Abstract
Innledning
cytokinresistent indusert drepeceller (CIK celler) er en heterogen undergruppe av ex-vivo-ekspandert T-lymfocytter som er kjennetegnet med et MHC-ubegrenset tumordrepende aktivitet og en blandet t-NK fenotype. Adoptiv overføring CIK-celler, en av de adoptiv immunterapi utgjør en lovende ikke-toksisk anticancerterapi. Men i kliniske studier, er den terapeutiske aktivitet av adoptiv CIK celler overføringen ikke så effektiv som forventet. Mulige forklaringer er at unormal tumor blodkar og hypoksisk svulstens mikromiljø kunne hindre infiltrasjon og effekt av lymfocytter. Vi antok at antiangiogenesis terapi kan forbedre antitumor aktivitet av CIK celler ved å normalisere tumor blodkar og moduler hypoksisk svulstens mikromiljø.
Metoder
Vi kombin rekombinant humant endostatin (rh-endostatin) og CIK celler i behandlingen av lunge karsinom murine modeller. Intramikroskopi, dynamisk kontrastforsterket magnetisk resonanstomografi, immunhistokjemi, og flowcytometri ble brukt til å undersøke svulsten blodkar og hypoksiske mikromiljøet samt infiltrasjon av immunceller.
Resultater
Våre resultater indikerte at rh-endostatin synergized med adoptiv CIK celler overføre til å hemme veksten av lungekarsinom. Vi fant ut at rh-endostatin normalisert tumor blodkar og redusert hypoksisk område i svulsten mikromiljøet. Hypoksi vesentlig hemmet proliferasjonen, cytotoksisitet og migrering av CIK-celler in vitro og hindret homing av CIK celler til tumor parenchyma ex vivo. Videre fant vi at behandling med rh-endostatin betydelig økt homing av CIK celler og redusert opphopning av undertrykkende immunceller i svulstvev. I tillegg kombinasjonsterapi produsert høyere nivå av tumor-infiltrasjons lymfocytter sammenlignet med andre behandlinger.
Konklusjoner
Våre resultater viser at rh-endostatin forbedrer den terapeutiske effekten av adoptive CIK celler terapi mot lungekarsinomer og avdekke mekanismene for den synergistiske antitumor effekt, noe som gir en ny begrunnelse for å kombinere antiangiogenesis behandling med immunterapi i behandling av lungekreft
Citation. Shi S, Wang R, Chen Y, Song H, Chen L, Huang G (2013) kombinere Antiangiogen Behandling med Adoptiv Cell Immunterapi utøver Bedre Antitumor effekter i ikke-småcellet lungekreft Models. PLoS ONE 8 (6): e65757. doi: 10,1371 /journal.pone.0065757
Redaktør: Juri G. Gelovani, Wayne State University, USA
mottatt: 01.12.2012; Godkjent: 29 april 2013; Publisert: 14 juni 2013
Copyright: © 2013 Shi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Grant nummer~~POS=HEADCOMP: 81101739) og China International Medical Foundation (Grant nummer~~POS=HEADCOMP: CIMF-F-H001-023). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er en av viktigste årsakene til kreft-relaterte dødsfall [1]. De fleste lungekreftpasienter er diagnostisert ved avanserte stadier (III eller IV) og ulike behandlinger har dukket opp, inkludert kjemoterapi, strålebehandling, target terapi og immunterapi. CIK celler er heterogene cellepopulasjoner avledet fra humant perifert blod eller milt mus etter in vitro-ekspansjon med interferon-γ, interleukin-2 og anti-CD3-antistoffer [2]. CIK-celler medierer potent MHC-ubegrenset cytotoksisitet mot en rekke tumorceller og kan gjenkjenne og drepe tumorceller uten tidligere eksponering eller grunning. Det er to hoved subpopulasjoner kan skilles i hoveddelen kultur in vitro ekspanderte CIK-celler, en co-uttrykte CD3 og CD56-molekyler (CD3
+ CD56
+), mens den andre presentere et CD3
+ CD56
– fenotype. Antitumoraktiviteten av CIK-celler er blitt rapportert å være i hovedsak begrenset til CD3
+ CD56
+ celler [3]. Adoptiv overføring CIK-celler, en av de adoptiv immunterapi utgjør en lovende ikke-toksisk anticancerterapi ved behandling av faste tumorer ildfaste på konvensjonell terapi. Men i kliniske studier, er den terapeutiske aktivitet av CIK celler overføringen ikke så effektiv som forventet [4]. Effektiv adoptiv celle overføring står overfor en rekke utfordringer som systemisk immuntoleranse og tumor lokal immun flukt. Homing av immunceller til tumorstedet er redusert og antitumorimmunfunksjoner inhiberes av tumormikromiljø og immunomodulerende egenskaper av suppressive cellepopulasjoner [5], [6]. Således er det presserende å finne en effektiv behandling for å forbedre den adoptive overføringen cellen effekt for derved å forbedre den kliniske effekten av kreftpasienter.
Det er foreslått at effektiviteten av celle-baserte immunterapi vil kunne påvirkes av integriteten av tumorvaskulaturen og immunundertrykkende tumor mikromiljøet [7]. Hypoksi er et kjennetegn på unormal metabolske miljøet i solide svulster. Bortsett fra for å være involvert i redusert strålingsfølsomhet og motstandsdyktighet overfor kjemoterapi, og hypoksi dukket opp som en betydelig faktor av immuntoleranse i svulsten mikromiljøet [8], [9], [10]. Flere bevislinjer antydet at antiangiogenesis forbigående normalisert tumor vaskulaturen, redusert intratumor hypoksi og økt lymfocytt-infiltrering inn i tumoren, noe som ga en begrunnelse for å kombinere antiangiogenesis behandling med adoptiv immunterapi celle [11], [12]. Antiangiogenesis terapi har vært rapportert å øke den antitumor effekt av kjemoterapi, strålebehandling og immunterapi i begge dyremodeller og i det menneskelige [13], [14], [15], [16]. Endostatin er et 20-kDa-fragmentet av type XVIII kollagen, er i stand til å redusere proliferasjon, migrering og invasjon av endotelceller ved å interagere αvβ1, -αvβ3, og αvβ5 intergrins på overflaten av humane umbilikalvene endotelceller (HUVECs) [17]. I fase I og fase II kliniske studier i USA, endostatin viste mindre sidestykke antitumor respons selv om ingen uønskede bivirkninger ble funnet. Rh-endostatin brukt i denne studien er en modifisert form av endostatin med en ekstra ni aminosyresekvens som dannet en annen hans-kodestrukturen og har blitt godkjent for klinisk bruk av staten Food and Drug Administration i Kina for behandling av avansert ikke-småcellet lungekreft i 2005 [18]. Det har blitt bevist at rh-endostatin kan forbedre pasientenes fremgang overlevelse i avansert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) med kombinasjon av kjemoterapi i randomiserte studier. Vi har tidligere vist at rh-endostatin kan forbedre antitumor effekt av paklitaxel i behandlingen av lunge-karsinom [19]. Rh-endostatin er blitt rapportert å øke radioresponse for human carcinoma ved å forbedre den hypoksiske tumormikromiljøet [8], [20]. Men inntil nylig, er det lite informasjon tilgjengelig i litteraturen om antitumoreffekten av å kombinere rh-endostatin med adoptiv immunterapi celle. Vi gjennomførte denne forskningen for å finne ut om rh-endostatin kan forbedre antitumor effekt av adoptiv CIK celler overføring og for å illustrere mulige mekanismer som rh-endostatin utgitt det fulle potensialet av adoptivcelleterapi. Våre funn viser at rh-endostatin kunne forbedre antitumor effektene av CIK celler og foreslo at kombinasjonsbehandling med rh-endostatin og CIK celler holdt store løftet i behandling av avansert stadium lungekreftpasienter.
Metoder
Etikk erklæringen
Animal studien ble utført i henhold til retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr i Jinling Hospital. Protokollen ble godkjent av dyreetikk komité Jinling Hospital (NO. 2010062412). Alle operasjoner ble utført under pentobarbital natrium og ketamin anestesi og dyrene ble avlivet ved overdose av bedøvelse. Alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelse. Humane blodprøver ble samlet inn fra informerte givere og prosedyren ble utført i henhold til framgangsmåten godkjent av Ethic Komiteen Jinling Hospital. Blodprøve givere har gitt sin skriftlige informert samtykke til å delta i denne studien.
Cellelinjer
Murine Lewis lunge carcinoma celler, human lunge adenokarcinomceller A549 og SPC-A1 ble kjøpt fra Shanghai Institute of biokjemi og cellebiologi (Shanghai, Kina). HUVECs ble kjøpt fra KeyGen Biotech (Nanjing, Kina). Murine Lewis lunge carcinoma celler [19] ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (Invitrogen, USA) supplert med 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml Streptomycin og 10% føtalt bovint serum. Humane lunge adenokarsinomceller A549 [8] og SPC-A1 [21] ble opprettholdt i vårt laboratorium og dyrket i RPMI-1640 (Gibaco, USA) supplert med 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml Streptomycin og 10% føtalt kalveserum . HUVECs [22] ble dyrket i F12K (Mediatech) supplert med 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 10% FBS, 0,1 mg /ml heparin, 0,03 mg /ml endotelial cellevekst supplement (Sigma Aldrich). Alle celler ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2.
dyremodeller
SPF C57BL /6 mus og BALB /C nakne mus (6-8 uker gamle) ble kjøpt fra Academy of Military Medical Science (Beijing, Kina), holdt i komparativ medisin Institutt for Jinling Hospital og oppvokst under kontrollert temperatur og luftfuktighet, og en 12-timers mørk, 12-timers lys syklus med steril mat og vann ad libitum. Vi etablerte tre dyremodeller i denne studien. To menneskelige lunge adenokarsinom xenograft-modeller ble etablert ved subkutan inokulering av A549 celler og SPC-A1-celler (1 x 10
6 /il PBS) henholdsvis inn i den høyre flanken til BALB /c nakne mus. For det tredje tumormodell, ble C57BL /6 mus utfordret subkutant i høyre flanke med 1 x 10
6 Lewis lunge carcinoma celler i 100 ul PBS. Subkutane tumor volum ble målt daglig av kaliper og tumorvolum ble beregnet ved formelen:. Tumorvolumet = 0,52 × lengde × bredde
2
Generation og Cellular Phenotype Analyse av CIK Cells
de humane CIK cellene ble samlet som tidligere beskrevet [23]. I korthet, ble blodprøver fra samtykkende donorer behandles ved hjelp av Ficoll-Hypaque-tetthetsgradient-sentrifugering (Beijing Chemical Reagents Company, Kina) for å separere perifere mononukleære blodceller. Etter vasking i mediet, ble cellene resuspendert i RPMI-1640-medium (10% FCS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin) ved en tetthet på 2-4 x 10
6 celler /ml. 1000 U /ml interferon-γ (Peprotech, USA) ble tilsatt på den første dag av kulturen. Etter 24 timer, 500 U /ml interleukin-2 (Peprotech, USA) og 50 ng /ml anti-CD3-antistoff (eBioscience, USA) ble tilsatt. Celler ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 og ble sub-dyrket hver 2-3 dag med friskt komplett medium med 300 U /ml interleukin-2 (Peprotech, USA) i 2 uker. Generering av mus CIK celler fra miltceller ble drevet lik den til humane CIK celler. For å karakterisere de fenotyper av CIK-celler, celler dyrket i 7, 14 og 21 dager ble høstet og farget i 30 minutter ved 4 ° C med følgende FITC eller PE-konjugerte monoklonale antistoffer (mAbs): anti-CD3 og anti- CD56. Ved flowcytometri, ble ekspresjonen av overflatemarkører, CD3, CD56 undersøkt og (fig. S2) som er registrert. Alle antistoffer ble oppnådd fra (eBioscience, San Diego, CA) ved anvendelse av standardprosedyrer. En total på 100.000 celler per prøve ble kjøpt og analysert på en FACS-Calibur og Cellquest programvare (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).
Behandling Protocol
BALB /C hårløse mus ble utfordret subkutant i høyre flanke med 100 ul (1 × 10
7 /ml) A549 celler. Når tumorvolum var omtrent 100 mm
3, dyrene ble tilfeldig delt inn i fire grupper (n = 4-5 per hver gruppe), og behandlinger ble igangsatt. Dagen da behandlingen startet ble utpekt d0. Den antiangiogenesis terapi i denne studien var subkutan injeksjon av 5 mg /kg rh-endostatin i 7 dager og adoptiv immunterapi besto av to intravenøs transfusjon av CIK celler på d6 og d9 (2 × 10
7 celler per dose i en total volum på 100 ul). De detaljerte grupperinger var som følger (fig S1.): (1) gruppe NS, behandlet med normal saltløsning (NS). (2) Gruppe EN, behandlet med rh-endostatin alene. (3) Gruppe CIK, behandlet med CIK celler alene. (4) Gruppe EN + CIK, behandlet med rh-endostatin fulgt av overføring av CIK celler. Kroppsvekt og tumorvolum ble målt daglig. Synergismen av to behandlinger ble vurdert i henhold til følgende formel:. Q = E
A + B /[E
A + (1-E
A) E
B] [24]
E
A + B, inhiberingshastigheten av kombinasjonsbehandling.
E
A, inhiberingshastigheten av rh-endostatin antiangiogen terapi.
E
B, inhiberingshastigheten av adoptiv CIK celler immunterapi
q. 0,85 betyr de to behandlingsformer er antagonisme
q .. 1.15 betyr de to behandlingsformer er synergisme
0.85≤ q ≤1.15 betyr at de to behandlinger er additiv.
forsøket ble gjentatt med fire grupper av C57B /6 mus som bærer Lewis-lungekarsinom og fire grupper av BALB /c nakne mus som bærer SPC-A1 lungekarsinom.
Kultur betingelser
hypoksisk inkubasjon tilstand ble utført i en fuktet, anaerob arbeidsstasjon inkubator (Bug Box; ALC International, Cologno Monzese, Milano, Italia). En gassblanding av 1% O
2, 5% CO
2, og 94% N
2 ble kontinuerlig injisert ved en strømningshastighet på 25 l /min inn i den anaerobe arbeidsstasjonen kuvøse. For den normoksiske tilstand, ble cellene dyrket ved 37 ° C i en fuktet inkubator bestående av 20% O
2, 5% CO
2, og 75% N
2. Alle reagenser inkludert mellomstore og plastmaterialer som brukes til de hypoksiske behandlinger ble likevekt i anaerob kammer for å redusere forurensning med luft.
karboksyfluorescens diacetat succinimidylester (CFSE) Merking
Merking av CIK celler med CFSE ble utført som tidligere rapportert [25]. I korte trekk ble humane CIK-celler merket med CFSE (Molecular Probes Biotec., Endelig konsentrasjon på 5 pmol /l i PBS) og inkubert i 37 ° C i 6 minutter. Merkingsreaksjonen ble stoppet ved tilsetning av kald RPMI-1640 med 10% FCS, og cellene ble vasket to ganger med PBS med 2% FCS for å fjerne overskudd av CFSE.
Suppression of Proliferation Assay
CIK cellene ble dyrket i RPMI-1640 medium (10% FCS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin) i 96-brønners plater i henhold normoxia eller hypoksi. Anti-CD3-antistoff og interleukin-2 ble tilsatt til mediet for å stimulere delingen av CIK celler. Førtiåtte timer senere, ble CIK cellene telles ved hemocytometry under lett mikroskop.
In vitro Cvtotoksisitetsmålinq
Cytotoksisiteten for CIK cellene mot målceller i normoksisk og hypoksiske forhold ble analysert ved hjelp CytoTox 96 ® ikke radioaktivt Cvtotoksisitetsmålinq-laktatdehydrogenase utgivelsen analyse (Promega, Madison, WI, USA). Kort sagt ble A549-cellene som er lagt inn i to 96-brønners plater med 1 x 10
5-celler /brønn og inkubert i 48 timer med CIK celler ved 20:01, 40:1 effektor-til-mål (E-til-T ) forholdstall. Et volum på 30 pl cellekultursupernatant ble overført til transparente flatbunnede 96-brønners plater, etterfulgt av tilsetning av 30 pl substrat. Etter inkubering i 30 minutter i mørke ved romtemperatur ble reaksjonen stoppet ved tilsetning av 30 ul stoppløsning. Deretter ble absorbansen ble målt ved 490 nm. Den maksimale frigjøring av LDH ble utført ved fullstendig å lyserende målceller. Målceller eller effektorceller alene ble brukt som negative kontroller (spontan frigjøring). Den dreper hastigheten ble bestemt i henhold til formelen: drepe rate (%) = [(eksperimentelle teller – effektor kontrolltelling -target spontane teller) /(mål maksimal teller – målet spontane teller)] × 100
Sjele. analyse~~POS=TRUNC
Sjele analysen ble utført med Transwell ™ (Costa, USA) inserts som inneholder HUVECs kultur. HUVECs ble tilsatt til det øvre kammer og inkubert i henhold til normoksisk eller hypoksisk tilstand i 24 timer, henholdsvis. Totalt 1 x 10
6 CIK-celler i 200 pl RPMI-1640-medium ble deretter tilsatt på HUVECs lag med A549-celler kultur supernatant tilsatt i det nedre kammer, og ble deretter inkubert i henhold til normoksisk eller hypoksiske betingelser i 48 timer, respektivt . CIK cellene som migrerte inn i det nedre kammer ble høstet og tellet ved hemocytometry.
Immunocytochemistry
Etter inkubering i hypoksisk eller normoksiske dyrkingsbetingelser i 48 timer, HUVECs ble fiksert med 70% etanol i 10 min og permeabilisert med 0,1% TritonX-100 i 5 minutter. 5% BSA i PBS ble anvendt for å blokkere ikke-spesifikk binding av antistoffer. Anti-ICAM-1-antistoff (Abcam, Cambridge, MA) og anti-VCAM-1 antistoff (Abcam, Cambridge, MA) ble anvendt for å detektere ekspresjon av intercellulære celle adhesjonsmolekyl-1 (ICAM-1) og vaskulær endotelial celle adhesjon molekyl-1 (VCAM-1) ved HUVECs. Bilder ble ervervet ved hjelp Olympus BX-60 mikroskop på 400 × forstørrelse.
CIK celler Adhesjon til endotelceller in vitro
Subkonfluente monolag av HUVECs i seks-brønns plater preinkubert i hypoksisk eller normoksiske dyrkingsbetingelser i 48 timer. Etter preinkubering CIK celler (2 × 10
6 celler /brønn) ble overført til HUVECs kulturer og ruges i 24 timer under samme kultur tilstand som HUVECs. Frittliggende celler ble fjernet ved to grundige vaskinger ved bruk av PBS og de gjenværende cellene ble farget med kanin-anti-muse-CD3-antistoffer (Abcam, Cambridge, MA) for å detektere CIK celler. Bilder av heftende celler ble anskaffet ved hjelp av Olympus BX-60 mikroskop ved 200 x forstørrelse.
Tumor Hypoksi Måling
hypoxyprobe ™ -1 kit (Natural Pharmacia International, Inc, Burlington, MA, USA, som utgjøres av 100 mg fast stoff pimonidazole HCI (hypoxyprobe ™ -1) og 1,0 ml mus lgG1 monoklonalt antistoff (Mab1)) ble anvendt for ytterligere å studere effekten av rh-endostatin på tumor hypoksi. Grunnlaget for denne måling er som pimonidazole reduktivt aktivert når vevet pO
2 er under 10 mmHg og de aktiverte mellomformer stabile kovalente addukter med tiolgrupper i proteiner, peptider og aminosyrer. Disse addukter kan detekteres ved immunokjemiske midler når de er kombinert med antistoffreagenset Mab1. For tumordeteksjon hypoksi ble mus belastet med A549 lungekarsinom gitt 60 mg /kg kroppsvekt pimonidazole HCl (hypoxyprobe ™ -1) intraperitonealt 4 timer før den ble avlivet ved tre forskjellige tidspunkter (dagene 3, 6, 9). Svulster ble dissekert og fiksert i 10% formalin, innstøpt i parafin og deretter farget med en mus IgG
1 antistoff. Bilder av delene ble kjøpt ved hjelp av Olympus BX-60 mikroskop på 100 × forstørrelse og hypoksiske områder ble analysert ved hjelp av digital bildeanalyse programvare Bilde J (NIH, Maryland, USA).
In vivo Sporing av CIK Cells
Syv dager etter administrering av rh-endostatin, ble A549 tumorbærende mus transfundert iv med CFSE-merkede CIK-celler (2 x 10
7-celler i et totalvolum på 100 ul). Normal saltløsning ble anvendt som negativ kontroll (n = 4 dyr per gruppe). Tjuefire timer etter CIK celler overføring, ble musene avlivet og enkeltcellesuspensjoner av milten og svulstvev ble fremstilt fra to grupper. Analyse av prosentandelen av CFSE-merkede CIK-celler ble utført på en FACS-Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Ti tusenvis gated hendelser ble samlet og analysert ved hjelp av Cellquest programvare (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).
flowcytometrisystemer
Syv dager etter behandlingen av rh-endostatin, tumorbærende C57BL /6 mus ble avlivet. Svulster og milt ble høstet og enkeltcellesuspensjoner ble forberedt. Erytrocytter ble fjernet etter inkubasjon i erylysis buffer [155 mmol /l NH4CI, 10 mmol /l KHCO3, og 0,1 mmol /L EDTA (pH 7,4)] ved romtemperatur i 10 min. Celler ble farget i 30 minutter ved 4 ° C med følgende FITC eller PE-konjugerte monoklonale antistoffer (mAbs): anti-CD11b og Gr-1 for myeloid-avledet suppressorceller (MDSCs), anti-F4 /80 og MHC /II for tumorassosierte makrofager (TAM). Alle antistoffer ble oppnådd fra (eBioscience, San Diego, CA) ved anvendelse av standardprosedyrer. En total på 100.000 celler per prøve ble kjøpt og analysert på en FACS-Calibur og Cellquest programvare (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).
intraMikrosKopi og vaskulær permeabilitet analysen
A549 tumor-bærende mus ble behandlet med rh-endostatin (5 mg /kg, sc) for etterfølgende 7 dager med normal saltløsning som kontroll. På dag 3, 6 og 9, ble musene bedøvet ved intraperitoneal administrering av pentobarbitalnatrium (40 mg /kg kroppsvekt) og ketamin (20 mg /kg kroppsvekt). I korthet, mus ble holdt varm ved hjelp av varmeputer i hele den kirurgiske prosedyren. Et lag av huden (12 mm) rundt tumoren ble kirurgisk fjernet for å skape et observasjonsvindu. Etter tilsetning av steril PBS, ble en tynn steril kontaktlinse benyttes for å dekke det kirurgiske området, og gir visuell adgang til det vaskulære nettverk av tumoren (fig. S3A). Etter operasjonen ble musen plasseres under fluorescens mikroskop og interesserte blodkar ble observert. Etter intravenøs injeksjon av 20 mg /kg Evans Blue-farge (Sigma-Aldrich, USA), ble fordelingen løpet av Evans blå registreres i ca 10 minutter. Bloduttredelse av Evans blå ble analysert i den innspilte videoen. Dataene ble bekreftet av Evans blå ekstraksjon test etter opphør av intravital mikroskopi undersøkelse.
Immunohistochemistry
C57BL /6 mus ble utfordret subkutant i høyre flanke med Lewis lungekarsinom celler. Når tumorvolumene var ca. 100 mm
3, Dyrene ble tilfeldig delt inn i fire grupper i henhold til behandlingsprotokollen, og behandlingene ble initiert på dag 0. På dag 14 ble tumorene fra alle eksperimentgrupper fjernes og tumorprøver ble løst i 4% formalin og innstøpt i parafin for immunhistokjemi studier. Tilstøtende 3-um snitt ble laget og farget med hematoksylin og eosin (H E). Kanin-anti-muse-CD3-antistoffer (Abcam, Cambridge, MA) ble benyttet for å påvise T-lymfocytter. Bilder av delene ble kjøpt ved hjelp av Olympus BX-60 mikroskop ved 200 × og 400 × forstørrelse. Antallet CD3
+ T-lymfocytter ble oppnådd ved å telle CD3-positive fargede celler. Minst ti tilfeldig felt ble evaluert for hver seksjon av to observatører uavhengig av hverandre. Consensus resultater ble brukt for den endelige antall T-lymfocytter.
immunfluorescens
A549 tumorprøver ble fiksert i 4% formalin, innstøpt i parafin og tilgrensende 3-mikrometer seksjoner ble gjort for immunfluorescens studier. Lysbilder ble deparaffined i xylen og rehydrert i graderte ethanols og skylles i dH
2o. Objektglass ble kokt i 2 minutter i sitratbuffer (Zymed), avkjølt i 15 minutter og deretter vasket i PBS i 5 minutter. Prøvene ble inkubert i en time i en blokkeringsløsning, og deretter inkubert med primære antistoffer ved 4 ° C over natten. Rotte-anti-muse-CD31-antistoffer (1:50; Abcam, Cambridge, MA) ble benyttet for å farge vaskulære endotelceller, kanin-anti-muse-alfa-glattmuskel aktin (α-SMA) antistoffer (1:200; Abcam, Cambridge, MA) ble brukt til å farge pericytes. Tumorvev var dobbelt-farget med anti-CD31 antistoff og anti-α-SMA antistoffer. Objektglass ble deretter skylt i PBS og inkubert i sekundære antistoffer i 2 timer ved romtemperatur i mørket. Sekundære antistoffer ble geite-anti-rotte-FITC-konjugert antistoff og geite-anti-kanin-antistoffer TRITC. Objektglass ble deretter skylt i PBS. Bilder av delene ble tatt til fange. Mikrovaskulær tetthet (MVD) ble bestemt som beskrevet tidligere av to observatører uavhengig [26]. I korte trekk, ble seksjonene vist ved lavere forstørrelse (100 ×) for å identifisere de ti områdene som inneholder flest kapillærer og små venules. Innenfor det valgte området, CD31-positive farget endotelceller (MVD) og CD31 /α-SMA dobbel-farget fartøyer ble telt ved en forstørrelse på × 400.
Dynamic Contrast Forbedret Magnetic Resonance Imaging (DCE-MRI)
A549-tumor-bærende mus ble behandlet med rh-endostatin (5 mg /kg, sc) for etterfølgende 7 dager med normal saltløsning som kontroll. På dag 3, 6 og 9, ble musene bedøvet og DCE-MRI ble utført. DCE-MRI ble utført ved hjelp av en 3 tesla hele kroppen MR-scanner (Siemens Symphony) i kombinasjon med et lite dyr spole for eksitasjon og signalmottak. Morfologiske MR-avbildning ble utført ved hjelp av en tverrgående T2-vektet turbo-spin ekko sekvens (repetisjon tid, TR 650 ms, ekko tid, TE 24 ms, synsfelt, FOV 70 x 70 mm2, skivetykkelse 2 mm). T1 kart over tumoren seksjonen ble oppnådd med 3 Flip vinkler (5 grader, 15 grader og 30 grader), og T1-verdier ble beregnet ved kurve estimering. Kinetics av kontrastmiddelet i tumorer ble registrert med en T1-vektet inversjon-flash sekvens (TR 5 ms, TE 2 ms, skivetykkelse 5 mm, FOV 55 x 70 mm2). Etter å ha startet DCE-MRI måling, 0,1 ml (0,1 mmol /kg) av det paramagnetiske kontrastmiddel gadolinium dietylen-triamin penta-eddiksyre (Gd-DTPA) (Bayer-Schering Pharma) ble injisert manuelt i løpet av 5 s i halevenen , 70 dynamiske skanner ble kjøpt fra en del. Data ble analysert ved anvendelse av farmakokinetisk modell som tidligere rapportert, og parametriske bilder av K
trans (volumet konstant overføring av kontrastmidlet) ble fremstilt ved analyser av den DCE-MRI serie [27].
statistisk analyse
data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardfeil (SE). Forskjeller mellom fire grupper ble sammenlignet med ANOVA, og LSD ble søkt om flere midler sammenligninger. De single-måling sammenligninger mellom to gruppene ble testet ved hjelp av uparede t-tester. Pearson korrelasjonsanalyse ble brukt til å teste sammenhengen mellom intra-tumor hypoksi og MDSC akkumulering. Verdier av p 0,05 ble tatt som betydelig. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS programvare 16,0 (Chicago, IL, USA).
Resultater
Morfologi Observasjon og Cellular Phenotype av CIK Cells
Under mikroskopi, CIK celler viste cluster-lignende vekst. Masser av CIK celler gradvis multiplisert og ble større etter 4 dager inkubasjon. Det er to hoved subpopulasjoner av CIK celler, en uttrykker både CD3 og CD56 molekyler (CD3
+ CD56
+) og den andre presentere en CD3
+ CD56
– fenotype. Etter inkubasjon i 7, 14 og 21 dager, ble fenotyper av CIK celler detektert. Prosentandelene av CD3
+ CD56
+ CIK-celler var 8,93%, 23,66% og 17,17% på dag 7, 14 og 21, henholdsvis (fig. S2).
Kombinasjon av rh-endostatin med Adoptiv CIK Cells Overfør Betydelig hemmer veksten av lungekarsinom in vivo
for å avgjøre om tillegg av rh-endostatin har noen synergistisk effekt på antitumor effekt av CIK celler ble tre representative tumormodeller etablert. I A549 lungekarsinommodell, fant vi at RH-endostatin litt begrenset tumorvekst sammenlignet med NS kontroll, men nådde ikke statistisk signifikans (929,46 ± 471,70 vs 1251,8 ± 531,75, p = 0,324). CIK celler adoptiv terapi alene hadde ingen antitumor aktivitet sammenlignet med NS-kontroll (1192,1 ± 621,68 vs. 1251,8 ± 531,75, p = 0,852). Tvert imot, signifikant (p 0,05) anti-tumoraktivitet ble observert etter kombinasjonsterapi sammenlignet med monoterapi eller NS kontroll (Fig 1A.). E
A = 1,35, E
B = 1,05, E
AB = 2,08 og q = 2,71, noe som bekrefter vurdering av synergisme. Lignende resultater ble observert i etablerte Lewis og SPC-A1 lungekarsinom modeller. I SPC-A1 lungekreft modell, sammenlignet med NS kontroll, rh-endostatin (1152,8 ± 181,4 vs 1284,7 ± 229,2, p = 0,527) og CIK (1204,1 ± 536,2 vs 1284,7 ± 229,2, p = 0,698) monoterapi viste ingen signifikant antitumor effekt. Imidlertid signifikant antitumoreffekt ble oppnådd i kombinasjonsterapi (p 0,05) (figur 1B.). I Lewis lungekarsinom, verken rh-endostatin (3394,7 ± 668,4 vs 3866,5 ± 490,62, p = 0,176) og heller CIK celler terapi (3429,6 ± 579,12 vs 3866,5 ± 490,62, p = 0,208) alene viste tydelig hemning på tumorvekst sammenlignet med NS kontroll. Imidlertid ble signifikante synergistisk antitumoreffekt vises når rh-endostatin ble tilsatt til CIK terapi (2037,0 ± 294,6 3866,5 ± vs 490,62, p = 0,000) (Fig. 1C). In vivo forsøk ble gjentatt to ganger. Og lignende resultater ble fikk i tre forskjellige lungekarsinom modeller som alle antydet at synergiantitumor effekt ble oppnådd ved å kombinere av rh-endostatin antiangiogen terapi og CIK celler adoptiv terapi.
BALB /C nakne mus ble injisert subkutant med A549 lungecancerceller og når tumorvolumene nådde 100 mm
3, mus ble delt inn i fire grupper tilfeldig og fikk respektive protokoller i henhold til behandlingsskjemaet. SPC-A1 og Lewis lunge carcinoma xenotransplantater ble etablert og gitt lignende behandlinger. A, synergistisk anti-tumor effekt ble vist når rh-endostatin ble kombinert med CIK adoptiv terapien til å undertrykke A549 tumorvekst (p 0,05). Rh-endostatin eller CIK behandling alene ikke signifikant undertrykke tumorvekst. B, rh-endostatin oppviste en betydelig antitumor effekt når gitt i kombinasjon med CIK-celler ved inhibering av SPC-A1 lungekarsinom (p 0,05). C, synergistisk anti-tumor effekt ble vist når rh-endostatin ble kombinert med CIK adoptiv terapien til å undertrykke Lewis lungekarsinom vekst (p 0,05). Poeng, hjelp av tumor volumer av mus per gruppe; Barer, SE. Resultatene som vises er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Rh-endostatin Reduserer Mikrovaskulær Tetthet og Fremmer Tumor Vessel Normalisering
I vår forrige undersøkelse, fant vi at mikrovaskulær tetthet ble redusert og kollagen dekning ble økt med rh-endostatin i murine Lewis-lungekarsinom bærende C57BL /6-mus [19]. I denne studien ble mikrovaskulær tetthet (MVD) evaluert i A549 tumorbærende mus. På dag 3, 6 og 9, ble mus fra hver gruppe avlivet og tumorprøver ble fremstilt for immunofluorescens farging. Kolonner, mener; Kolonner, mener; Kolonner, mener; Kolonner, mener; Kolonner, mener;
