Abstract
Bakgrunn
vaskulære endotelceller bidrar til patogenesen av mange menneskelige sykdommer ved aktivt å regulere stromal betennelsesreaksjon; Men lite er kjent om rollen endothelial betennelse i veksten av humane svulster og dens innflytelse på prognosen av kreft hos mennesker.
Metoder
Ved hjelp av en eksperimentell modell av tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α) -mediert inflammasjon, karakterisert vi inflammatorisk genekspresjon i immunopurified tumorassosierte endotelceller. Disse genene dannet grunnlaget for en multivariat molekylær prediktor for total overlevelse som ble trent og validert i fire typer kreft hos mennesker.
Resultater
Vi rapporterer at uttrykk for eksperimentelt avledet tumor endotelceller gener fornem patologiske vevsprøver fra friske kontrollpersoner i en rekke menneskelige sykdommer forbundet med kronisk betennelse. Vi trente disse genene i humane kreft datasett og definert en seks-genet inflammatorisk signatur som spådd betydelig redusert total overlevelse ved brystkreft, tykktarmskreft, lungekreft og glioma. Dette endothelial-avledet signatur spådd utfallet uavhengig av, men samarbeide med, standard kliniske og patologiske prognostiske faktorer. I samsvar med disse funnene, klimaanlegg kultur media fra humane endotelceller stimuleres av proinflammatoriske cytokiner akselerert vekst av menneskelige tykktarm og brystkreft svulster i immunodeficient mus sammenlignet med kondisjonert medium fra ubehandlede endotelceller.
Konklusjoner
Denne undersøkelsen gir den første prognostisk kreft gen signaturen utledet fra en eksperimentell modell for tumorassosiert endotel inflammasjon. Disse funnene støtter oppfatningen om at aktivering av inflammatoriske trasé i ikke-maligne tumor infiltrere endotelceller bidrar til tumorvekst og progresjon i flere kreft hos mennesker. Viktigere, disse resultatene identifisere endothelial-avledet faktorer som kan tjene som potensielle mål for terapi i ulike menneskelige kreft
Citation. Pitroda SP, Zhou T, Sweis RF, Filippo M, Labay E, Beckett MA, et al . (2012) Tumor endotel Betennelse Spår klinisk utfall i ulike kreft hos mennesker. PLoS ONE 7 (10): e46104. doi: 10,1371 /journal.pone.0046104
Redaktør: Sharon A. Glynn, National University of Ireland Galway, Irland
mottatt: 14 mars 2012; Godkjent: 28 august 2012; Publisert: 04.10.2012
Copyright: © Pitroda et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse studiene ble støttet av midler fra Virginia og DK Ludwig fond for kreftforskning (RRW), Lung Cancer Research Foundation (RRW), Chicago Tumor Institute (RRW), og hjernesvulst Program Project (PA1 CA 07193312) (RRW), i tillegg til , USA National Institutes of Health gir HL58064 (JGNG), HL98050 (JGNG), og HL105371 (JGNG) og en sjenerøs gave fra Foglia familien (RRW). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i løpet av det siste tiåret, har vår forståelse av tumorbiologi utvidet til å omfatte verts stromal elementer som viktige determinanter i malign transformasjon og progresjon [1]. Terapi som målretter stromale celler har, delvis, et resultat av den molekylære karakterisering av tumor-stromal interaksjoner. Det er mye som tyder på at stromal betennelse bidrar til proliferasjon og overlevelse av maligne celler, letter genomiske ustabilitet, stimulerer angiogenese og metastase, og endrer respons på anti-kreft terapier [2], [3]. Når kronisk produsert i svulsten mikromiljøet, er TNF-α en større mediator av inflammasjon stromal [3]. TNF-α er viktig i tidlige hendelser i tumorgenese, styring av en kaskade av cytokiner, kjemokiner, adhesjonsmolekyler, og pro-angiogene aktiviteter [2], [3]. De mest godt karakterisert handlingene til ondartet celle-avledet TNF-α er på vaskulære endotelceller. Vaskulære endotelceller aktivt delta i og regulere den inflammatoriske respons i både normale og syke vev [4], og nye data tyder på at endotelcellene direkte å påvirke tumor oppførsel [5] – [7]. Likevel er lite kjent om rollen endothelial betennelse i å fremme tumorvekst og dens innvirkning på prognose av kreft hos mennesker.
Gene uttrykk profilering av kliniske tumorer har ført til oppdagelsen av mange molekylære signaturer. En begrensning av dagens genuttrykk profilering studier er mangel på validering i uavhengige kliniske datasett [8], [9]. Viktigere, mange empirisk avledet kliniske signaturer er spesifikke for en enkelt krefttype og ofte ikke gir innsikt i relevante biologiske mekanismer som påvirker kreft prognose. Vi benyttet en eksperimentell modell for TNF-α-mediert betennelse å karakterisere inflammatorisk gen-ekspresjon i tumorassosierte endotelceller. I denne studien viser vi at induksjon av inflammatorisk gen-ekspresjon i tumorassosierte endotelceller akselererer veksten av humane svulster i betydelig grad. Spesielt, utlede vi den første kreft genet signatur forbundet med endothelial betennelse som spår klinisk utfall i fire typer kreft hos mennesker uavhengig av standard kliniske og patologiske prognostiske faktorer. Våre funn gir en ny biologisk avledet metode for kreft prognostication og foreslå mulige veier for utvikling av anti-kreft terapi rettet mot svulsten stroma.
Metoder
De metodene som brukes til kultur cellelinjer og etablere svulster hos mus er beskrevet i detalj i vedlegg S1, som er tilgjengelig med hele teksten i denne artikkelen på www.plosone.org. Tumor-assosiert endotelceller ble isolert ved hjelp av en trinnvis immunorensing av svulstvev (vedlegg S1 for detaljer). I korte trekk, ble dette utført ved klarering av hematopoetiske celler fra homogenisert i tumorvev ved inkubasjon med biotin-merket anti-CD19, anti-CD45 og anti-F4 /80, som var blitt separat forhånds bundet til streptavidin-bundet Dynabeads (Dynal; Lake Success, NY), fulgt av fjerning av de kule-bundne celler med et Dynal-50 magnet. Fc-Block (anti-CD16 /32-antistoffer) ble tilsatt til cellesuspensjonen for å forhindre ikke-spesifikk binding av Fc-reseptor-inneholdende celler i positiv seleksjon. Deretter ble anti-VE cadherin og anti-CD105 antistoff ble tilsatt for å binde endotelceller, som ble etterfulgt av tilsetning av streptavidin-koblede Dynabeads og tar med Dynal-50 magneten inntil bare kule-bundne celler forble i oppløsning. Metodene som brukes for RNA ekstraksjon, microarray datainnsamling og analyse, og kvantitativ real-time PCR er også beskrevet i vedlegg S1. Microarray data er tilgjengelig på Gene Expression Omnibus (GEO) [sjonsnummer: GSE33253] (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=dfyldgammaawwjw acc=GSE33253).
Patient Eksempeldata
Pasientinformasjon, inkludert både kliniske data og genuttrykk data ble innhentet fra flere uavhengige kilder. Genuttrykk datasett som representerer inflammatorisk tarmsykdom (GSE13367), revmatoid artritt (GSE12021), og skrumplever (GSE14323) ble lastet ned fra GEO. Disse datasett ble valgt på grunnlag av tilgjengeligheten av både syke og normale vevsprøver, samt å ha et stort antall prøver som er tilgjengelige ved tidspunktet for analyse. Genuttrykk datasett som representerer menneskelige brystkreft, tykktarmskreft, lungekreft og gliom ble lastet ned fra offentlig tilgjengelige repositories. Disse datasettene ble valgt basert på stort antall prøver, tilgjengeligheten av kliniske utfall data, og mangfoldet av tumortyper. For hver tumor type, ble trening og validerings kohorter konstruert. I brystkreft [10] (n = 295; Nederland Cancer Institute, https://bioinformatics.nki.nl/data.php) og tykktarmskreft [11] (n = 232; Vanderbilt Medical Center (VMC, Nashville, Tennessee) og H. Lee Moffitt Cancer Center (MCC, Tampa, FL); GSE17538 [177 fra MCC, 55 fra VMC]), ble tumorprøver tilfeldig delt inn i to deler (2/3 for trening og 1/3 for validering) ved hjelp datagenererte tilfeldige tall å tildele prøver til opplærings eller validerings kohorter. For glioma, distinkte datasett [12], [13] ble brukt til trening (n = 77, University of California i San Francisco og MD Anderson Cancer Center, GSE4271) og validering (n = 50; kanadiske hjernesvulst Tissue Bank (London, Ontario, Canada), Massachusetts General Hospital (Boston, MA), Brigham and Women Hospital (Boston, MA), og Charite «Hospital (Berlin, Tyskland)); https://www.broadinstitute.org/cgi-bin/cancer/datasets.cgi). Til slutt, for lungekreft [14], fire datasett (n = 441) var tilgjengelig fra et enkelt studie og separeres til trening (n = 257) og valideringskullene (n = 184) som ble beskrevet i den originale publikasjon. Disse datasett ble innhentet fra University of Michigan Cancer Center, Moffitt Cancer Center, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center og Dana-Farber Cancer Institute (tilgjengelig på https://caarraydb.nci.nih.gov/caarray/publicExperimentDetailAction.do? expId1 /41015945236141280. Kliniske kjennetegn ved pasientene som brukes til trening og validering er oppført i tabell S1.
Statistical Analysis
Affymetrix NetAffx Analysis Center ble brukt til å identifisere probe sett tilsvarende menneskelige ortologer av eksperimentelt avledet murine gener. Ingen spesifikke data preprosessering ble utført før Betydningen Analyse av mikromatriser (SAM) [15] ble brukt til å sammenligne uttrykk for den menneskelige ortologer i syke og normale vevsprøver. Differential uttrykk ble definert som en falsk funnrate (FDR) -adjusted p-verdi mindre enn 0,05 og fold-endre større enn 1,5. Gener forskjellig uttrykt i minst to av de tre datasettene som ble testet ble definert som gjensidig feilregulert. Hierarkisk clustering via Ward kobling regel med Euklidsk avstand beregning ved hjelp av JMP 7.1 (SAS Institute Inc .; Cary, NC) ble brukt til å visualisere genuttrykk forskjeller.
I hvert kreft trening datasett, ble univariate Cox proporsjonal hazard regresjon brukt for å vurdere sammenhengen mellom overlevelse og nivået av ekspresjon av gener avledet i den eksperimentelle mikromatriseanalyse som ble uttrykt forskjellig i datasett av humane sykdommer assosiert med kronisk betennelse. Seks av disse førti-ni gener hadde samstemmige regresjonskoeffisientene tvers av alle fire krefttyper. Uttrykk av hver enkelt gen var forbundet med en økt risiko for død. For disse seks genene, ble en lineær kombinasjon av genekspresjon verdiene vektet med regresjonskoeffisientene brukt til å beregne en risiko poengsum for hver pasient. Modellene og deres tilknyttede skalerings koeffisienter ble løst, basert på treningsgruppene, og deretter evalueres i validerings grupper (Tabell S2). Letting e
ki betegne uttrykk nivå av genet jeg for pasienten k, og la w
i betegne vekten for genet i, genet score for pasienten k er s
k = Σw
i ( e
ki-μ
i) /τ
i, hvor μ
i og τ
jeg er gjennomsnitt og standardavvik på genuttrykket verdier for genet jeg på tvers av alle prøvene i validering datasett. Pasientene ble klassifisert som å ha en høy risiko genet signatur eller en lav-risiko genet signatur, med median av risikoscore som terskelverdi. En høy score indikert et dårlig resultat. For hver univariate Cox analyse, ble kliniske og patologiske faktorer assosiert med dårlig total overlevelse identifisert blant de tilgjengelige faktorene gitt i datasettet. Faktorer signifikante på univariat analyse ble inngått multivariat Cox analyse. Total overlevelse ble analysert og sammenlignet med Kaplan-Meier metoden. Forskjeller i overlevelse ble testet for statistisk signifikans ved log-rank test. P-verdier på mindre enn 0,05 ble ansett for å indikere statistisk signifikans. Tosidig p-verdiene ble beregnet for trening datasett, mens en-tailed P-verdiene ble beregnet for testing datasett. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av JMP 7.1.
Resultater
Karakterisering av inflammatorisk genuttrykk i tumor-assosiert endotelet
For å undersøke hvilken rolle TNF-α-mediert stromal betennelse i tumorvekst, vi brukte en syngen tumormodell av B16-F1 murine melanoma etablert i villtype (WT) mus og mus med immun dysfunksjon som et resultat av kimlinje-delesjoner av både TNF-α reseptorer (TNFR 1, 2 – /- , heretter kalt knockout [KO]). Forstyrrelse av stromal TNF-α signaliserer betydelig svekket veksten av svulster i KO mus i forhold til at i WT mus (relative volum (V /V
0) [gjennomsnitt ± SEM]; KO: 9,0 ± 0,9, WT: 21 ± 2,5; p = 0,0033; fig. 1 A), dermed støtter en rolle for stromal TNF-α signalering på tumorvekst. I tilknytning til disse data, har vi funnet en økt ekspresjon av pro-inflammatoriske enzym, COX2, i tumor-infiltrerende fartøy av WT mus sammenlignet med KO-mus, som målt ved prosentandelen av COX2-positive vaskulære endotelceller (WT: 65 ± 4,9%, KO: 9,3 ± 5,1%, p = 0,0014, fig 1B og C).. I en gjengivelse eksperiment, renset vi endotelceller fra skåret WT og KO svulster i samme volum og utføres genuttrykk profilering av isolerte tumorassosierte endotelceller (TAEC-systemer). Vi identifiserte differensial uttrykk av 993 probe sett tilsvarende 808 gener. WT TAEC-systemer utstilt økt uttrykk av 686 probe sett og redusert uttrykk av 307 probe setter i forhold til KO TAEC-systemer (tabell S3). Disse gener koder for enzymer (104), transkripsjonelle regulatorer (66), kinaser (35), transportører (20), og kjemokiner /cytokiner (7). Vi utnyttet Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) for å klassifisere de forskjellig uttrykte gener og identifisert «Inflammatory Response» som den mest betydelig beriket sett med funksjoner overuttrykt i WT TAEC-systemer. Målt ved hjelp av Fishers eksakte test, var forekomsten av gener som er involvert i inflammatoriske responsfunksjoner var svært signifikant med p-verdier som varierer fra 2,4 x 10
-11 til 7,4 x 10
-3. IPA analyse viste en signifikant binding av dette genet er satt til kjente TNF-a-relaterte inflammatoriske reaksjonsveier mediert av NF-kB og interferoner (p = 10
-38 Fig. 1 D). Disse funn indikerte at stromal TNF-α signalering bidrar til akselerert tumorvekst og inflammatoriske gen-ekspresjon i tumorassosiert endotel
(A) B16-F1 melanom tumorvekst ble betydelig undertrykt i TNFR 1, 2 -. /- mus (KO) med forstyrret stromal TNF-α signalering i forhold til den i villtype-mus (vekt). Tumor volum ble målt i forhold til dag 0 volum, som var like i WT og KO-mus (p = 0,19, 2-tailed t-test). Dag 7, p = 0,002. Dataene er gjennomsnitt ± SEM. (B) tumorassosierte endotelceller (TAEC-systemer) i KO-mus har betydelig redusert ekspresjon av det pro-inflammatoriske enzym COX2. Representative bilder av immunhistokjemi for COX2 utført på B16-F1 svulster (Dag 7) og (C) Kvantifisering av COX2-positive TAEC-systemer. Scale bar, 20 mikrometer. Dataene er gjennomsnitt ± SEM. P = 0,0014 (2-tailed t-test). (D) WT TAEC-systemer overuttrykker en svært signifikant «betennelsesreaksjon» genet nettverk (p = 10
-38, Fishers eksakte test). Heltrukne linjer representerer direkte relasjoner, mens stiplede linjene representerer indirekte relasjoner. Rød farge indikerer overekspresjon i WT TAEC-systemer. (E) Stimulering av humane navlestrengvene endotelialceller (HUVECs) med en kombinasjon av de proinflammatoriske cytokiner TNF-α, IFNβ, og IFNy-indusert ekspresjon av både eksperimentelt utledet endotele inflammatoriske gener (sorte stolper), så vel som, kjent markører for endothelial betennelse (hvite søyler). Totalt RNA ble analysert ved kvantitativ RT-PCR. Data er gjennomsnitts fold-endring ± SEM i forhold til kontroll-behandlet HUVECs. P 0,01 over gener (2-tailed t-test). (F) Kondisjonert kultur media fra behandlet HUVECs akselerert vekst av menneske colontumorer xenopodet i atymiske mus. Forbehandlet indikerer før inkubasjon av tumorceller med kondisjonert kulturmedier fra stimulert HUVECs, mens kontroll indikerer inkubasjon med kondisjonert medium fra mock-behandlet HUVECs. Tumor volum ble målt i forhold til Dag 0 volum (8 dager etter injeksjon). Dataene er gjennomsnitt ± SEM. Dag 18, p = 0,0009 (2-tailed t-test).
Vi direkte vurdert endothelial genekspresjon som respons på proinflammatoriske signaler ved å stimulere dyrkede humane navlevene endotelceller (HUVECs) med en kombinasjon av TNF-α og interferoner (IFN) β og γ. Som bestemmes av kvantitativ RT-PCR, uttrykk for
VCAM1 plakater (karcelleadhesjonsmolekyl 1),
ICAM1 plakater (inter-cellulært adhesjonsmolekyl 1), og
SELE product: ( E-selektin), som er markører for aktivert endotel [4], ble indusert 1.8- til 2.6-ganger i henholdsvis (fig. 1E). I konsert med disse resultatene, inflammatorisk markørgener overexpressed i WT TAEC-systemer, inkludert
STAT1 plakater (signal svinger og aktivator av transkripsjon 1),
TAP1 plakater (transporter, ATP-bindende kassett, store histocompatibility kompleks 1),
IRF7 plakater (interferon regulerende faktor 7),
IFI44 plakater (interferon-induserte protein 44), og
CXCL10 plakater (chemokin, CXC motiv, ligand 10), ble overuttrykt 1.9- til 17,4 ganger etter behandling (fig. 1E). Vi testet ytterligere hypotesen om at aktiverte endotelceller øke veksten av humane tumorer ved inkubering av dyrkede tumorceller med kondisjonert kulturmedium fra enten TNF-α /IFN-behandlede eller kontrollbehandlede HUVECs. Kondisjonert media fra TNF-α /IFN-behandlede HUVECs betydelig økt vekst av humane tykktarm tumor xenograft i atymiske mus 2,3 ganger sammenlignet med kondisjonert medium fra kontrollbehandlede HUVECs (p = 0,0009, Fig. 1F). I menneskelige brystsvulster, observerte vi en tilsvarende 3,0 ganger økning i tumorvekst (p = 0,02) (data ikke vist). Disse funnene viser at endotel-genekspresjon i respons til pro-inflammatoriske signaler som er assosiert med forbedret humane tumorvekst.
Ekspresjon av tumor endotel-avledet inflammatoriske gener i humane sykdommer assosiert med kronisk betennelse
Endothelial inflammasjon er involvert i patogenesen av mange menneskelige sykdommer [16] – [18]. For å bestemme hvorvidt eksperimentelt utledet inflammatoriske gener var relevante for sykdommer hos mennesker, målte vi ekspresjonen av 554 forskjellige humane ortologer av tumoren endotel-avledede gener i datasett av humane sykdommer assosiert med kronisk betennelse. Disse genene betydelig aner patologiske vevsprøver av skrumplever (153 gener), inflammatorisk tarmsykdom (140 gener), og revmatoid artritt (106 gener) fra normalt vev kontroller (Fig 2A-C,. Tabell S4). Spesielt sensitivitet og spesifisitet for disse gensettene varierte 88-100% og 90-100%, henholdsvis (tabell S5). En førtini-genet undergruppe ble gjensidig dysregulerte i datasettene testet og samstemmige i uttrykk med den eksperimentelle modellen (Fig. 2D). Som forventet ble disse genene betydelig beriket av trasé involvert i «Inflammatory Response» (p-verdi: 1,4 × 10
-12 til 1,7 × 10
-2) inkludert antigen presentasjon, interferon signalering, TNFR 1 og 2 signalering, og NF-kB-signalering (fig. 2E). Disse resultatene viste at en inflammatorisk genekspresjon profiloveruttrykt i WT TAEC-systemer blir uttrykt forskjellig i flere humane inflammatoriske sykdommer.
uttrykksmessige gruppering av human ortologer av tumoren endotel-avledede gener i pasienter vevsprøver av (A) cirrhose ( 153 gener), (B) inflammatorisk tarmsykdom (IBD) (140 gener), og (C) reumatoid artritt (RA) (106 gener) sammenlignet med normalt vev kontroller. I klyngen diagrammet, hver kolonne representerer en pasientprøve, og hver rad representerer et differensielt uttrykt gen. Syke prøvene er merket med svart luker. Expression er avbildet som gjennomsnitts-normalisert, log2-transformerte verdier. (D) Førti-ni gener ble gjensidig dysregulerte i datasettene testet og samstemmige i uttrykk med den eksperimentelle modellen. (E) Pathway analyse av 49-genet satt demonstrere signifikant overrepresentasjon av en rekke inflammasjonsrelaterte veier. P-verdier ble beregnet ved hjelp av Fishers eksakte test. Rød linje angir p = 0,05.
Utvikling av en prognostisk molekylær klassifikator
neste hypotese at endothelial-avledet inflammatorisk genuttrykk er prediktive for svulst utfall hos kreftpasienter. Vi brukte Cox proporsjonal hazard regresjon over førtini-genet satt til å identifisere seks gener assosiert med redusert total overlevelse i hver av de fire trenings datasett som representerer lungekreft (n = 257), brystkreft (n = 197), tykktarmskreft (n = 154), og gliom (n = 77). Vi utpekt denne seks-genet angitt som inflammasjonsrelaterte endotel-avledet Gene (IREG) signatur, som inkluderer genene
IFI44
,
TAP1
,
SPP1 plakater (utskilt phosphoprotein 1, også kjent som osteopontin),
ANXA3 plakater (annexin A3),
RGS2 plakater (regulator av G protein signale 2), og
PDK1 plakater (pyruvat dehydrogenase kinase, isoenzymet 1). Vi bygget en seks-genet IREG poengsum som kombinerte genuttrykk med risiko for død i opplærings datasett (Fig. S1). IREG + pasienter ble definert som de som har en seks-genet resultatet er større enn eller lik gruppen median stillingen. I uavhengige pasient kohorter, testet vi evnen til seks-genet score for å klassifisere pasientene inn prognostiske grupper basert på genuttrykk. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse sammenligne pasientgrupper viste en signifikant redusert total overlevelse for IREG + pasienter i uavhengige kohorter av brystkreft (n = 98, p = 0,0008), tykktarmskreft (n = 78, p = 0,0013), gliom (n = 50 ; p = 0,017), og lungekreft (n = 184;. p = 0,026) (figur 3A-D). Denne foreningen mellom IREG status og overlevelse ble bekreftet av univariate Cox proporsjonal fareanalyse av total overlevelse. IREG + pasienter hadde en økt risiko for død på 2,72 ganger i tykktarmskreft (p = 0,0027), 3,21 ganger i brystkreft (p = 0,0015), 1,66 ganger i lungekreft (p = 0,052), og 2,12 ganger i glioma (p = 0,034) (tabell 1). Spesielt, på tvers av krefttyper IREG + status var signifikant assosiert med større primærtumorer av høyere histologisk grad (tabell 2). Videre i hver svulst datasett testet, fant vi en signifikant positiv korrelasjon mellom
VCAM1
genekspresjon og IREG poengsum (Fig. 3E-H). Disse funnene kollektivt indikerte at IREG signatur er prediktive for total overlevelse i flere kreft hos mennesker. Videre
VCAM1
, en markør for cytokin-aktivert endotel, er co-uttrykkes med IREG signatur.
IREG uttrykket er assosiert med dårlig prognose i (A) brystkreft (n = 98 ), (B) tarmkreft (n = 78), (C) gliom (n = 50), og (D) lungekreft (n = 184). Kaplan-Meier overlevelseskurver for pasientgrupper som er identifisert av IREG poengsum. P-verdier indikerer signifikante forskjeller i total overlevelse målt ved log-rank tester. Rød = IREG +, blå = IREG-. (E-H) Uttrykk for de seks-genet IREG poengsum var positivt korrelert med VCAM1 genuttrykk i hver svulst type. Vist er Pearsons korrelasjonskoeffisient.
multivariat analyse med standard kliniske og patologiske prognostiske faktorer
I multivariate analyser ved hjelp av kovariater tilgjengelig for hvert datasett, forble IREG + status en signifikant kovariat i brystkreft, lungekreft, tykktarmskreft og i forhold til standard kliniske og patologiske faktorer assosiert med dårlig prognose (tabellene S6, S7, S8, S9 og). I disse kreftformene, var det ingen signifikante multivariate interaksjoner mellom IREG + status og de andre kovariatene. Disse resultatene indikerte at den prognostiske effekten av IREG stillingen ikke var avhengig av bestemte verdier av de respektive kovarianter. I brystkreft med dårlig prognose (alder 40 eller tumorstørrelse ≥T2), utvidet vi denne analysen av ytterligere stratifiseringsinnretningen pasienter ved hjelp av IREG poengsum (Fig S2.). Vi fastslått at for hver respektive faktor assosiert med dårlig prognose, IREG + pasientene hadde et 2.4- til 2.8 ganger betydelig forhøyet risiko for død sammenlignet med IREG- pasienter. En tilsvarende analyse av lungekreftpasienter med dårlig prognose (alder ≥65 eller spredning til lymfeknuter) viser en signifikant 1,4 til 2,0 ganger høyere risiko for død i IREG + pasienter (fig. S3). For pasienter med stadium 3 eller 4 tykktarmskreft, IREG + pasienter hadde en 1,9 ganger økt risiko for død sammenlignet med IREG- pasienter (Fig. S4). Til slutt, for glioma pasienter med høyere risiko (alder 55), IREG + pasienter hadde en betydelig økt risiko for død på 2,4 ganger i henholdsvis (fig S5, Tabell S10.). Tatt sammen med tidligere data, bekreftet disse resultatene at IREG + status forbedrer identifisering av kreftpasienter har større risiko for død.
Diskusjoner
Disse funnene tyder på at endothelial betennelse er en formidler av tumorvekst og progresjon. Til støtte for denne hypotesen demonstrerer vi at avbrudd av stromal TNF-α signale undertrykker inflammatorisk genekspresjon i tumorassosierte endotelceller og signifikant hemmer tumorvekst. Vi viser videre at kondisjonekulturmedium fra humane endotelceller aktivert av pro-inflammatoriske cytokiner akselererer veksten av humane tumorer i mus med immunsvikt. Til slutt, utlede vi en molekylær signatur reflekterende av svulst endothelial inflammatorisk genuttrykk som er svært intelligent av dårlig klinisk utfall i fire typer kreft hos mennesker. Overensstemmende med vår eksperimentell modell, pasienter med tumorer som uttrykte disse inflammatoriske gener hadde signifikant større primære tumorer i høyere grad histologisk.
Molecular signaturer som ble oppdaget i genekspresjon profilering er blitt vist å legge prognostisk verdi for kliniske og patologiske funn i flere kreft hos mennesker. Identifisere prognostiske variabler som samarbeider med kjente faktorer kan forbedre identifiseringen av pasienter med høyere risiko for tilbakefall og død. Nylig har flere studier identifisert vert stromale signaturer, enten i renset stromale celler eller fra hele tumorprøver, som viktige prognostiske faktorer i mange typer av kreft hos mennesker, inkludert brystkreft, lungekreft, magekreft, prostatakreft, og lymfomer [19] – [26]. Finak et al [19] brukt laser capture mikrodisseksjon (LCM) av primære brystsvulster å konstruere et stroma-avledet prognostisk signatur som spådd dårlig utfall i hele tumor-avledet uttrykk datasett. Forfatterne fant at dårlig utfall ble sterkt knyttet til uttrykk for mange endotelceller-avledet gener og at pasientprøver i dårlig resultat gruppen hadde en signifikant større endothelial innhold enn de i det gode resultatet gruppen. Videre Lenz et al [25] profilert genekspresjon i biopsiprøver fra pasienter med diffus stor B-celle lymfom og identifisert et høyt prognostisk stromal signatur hos pasienter med uheldige utfall som hovedsakelig besto av velkjente endoteliale markører. I tillegg, Saadi et al [21] har vist at progresjonen fra pre-malign sykdom til esophageal adenokarsinom var assosiert med en markert ekspresjon av inflammatoriske mediatorer i LCM stromaceller kompromittert, delvis, av endotelceller. Disse studiene markere rollen av ikke-maligne tumor infiltrerende stromale celler i prognosen av kreft hos mennesker. I denne forbindelse er de fleste tumor-biopsier inneholder en betydelig andel av stromale celler (opp til 50% [10]). Derfor signaturer avledet fra hele vevsprøver reflektere både kreft og stromal uttrykk mønstre. Likevel har få studier hittil identifisert prognostiske molekylære signaturer relevant for flere kreft hos mennesker, og ingen av dem ble hentet fra tumor-assosiert endotelceller.
Endotelceller spille en aktiv rolle i en rekke inflammatoriske funksjoner som fører til økt blodstrøm, vaskulær lekkasje av plasmaproteiner, og leukocytt-rekruttering. Mange vellykkede behandlinger rettet mot kronisk betennelse direkte endre endothelial genuttrykk [4]. Spesifikke eksempler inkluderer TNF-α-inhibitorer i reumatoid artritt og inflammatorisk tarmsykdom og statiner i kardiovaskulær sykdom [4]. Det er en økende mengde bevis på at mange kreftformer er knyttet til sykdommer i kronisk betennelse. En mekanisme ved hvilken dette skjer er gjennom induksjon og akkumulering av DNA-skade i prolifererende celler ved infiltrering av inflammatoriske celler i områder av vedvarende betennelse. Disse endringene fører til permanente genomisk endringer som til slutt fremmer malign transformasjon [2]. Den sterkeste sammenhengen mellom kronisk betennelse og ondartet sykdom er i tykktarm karsinogenese oppstår hos personer med inflammatoriske tarmsykdommer. Mens det er kjent at betennelses baner i andre stromaceller også bidra til tumorvekst [2] Våre resultater tyder på at tumorassosiert endotel-inflammasjon er en viktig bestemmende faktor i tumorprogresjon. Til støtte for våre funn, nye bevis viser at endotelcelle-avledet signaler, inkludert inflammatoriske mediatorer, direkte regulere tumor progresjon gjennom «angiocrine» mekanismer uavhengig av angiogenese [27]. Likevel er ytterligere studier for å karakterisere de mekanismer som betent kreft endotelceller fremmer tumorvekst.
Våre funn skiller seg fra mange empirisk avledet gen signaturer i at vi identifiserte en molekylær prediktor for overlevelse hos pasienter med ulike kreft hos mennesker basert på en eksperimentell modell for tumor endotelial inflammasjon, som kan vise seg nyttig biologisk og klinisk. Videre prospektiv evaluering av seks-genet signatur ved hjelp av RT-PCR kan resultere i en nøyaktig og reproduserbar prediksjon verktøy som kan hjelpe til kliniske beslutningsprosesser på tvers av en rekke humane kreftformer. Fra et terapeutisk perspektiv, den selektive hemming av endotel-avledede inflammatoriske forhold, uten å forstyrre integriteten til blodårene, kan likevel blokkere tumorvekst og derved unngå mulige toksiske bivirkninger mot normale blodkar [6], [7]. Enda mer, er det kjent at angiogen aktivitet ikke nødvendigvis i samsvar med tumor prognose [7].
