIF reporter konstruksjon kan tjene som et verktøy for å raskt definere HIF aktivitetsnivå og derfor terapeutisk antall potensielle HIF repressors i enkelte kreftformer.
Materialer og metoder
Celler, vev kultur og hypoksi induksjon
HeLa og ME180 (livmorhalskreft), A549 (lungekreft), U251 (glioma) celler var fra American Type Culture Collection (Rockville, MD). 786-O-celler transfektert med villtype VHL ble oppnådd fra Dr. William G. Kaelin Jr (Dana-Farber Institute, Boston, MA). Kreftceller ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplementert med penicillin, streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS, Invitrogen, Carlsbad, CA). Celler ble vedtatt med Trypsin /EDTA (Invitrogen, Carlsbad, California) da de nådde 80% samløpet.
Hypoksi induksjon
Cellene ble dyrket i multi-gass inkubatorer (Sanyo, San Diego, CA ). Nitrogengass ble tilført til kamrene for å fremkalle et styrt redusert prosentandel av oksygen. For normoxia, ble cellene dyrket i kuvøser inneholdende 5% CO
2 og atmosfærisk konsentrasjon av O
2, ca 20% til 21% O
2. Gjennom dette papiret «normoxia» ble omtalt som 20% O2.
Lentiviral plasmid konstruksjon
Vi ga HIF reporter konstruere med HIF1α konsensus bindingssetet CGTG fulgt HIF2α nettstedet TACGTG sammen som en enhet av bindingssetet for HIFα faktorer, og gjentatt dem i tandem 12 ganger (12U-HBR), med 5 basepar av nukleotider av forskjellige kombinasjoner avstand mellom. Induksjon element CACAG, et element som er nødvendig for hypoksiske induksjon DNA, ble jevnt satt inn hele sekvenser tre ganger for å bistå i induksjonsprosessen. De endelige HIF-bindende sekvenser ble direkte syntetisert av Integrated DNA Technologies, Inc, Coralville, Iowa (figur S1). TK minimal promoter etterfulgt av 770 bps β-globin intronsekvenser og EYFP ble forsterket fra pBARL plasmid (courtesy of Dr. Randall Moon laboratorium, University of Washington, Seattle, Washington) og knyttet til HIF-bindende sekvensen ved fusjon PCR. De HIF-TK-EYFP sekvensene ble ytterligere ligert inn en lentiviral plasmid pRRL-cPPT-X-PRE-SIN [47] (courtesy of Dr. William Osborne laboratorium, University of Washington, Seattle, Washington) mellom Clal og Xhol nettsteder. 6U-HBR og 3U-HBR ble konstruert på samme måte, med unntak av HIF-bindende sekvenser bare inneholde seks bindende repetisjoner (6U-HBR) eller tre repetisjoner (3U-HBR). Å bygge opp 6U-HBR-destabilisert versjon, ble mus ornitindekarboksylase 422-461 domenesekvenser første forsterket fra Plasmid M38 TOP-dGFP (courtesy of Dr. Randall Moon laboratorium) og deretter settes inn 6U-HBR konstruere gjennom Mlul nettstedet etter 3 «av EYFP sekvens.
Lentivirus produksjon og stabil transduksjon av cellelinjer
lentiviral plasmider ble transfektert inn FT293 cellelinjer (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) ved kalsiumfosfat transfeksjon å produsere lentiviral partikler. Spesielt overføring plasmid (12U-HBR, 6U-HBR, 3U-HBR, eller 6U-HBR-destabilisert konstruere), emballasje plasmid, VSVG plasmid og REV plasmid ble transfektert sammen på 23:15:8:11.5 forhold, og 25 mikrogram av blandet plasmider ble transfektert per 150 mm plate med 1 ml av 2X HBS og 0,1 ml 2,5 M CaCl
2. Etter transfeksjon ble mediene skiftet etter 24 timer og virale supernatantene ble høstet og filtrert etter 72 timer. For å oppnå konsentrerte virus, ble de virale supernatantene ytterligere sentrifugert ved 6100 rpm i 17 timer ved 4 ° C. Bunnfallet ble resuspendert i 1 x TBS (50 mM Tris * HCl, pH 7,4 og 150 mM NaCl) og deretter lagret i -80 ° C før bruk. Å omsette cellelinjer med virus, ble passende mengde av viruset direkte tilsatt til mediet med tilstedeværelse av hexadimethrine bromid ved 4 ng /ml (polybren, Invitrogen Inc, Carlsbad, CA), og media ble endret etter 24 timer.
fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) analyse
Celler som skal bli analysert ble trypsinert fra platene, sentrifugert ned og deretter fiksert i 4% paraformaldehyd i minst 30 minutter før analyse. Standardinnstillingene ble påført på cellesortering med passende kanal spenninger og minst 30.000 celler ble analysert for hvert eksperiment. FITC kanalen ble brukt til å oppdage EYFP fluorescens. FlowJo (Tre Star, Inc. Ashland, Oregon) ble ansatt for å visualisere data og FITC verdier ble definert som det geometriske gjennomsnittet av florescence intensitet EYFP positiv befolknings for hypoksiske prøver. For prøvene inkubert i 20% O
2, de intensiteter ble definert som det geometriske gjennomsnittet av florescence intensiteten EYFP av den totale befolkningen (EYFP negativ).
Ikke-nedbrytbart HIF (ndHIF) over uttrykket
for å få konstitutivt stabil uttrykk HIFα protein, ndHIF over-uttrykker plasmider (Addgene plasmid 19005 og 19006) ble brukt, hvor to Proline nettstedene til HIF cDNA ble endret til alanin som beskrevet tidligere [48]. Retrovirus laget fra disse plasmider ble infisert inn i HeLa og A549 cellelinjene i nærvær av hexadimethrine bromid ved 4 ng /ml (polybren, Invitrogen Inc. i Carlsbad, CA), og media ble endret etter 24 timer. Over-uttrykk for HIF1α og HIF2α ble bekreftet av vestlige blotter som vist i figur S6.
siRNA mot HIF-analysen
sirnas mot HIF faktor var gave fra Dr. Zhan Zhang [38]. sirnas ble transient transfektert inn i celler på seks-brønns plate med Lipofectamine 2000 (Invitrogen Inc. Carlsbad, California) etter Lipofectamine 2000 instruksjon.
