Abstract
Bakgrunn
CagA cellulær interaksjon via aktivering av ERK signalveien kan være et utgangspunkt i utviklingen av magekreft. Denne studien forsøkte å vurdere om gener involvert i ERK nedstrøms signalveier aktivert av CagA er mottakelige genetiske markører for magekreft.
Metoder
I discovery fasen, totalt 580 SNPs innenfor + /-5 kbp av 30 kandidatgener ble genotypet for å undersøke en sammenheng med magekreft risiko i den koreanske Multisenter senter~~POS=TRUNC Cancer Cohort (100 hendelsesmagekreft kasus-kontrollsett). De vesentligste SNPs (rå eller permutert
p
verdi 0,02) identifisert i oppdagelsen analysen ble revurdert i forlengelsen fase ved hjelp ubetinget logistisk regresjonsmodell (400 magekreft kasus-kontrollsett). Kombinert analyser inkludert pooled- og meta-analyse ble utført for å oppsummere alle resultatene.
Resultater
24 SNPs i åtte gener (ERK, Dock180, C3G, Rap1, Src, CrkL, Mek og Crk) var signifikant assosiert med magekreft risiko i den enkelte SNP analyser i discovery fasen (
p
0,05). I forlengelsen analyser, ERK rs5999749, Dock180 rs4635002 og C3G rs7853122 viste marginalt betydelige virkninger gen-dose for magekreft. Konsekvent, slutt kombinert analyse presenterte SNPs som signifikant assosiert med magekreft risiko (OR = 1.56, [95% CI: 01.19 til 02.06], OR = 0,61, [95% KI: 0,43 til 0,87], OR = 0,59, [95 % KI: 0,54 til 0,76], henholdsvis)
Konklusjoner
Våre funn tyder på at ERK rs5999749, Dock180 rs4635002 og C3G rs7853122 er genetiske determinants i magekreft
Citation.. : Yang JJ, Cho LY, Ma SH, Ko KP, Shin A, Choi BY, et al. (2011) onkogene CagA Fremmer Gastric Cancer Risk via Aktivere ERK signalveier: En Nøstet case-control studie. PLoS ONE seks (6): e21155. doi: 10,1371 /journal.pone.0021155
Redaktør: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore
mottatt: 22 juli 2010; Godkjent: 21 mai 2011; Publisert: 16 juni 2011
Copyright: © 2011 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av en bevilgning fra Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi [KRF-2007-313-E00175] og [NRF-2009-0066258]. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Helicobacter pylori (
H. pylori
) er en bevist årsak til magekreft [1]. Ikke desto mindre kan dets absolutte effekten endres ved individuelle mottagelighet risikofaktorer, slik som genetiske varianter og
H. pylori
virulente egenskaper [2], [3]. Cytotoxin-assosiert antigen (CagA), en
H. pylori
av immun, er en avgjørende faktor for individuell følsomhet og er assosiert med alvorlige kliniske utfall inkludert magekreft [4], [5], [6]. I mage epitelceller, forstyrrer CagA med ulike signaloverføringsveier, for eksempel Dock180-Rac1-WAVE-Arp2 /3, C3G-Rap1-BRAF-MEK, Sos1-HRAS-Raf1, og Ras-Raf-MEK-ERK signal [3 ], [7], [8], [9]. Signaler modifisert med CagA indusere cellulære endringer som apoptose, proliferasjon og celle dødelighet, og stimulere mage karsinogenese [10], [11], [12].
Blant flere nedstrøms-trasé aktiveres av CagA, den ekstracellulære signal -regulated kinase (ERK) kaskade er en kjerne sti som den spiller en viktig rolle i magekreftutvikling. CagA cellulære interaksjoner med Src, SHP2, Crk, CrkL eller GRB2 er signifikant assosiert med ERK-aktivering, og forskjellige andre proteiner som er involvert i CagA signale er intimt forbundet med ERK-signalveier [10], [11], [12], [13] . Proteiner kan reguleres ved vertsgener; Derfor kan gener som koder for proteiner knyttet til CagA og ERK signal prosessen være viktig for magekreftutvikling, men få studier har fokusert på disse genetisk polymorfisme.
CagA onkogenisitet kan være et utgangspunkt i utviklingen av magekreft via aktivering av ERK-reaksjonsveien signal. Disse signal transductions ser ut til å bli modifisert av verts genetiske varianter. Dermed hypotese vi at gener involvert i ERK nedstrøms signalveier aktivert av CagA kan være mottakelige genetiske markører for magekreft. For å vurdere denne hypotesen, gjennomførte vi en flertrinns genetisk tilknytning studie som inkluderte 1) discovery fasen: en kandidat genet analyse som fokuserte på 30 gener, CRK, CrkL, CSK, GRB2, c-Met, NFATC4, PTPN11, SMS, SOS1 , Src, ERK, FAK, PLCγ, KRAS, NRAS, BRAF, RAF1, MAP2K1, MAP2K3, MAP2K4, MAP2K5, MAP2K6, p21, Dock180, Rac1, RAP1, WAVE, Arp2, Arp3 og C3G, involvert i CagA og ERK signal transduksjon vei, og 2) med forlengelse som undersøkte de mest betydelige SNPs identifisert i oppdagelsen analyse.
Metoder
Study befolkningen
Discovery fase.
oppdagelsen kandidat genet analysen var en populasjonsbasert nested case-control studie innenfor den koreanske Multi-Center Cancer Cohort (KMCC). Fra 1993 til 2004 har KMCC rekruttert totalt 19,688 deltakere fra fire urbane og rurale områder i Korea. Alle deltakere fullførte detaljerte standardiserte spørreskjemaer ved personlig intervju etter informert samtykke. Blod- og urinprøver ble også samlet inn. Gjennom rekord bindinger til den nasjonale dødsattesten, helseforsikring medisinske poster databaser og det nasjonale kreftregister, ble alle deltakerne passivt fulgt opp, og nydiagnostiserte tilfeller ble konstatert. Detaljert informasjon om KMCC er beskrevet andre steder [14]. I desember 2005, 249 magekrefttilfeller definert i henhold til internasjonale statistiske klassifikasjonen av sykdommer og beslektede helseproblemer 10. revisjon (ICD-10, C16) ble identifisert. Tilfeller diagnostisert før rekruttering (n = 52), med ingen blodprøver (n = 35), eller utilstrekkelig DNA-nivå under 50 ng /mL (n = 62) ble ekskludert. Kreftfrie kontroller ble matchet av alder (± 5 år), kjønn, boligområde, og påmelding år. Til slutt ble 100 sett med magekrefttilfeller og matchede kontroller definert.
Extension fase.
1) I desember 2008, 95 nye magekrefttilfeller ble også konstatert fra KMCC. Disse sakene og 116 saker som ble ekskludert i oppdagelsen kohorten grunn av utbredelsen status eller utilstrekkelig DNA-konsentrasjonen ble inkludert i forlengelsesfasen (n = 211). Ved bruk av samme tilpasningsmetode som discovery fasen, ble 211 kontroller valgt. 2) Gastric krefttilfeller ble hentet fra to universitetssykehusene i Korea som var Chungnam universitetssykehus og Hanyang Universitets GURI Hospital. Fra mars 2002 til september 2006, ble totalt 490 mage kreftpasienter nylig diagnostisert på sykehusene. Deres epidemiologiske data og venøst fullblodprøver ble oppsamlet på tidspunktet for diagnose eller før magekreft kirurgi. Blant dem var 189 tilfeller med tilstrekkelig DNA-prøver og informert samtykke også inkludert i forlengelsesslangen. Dessuten ble 189 community-baserte kontroller matchet etter alder (± 5 år) og kjønn fra KMCC fagene registrert etter 2000.
Etikk erklæringen
De studieprotokoller for KMCC studien, sykehuset basert studie og gjeldende nested case-control studie ble godkjent av institusjonelle gjennomgang boards (IRB) fra Seoul National University Hospital og National Cancer Center of Korea (H-0110-084-002 og C-0603-161-170) og av Institutional Review board of Hanyang universitetssykehus (IRB nr. 2003-4).
Gene og SNP utvalg
Gjennom litteraturgjennomgang, identifisert vi 30 kandidat gener som kan være involvert i CagA signaltransduksjonsbane knyttet til ERK nedstrøms signalisering ved direkte interaksjon med CagA eller sekundær ømhet i CagA gensekvenser [3], [7], [8], [9], [10], [11], [12]. De 30 kandidat gener er som følger: v-Crk sarkom virus CT10 onkogen homolog (
CRK
); v-Crk sarkom virus CT10 onkogen homolog (fugleinfluensa) -lignende (
CRKL
); c-Src tyrosinkinase (
CSK
); vekstfaktor reseptor-bundet protein 2 (
GRB2
); Møtte proto-onkogen (c-
MET
); nukleær faktor av aktiverte T-celler, cytoplasma, kalsineurin-avhengige 4 (
NFATC4
); protein tyrosin fosfatase, ikke-reseptor typen 11 (
PTPN11
); Spermine syntase (
SMS
); sønn av sevenless homolog 1 (
SOS1
); v-Src sarkom (Schmidt-Ruppin A-2) viral onkogen homolog (
SRC
); elg-relaterte tyrosinkinase (
ERK
); fokale vedheft kinase 1 (
FAK
); fosfolipase C-gamma (
PLCγ
); v-Ki-ras2 Kirsten rotte sarkom viral onkogen homolog (
KRAS
); neuroblastom RAS viral (v-ras) onkogen homolog (
NRAS
); v-raf muse sarkom viral onkogen homolog B1 (
BRAF
); v-raf-en murine leukemi virus-onkogen homolog 1 (
RAF1
); mitogen-aktivert protein kinase kinase 1 (
MAP2K1
); mitogen-aktivert protein kinase kinase 3 (
MAP2K3
); mitogen-aktivert protein kinase kinase 4 (
MAP2K4
); mitogen-aktivert protein kinase kinase 5 (
MAP2K5
); mitogen-aktivert protein kinase kinase 6 (
MAP2K6
); cyclin-avhengig kinase inhibitor 1A (
p21
); dedicator av cytokinese 1 (
Dock180
); ras-relaterte C3 botulinumtoksin substrat 1 (
Rac1
); RAP1A medlem av RAS onkogen familie (
RAP1
); VAR protein familie, medlem 1 (
WAVE
); ARP2 aktin-relatert protein 2 homolog (
Arp2
); ARP3 aktin-relatert protein 3 homolog (
Arp3
); Rap guanin nukleotid utveksling faktor (GEF) 1 (
C3G
).
Genotyping
Discovery fase.
Genotyping ble utført ved hjelp av genom-wide menneske SNP Array 5,0 i henhold til standard protokoll anbefalt av produsentens instruksjoner [15]. Før genotyping, ble konsentrasjoner av genomisk DNA for alle forsøkspersonene målt ved hjelp av et spektrofotometer (Nanodrop ND-1000, Nanodrop Technologies). For hvert individ ble analysert, ble 250 ng genomisk DNA spaltet med et restriksjonsenzym (Nsp I eller Sty I). Selv om vi skjermet totalt 580 SNPs innenfor +/- 5 kbp av de 30 målgenets steder, ble 103 polymorfismer ekskludert på grunn av en SNP takst på mindre enn 95% eller en HWE verdi mindre enn 0,0001. Fordi genom-wide menneskelig SNP Array 5.0 ble produsert basert på en kaukasiske befolkningen, hadde 115 SNPs ikke oppfyller kriteriene for MAF 0,05 i asiater og ble også ekskludert. I tillegg ble 20 saker og 14 kontroller ekskludert på grunn av utilstrekkelig genomisk DNA ( 250 ng), sex disharmoni eller dårlig genotyping ( 90%). Til slutt ble 362 SNPs i 30 gener (genotyping sats på 99,5%) genotypet i 81 saker og 85 kontroller. Klyngen bilder av signalintensitet ble anmeldt for alle SNPs
Extension fase
Syv SNPs med rå eller permutert
p
verdi. . 0.02 (rs5999749, rs9418677, rs4635002, rs10901081, rs7853122, rs530801, rs747182) identifisert i oppdagelsen analysen ble genotypet ved hjelp av Illumina VeraCode Golden analysen med BeadXpress henhold til produsentens protokoll (Illumina, San Diego, CA, USA) [16]. For å sikre påliteligheten av de to genotyping metoder, ble 135 prøver (59 tilfeller og 76 kontroller) genotypede to ganger av både genom-wide menneskelig SNP Array 5.0 og Illumina VeraCode Golden analysen, og samstemmighet var 98,2%. Av de 7 SNPs, ble rs9418677 ekskludert på grunn av en SNP takst 95%. To tilfeller og 40 kontroller med lav DNA tilgjengelighet (n = 15) eller genotyping takst 90% (n = 27) ble også utelatt i analysen. Til slutt ble seks SNPs i fem gener (genotyping sats på 99,1%) analysert i 398 tilfeller og 360 kontroller i forlengelsesfasen.
H. pylori Hotell og CagA deteksjon
H. pylori
smittestatus og CagA seropositive ble evaluert ved hjelp av immunoblot analyse, Helico Blot 2.1 ™ (MP Biomedicals Asia Pacific, Singapore). Helico Blot 2.1 ™ kits har rapportert en sensitivitet på 99% for begge
h.pylori Hotell og CagA seropositive og en spesifisitet på 98% for
H. pylori Hotell og 90% for CagA seropositive [17].
Statistisk analyse
Hardy-Weinberg likevekt (HWE) i kontrollgruppen ble evaluert av Fishers eksakte test med en kutt av nivået på HWE. 0,0001
i primær skanningen i oppdagelsen sett, sammenhengen mellom individuelle SNPs og magekreft ble evaluert basert på både rå og permutert
p
-verdier bruker LRT med en grad av frihet i trenden (additive) modell. Trenden testen forutsetter en dose-respons-effekt med et økende antall variant alleler. Permutert
p
-verdier ble estimert med 100.000 permutasjon tester. Basert på den additive modellen, ble magekreft risiko beregnet som odds ratio (ORS) og 95% konfidensintervall (CIS) med ubetinget logistisk regresjonsmodell justert for risikofaktorer som ble røykestatus (noensinne
vs.
Aldri)
H. pylori
infeksjon (positiv
vs.
negativ) og CagA seropositive (positiv
vs.
negativ). Den Benjamini-Hochberg falske funnrate (BH-FDR) korrigert
p
-verdier på hver SNP ble beregnet å unngå falsk tilknytning til falske positive resultater [18].
I forlengelsen fase, de mest betydelige SNPs med rå eller permutert
p
verdi 0,02 identifisert i discovery fasen ble re-evaluert. Basert på den additive modellen, ble magekreft risiko estimeres ORS og 95% CI’er bruker ubetinget logistisk regresjonsmodell justert for risikofaktorer som ble røykestatus (noensinne
vs.
Aldri),
H. pylori
infeksjon (positiv
vs.
negativ) og CagA seropositive (positiv
vs.
negativ). For å oppsummere resultatene fra oppdagelsen og utvidelsen analyser, data-pooling og meta-analyse ble gjennomført. Oppsummerings ORS og 95% CI’er ble beregnet ved hjelp av en fast effekt modellen og heterogenitet ble evaluert av Cochran Q statistikk [19].
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SAS programvareversjon 9.1 (SAS Institute, Cary, North Carolina) og plink programvareversjon 1.06 (https://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink) [20]. Meta-analyser ble utført ved bruk av STATA versjon 10 (Stata, College Station, TX).
Resultater
Tabell 1 oppsummerer grunnleggende egenskapene til deltagerne i hver fase. Gastric krefttilfeller viste signifikant høyere forekomst av CagA seropositive (
p
= 0,03 i discovery fasen,
p
= 0,09 i forlengelse og
p
= 0.02 blant totalt fag) .
H. pylori
infeksjon, Vaca seropositive og røykestatus var også høyere blant mage krefttilfeller (tabell 1).
I det primære skanning av oppdagelsen sett, av de 362 SNPs valgt fra CagA relatert gener i signaltransduksjonsbane, 24 SNPs i åtte gener, ERK, Dock180, C3G, Rap1, Src, CrkL, Mek og CRK, var signifikant assosiert med magekreft risiko i enkelt SNP-analyse (
p
0,01). Disse SNPs viste betydelige gen-dose effekter i den lineære trenden test og var signifikant assosiert med økt risiko for magekreft (OR = 2,83, [95% KI: 1,42 til 5,65] for ERK rs5999749 ELLER = 1,90 [95% KI : 01.18 til 03.05] for Dock180 rs9418677). Bortsett Dock180 rs9418677 og Rap1 rs17028287, ble de fleste SNPs nedstrøms fra CagA-Crk signal (Dock180, C3G, Rap1 og Mek) signifikant assosiert med en redusert risiko for magekreft (tabell 2).
I utvidelsen fasen, alle assosiasjoner mellom de valgte SNPs og magekreft ble relativt dempet. ERK rs5999749, Dock180 rs4635002 og C3G rs7853122 viste signifikant gen-dose effekt for magekreft (OR = 1,40, [95% KI: 1,04 til 1,89]; OR = 0,65, [95% KI: 0,44 til 0,94]; OR = 0,61, [95% KI: 0,46 til 0,81], henholdsvis). I den endelige kombinert analyse som inkluderte oppdagelsen og utvidelse analyser, ble risikoestimater av ERK rs5999749 signifikant assosiert med magekreft i både den samlede analysen og meta-analyse (OR = 1,57, [95% CI: 01.20 til 02.07], ELLER = 1,56 [95% CI: 01.19 til 02.06], henholdsvis). Videre Dock180 rs4635002 og C3G rs7853122 viste signifikant redusert risiko for magekreft i begge analysene (OR = 0,60, [95% KI: 0,42 til 0,84], OR = 0,61, [95% KI: 0,43 til 0,87] for Dock180 rs4635002 ELLER = 0,59, [95% KI: 0,45 til 0,77], OR = 0,59, [95% KI: 0,45 til 0,76] for C3G rs7853122). Det var ingen heterogenitet på tvers av studiene (Cochran Q test,
p
0,05), bortsett rs10901081 (
p
= 0,040) (tabell 3)
diskusjon
i vårt flertrinns genetisk analyse, tre SNPs, ERK rs5999749, Dock180 rs4635002 og C3G rs7853122, viste sterke assosiasjoner med magekreft og kan være viktige regulatoriske faktorer i CagA signaltransduksjonsbane.
Ekstracellulær signalregulerte kinase (ERK), også kjent som mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK), er et viktig integrasjonspunkt for flere cellulære signaler som regulerer forskjellige onkogene responser. ERK-signalveien kommuniserer med et betydelig antall av substrater, inkludert proteinkinaser, fosfataser, cytoskeletal komponenter, apoptose-regulatorer, og en rekke andre signaleringsrelaterte molekyler [21]. CagA signalering er en av de som er involvert i ERK signal kaskade strømmer. Tallrike studier har rapportert at CagA-positive
H. pylori
kan aktivere ERK i mage epitelceller å fremme upassende cellulære funksjoner [11], [21], [22], [23]. Videre fremmer samhandling mellom CagA og signaltransduksjon proteiner ERK signal i forbindelse med Ras, Mek og NF-kB, indusere magekreftutvikling. I cellulære mekanismer, synes ERK å være involvert i en rekke forskjellige cellulære prosesser. Således kan verts genet av ERK-proteinet være mer viktig for å bestemme protein ekspresjon og kapasitet. Resultatene av denne studien viser at ERK rs5999749 er først og fremst valgt på SNP basert analyse og beholder sin sterke assosiasjon med magekreft i den endelige kombinerte analyser. Dette støtter at dens genetiske effekten kan spille en avgjørende rolle i mage karsinogenese lik sin protein aktivitetsnivå på cellestadiet.
Dock180, synonymt med en dedicator av cytokinese 1, er et 180 kDa protein nedstrøms-kombinere molekyl av Crk og up-regulator av Rac1 [24]. Den modulerer en rekke funksjoner, inkludert cellespredning, cellemigrering, og aktin cytoskeletal organisasjon gjennom aktivering av Rac1 [24], [25], [26], [27], [28]. Dette proteinet er ett av de Crk-nedstrøms proteiner som er involvert i kaskaden av CagA og Crk signalisering gjennom de Crk-Codk180-Elmo veien [9]. Tilsvarende C3G kjent som Rap guanin nukleotid utveksling faktor (GEF) 1 (RAPGEF1) også samhandler med Crk [29]. Tidligere studier har vist at den Crk-C3G-Rap1 signale kan aktivere ERK kaskade og indusere apoptose, cellevekst, migrasjon, heft og dødelighet [30], [31], [32]. I human carcinogenesis, synes C3G genet for å spille en avgjørende rolle i seg selv. Endring av C3G genetisk aktivitet via amplifikasjon eller metylering er forbundet med flere cancertyper slik som lunge-, mage- og gynekologisk kreft [33], [34]. Selv om det ikke akkurat godt kjent hvorvidt genetiske varianter av Dock180 og C3G genet er knyttet til magekreftutvikling, antyder vår studie flere SNPs i disse genene, spesielt rs4635002 og rs7853122 er signifikant assosiert med risiko for magekreft, og dermed kan være en mottakelig genet i utviklingen av magekreft.
Basert på dagens resultater og gjennomgang av cellulære mekanismer [3], [9], [11], [21], [22], [23], [24], [30], kan CagA onkogenisitet indusert ved aktivering av ERK signal veien bli infered (figur 1). Den CagA samspill med bindende molekyler som Src, Crk, GRB2 og SHP-2 stimulerer nedstrøms signalene i ERK kaskade knyttet til avvikende cellulære funksjoner som fører til magekreftutvikling. Under denne prosessen kan de genetiske effektene av ERK, Dock180 og C3G spiller avgjørende roller lik sine protein aktiviteter. Disse resultatene gir støtte til genetisk og cellulær betydningen av disse molekylene.
CagA samhandling kan stimulere nedstrøms signaler i ERK kaskade knyttet til avvikende cellulære funksjoner som fører til magekreftutvikling. I denne prosessen, de genetiske effekter av ERK, Dock180 og C3G spiller avgjørende roller lik sine protein aktivitetsnivå på cellestadiet.
Vår genetisk analyse presentert troverdig bevis på genetiske varianter av ERK signaltransduksjon veien aktiveres av CagA, men flere begrensninger bør bemerkes. Først antall forsøkspersonene var utilstrekkelig for å sikre statistisk styrke til å vurdere den nøyaktige sammenhengen mellom utvalgte SNPs og magekreft risiko. For det andre, på grunn av den lille størrelsen på utvalget og mangel på hjerte mage kreftpasienter (mindre enn 5%), kunne vi ikke gjennomføre stratifisert analyse i henhold til magekreft type, hjerte
vs.
Ikke-kardiale. Derfor resultatene bør tolkes med forsiktighet.
Denne studien viser at gener som er involvert i ERK signaltransduksjonsbane aktiveres av CagA kan endre risikoen for magekreft. ERK, kan Dock180 og C3G gener spiller en viktig rolle i utviklingen av magekreft. Replication studier i andre populasjoner vil tillate oss å belyse magekreft patologiske mekanismer. Ytterligere biologiske studier som fokuserer på disse genene kan avklare sine roller i magekreftutvikling.
