Abstract
Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er en stor morder i kreftrelaterte menneskelig død . Dens terapeutisk intervensjon krever overlegen effektiv molekyl (er) som det ofte blir motstandsdyktig mot presentere kjemoterapi alternativer. Her kan vi rapportere at damp av flyktige olje forbindelser hentet fra
Litsea Cubeba
frø drept menneske NSCLC celler, A549, gjennom induksjon av apoptose og cellesyklus arrest. Vapor generert fra de kombinerte oljer (VCO) deaktiverte Akt, en sentral aktør i kreftcelle overlevelse og spredning. Interessant VCO dephosphorylated Akt på begge Ser
473 og Thr
308; gjennom undertrykkelse av mTOR og pPDK1 hhv. Som en konsekvens av dette, redusert fosforylering av Bad forekom sammen med redusert Bcl-xL uttrykk. Dette senere forbedret Bax nivåer tillater utgivelsen av mitokondrie cytokrom c inn i cytosol som samtidig aktivert caspase 9 og caspase 3 resulterende apoptotisk celledød. Nedskrivning av Akt aktivering av VCO deaktiveres også MDM2 som gjennomføres overekspresjon av p53 som igjen oppregulert p21 uttrykk. Dette fører til økt p21 binding til cyclin D1 som stoppet G1 til S fase progresjon. Til sammen frembringer VCO to spiss virkninger på lungecancerceller, det induserer apoptose og blokkerte kreftcellevekst, som begge oppstått på grunn av deaktivering av Akt. I tillegg har den en annen viktig fordel: VCO kan være direkte levert til lungekreft vevet ved innånding
Citation. Seal S, Chatterjee P, Bhattacharya S, Pal D, Dasgupta S, Kundu R, et al. (2012) Vapor av flyktige oljer fra
Litsea cubeba
Seed induserer apoptose og årsaker cellesyklus arrest i lungekreft celler. PLoS ONE 7 (10): e47014. doi: 10,1371 /journal.pone.0047014
Redaktør: Gobardhan Das, International Center for genteknologi og bioteknologi, India
mottatt: 28 juni 2012; Godkjent: 11 september 2012; Publisert: 16 oktober 2012
Copyright: © Seal et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen arbeidet ble finansiert av tilskuddet fra csir-Neep Project (HCP-005). Forfatterne SS og PC-er takknemlig til Institutt for Science Teknologi, Govt. fra India, New Delhi; Sushmita Bhattacharya, DP og RK står i gjeld til Rådet for industriell og teknisk forskning (CSIR), New Delhi, for tildeling av stipend. SD er takknemlig for å UGC for Dr. D. S. Kothari PDF CSIR-Neist for QHF; og Samir Bhattacharya til den indiske National Science Academy for hans INSA seniorforsker posisjon. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Den medforfatter Prof. Samir Bhattacharya er en PLoS ONE Editorial styremedlem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Lungekreft er en av de mest utbredte kreftformer og en viktig årsak til hele verden kreft relatert død i om lag 1,4 millioner pasienter årlig [1]. Blant lungekreft, ikke-liten celle lungekreft (NSCLC) omfatter ~80%, og innenfor hvilken adrenocarcinoma er betydelig høyt i forekomst og dødelighet [2]. Kjemoterapi og /eller bestråling svikter vanligvis fordi NSCLC-celler er iboende motstandsdyktige mot slike behandlinger, videre prognose av NSCLC er særlig dårlig [3], [4]. Alle disse påvirket en svært begrenset terapeutisk valg for lungekreft. Derfor er det et viktig behov for å utvikle et mål bestemt chemo-intervensjon for å forsinke kreft spredning eller å indusere apoptose eller begge deler for å håndtere problemet med NSCLC.
For å ta opp spørsmålet om NSCLC er alarmerende situasjon, har flere forsøk blitt gjort for å søke etter egnede molekylære mål for å gripe inn kreftceller progresjon og apoptose. I NSCLC-celler, er Akt /PKB den konstitutivt aktive kinase som fremmer celleoverlevelses [5]. Aktivering av Akt oppstår når det blir rekruttert inn i cellemembranen gjennom PH domene og fosforylert på Thr henholdsvis
308 og Ser
473 gjennom formidling av PDK1 (phosphoinositide avhengig kinase 1) og mTOR (mammalian target of rapamycin) [6], [7]. Interessant, avvikende Akt aktivisering bidrar sterkt til lunge kreft [8]. Fosforylert Akt (Pakt) er en kraftig pådriver for celleoverlevelse som det holder denne veien i live ved å beskytte BCL-xL og motvirke ulike komponenter av apoptotiske kaskader [9]. Selv om apoptotisk respons på grunn av inhibering av Akt er blitt observert med varierende grader i flere typer kreft [10], [11] kan det være avgjørende i lungekreft fordi forbedret fosforylerte form av Akt oppstår stadig [12].
Akt regulerer p53, en tumor suppressor protein som kontrollerer cellesyklusutvikling, gjennom MDM2 (murin dobbel mutant-2), en ubiquitin ligase. MDM2 er et substrat for Akt, fosforylering av MDM2 ved Akt effekter ubiquitinering og proteasomal degradering av p53 [13]. Aktivert Akt eliminerer derfor et stort hinder for kreftcelle progresjon. En annen viktig dimensjon av Akt er dens hemmende effekt på apoptotisk reaksjonsvei. Bad, har et medlem av Bcl
2 familie er funnet å være den første protein som initierer apoptose ved å forskyve Bcl
2 eller Bcl-xL som tillater Bax til å oligomerisere og skape porer på mitokondriemembranen for å frigjøre cytokrom c i cytosol [14], [15]. Aktivert Akt phosphorylates Bad på Ser136 forårsaker den til å distansere seg fra BCL-xL fra mitokondriemembranen og forbinder med en adapter protein 14-3-3 resulterer Bad binding til cytosol [16], [17]. Target basert forbedring fra NSCLC celle progresjon eller ødeleggelse er ennå utilgjengelig, og siden Akt er konstitutivt aktiv her og godt karakterisert kinase kjent for å støtte kreftcelle overlevelse og progresjon, ville dens deaktivering være det beste valget for å håndtere NSCLC.
i denne rapporten viser vi at flyktige forbindelser fra olje utvunnet og renset fra frøene av
Litsea Cubeba plakater (lour.) Pers. (Lauraceae), en plante allment tilgjengelig i Nordøst-regionen i India, ødelegger lungekreft celler gjennom deaktivering av Akt. Interessant er det at dampen av de oljer som induserer apoptose og hindrer celleproliferasjon av NSCLC ved fremstilling av defekter i Akt fosforylering. Dampen av oljer viste to spiss effekter, det vil si induksjon av apoptotisk død og retardasjon av cellesyklusprogresjon, både skjer gjennom deaktivering av Akt. Denne rapporten forventes derfor å ha en spesiell attraksjon som damp indusert ødeleggelse av lungekreft celler ville ha vesentlig dimensjon i forhold til levering til målet vev.
Materialer og metoder
Reagenser
Alle cellekultur materialer ble hentet fra Gibco-BRL, Life Technologies Inc., Gaithersburg, USA. De primære antistoffer for Pakt (Thr308, sc-135650), pAkt1 /2/3 (Ser473, sc-7985-R), Akt 1/2/3 (sc-8312), pPDK1 (Ser241, sc-101775), Bcl -xL (sc-7195), pBad (Ser136, sc-7999), Bad (sc-7869), pMdm2 (Ser166, sc-293105), p53 (sc-6243), p21 (sc-756), cyclin D1 ( sc-753), poly [ADP-ribosyl] -polymerase (PARP) (sc-7150), cytokrom c (SC-7159) og β-aktin (sc-130657) ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology Inc., California, USA og mTOR (# 2983) ble anskaffet fra Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA. Alkalisk fosfatase og FITC konjugerte sekundære antistoffer, Annexin V-Cy3 apoptose deteksjon kit, protein A agarose og CHAPS ble kjøpt fra Sigma Aldrich, St. Louis i Missouri, USA. MTT assay kit ble anskaffet fra Milipore, Temecula, CA, USA. Caspase-Glo ™ 3/7 testsettet ble kjøpt fra Promega Corporation, Madison, WI, USA. Mitotracker ble kjøpt fra Molecular Probes, MD, USA, ble JC-1 mitokondriemembranen mulig analysesett kjøpt fra Cayman Chemical Company (Ann Harbor, MI, USA). Apoptotisk DNA ladder kit og BrdU merking kit ble anskaffet fra Roche Diagnostics (GmbH, Tyskland).
Utvinning og rensing av essensielle oljer fra
Litsea cubeba
frø
Om 250 g friske og modne frø av
Litsea cubeba
, samlet i løpet av de månedene august til oktober 2009-2011 fra csir-Neist forsøksgård, Jorhat, Assam ble dynket i destillert vann og ekstrahert ved hjelp av en Clavenger apparat i 6 timer. Den essensielle oljen avsatt over vannlaget ble separert ved anvendelse av en skilletrakt, og ble tørket over vannfritt natriumsulfat (nøytral) og filtrert for å gi olje (6,25 g, 2,5% utbytte). Den tynnsjiktskromatografi av råoljen indikerte tilstedeværelse av fire forskjellige flekker. Den urene olje (1 g) ble underkastet kromatografisk rensing på en silikagel (20 g, 100-200 mesh, Rankem) kolonne (1 tommers diameter 50 cm lengde) pakket i heksan. 30 ml fraksjoner ble samlet i den følgende rekkefølge: fraksjoner 1-10 (heksan), 11-20 (1% etylacetat i heksan), 21-35 (2% etylacetat i heksan), 36-60 (3% etylacetat i heksan), og fraksjon 61-frem til gjennomføring av eluering av forbindelsene (4% etylacetat i heksan). Fraksjoner 11-20 inneholdende 1 (heretter betegnet som forbindelse 1 eller C1) (TLC) ble kombinert og konsentrert i en rotasjonsfordamper for å gi en olje (100 mg), og denne ble identifisert som citronellal fra sammenligning med autentisk materiale (TLC, IR, NMR, MS). Fraksjoner 23-35 inneholdende 2 (heretter omtalt som forbindelse 2 eller C2) (TLC) ble kombinert og konsentrert i en rotasjonsfordamper for å gi en oljeaktig substans (86 mg) og ble identifisert som neo-isopulegol ved sammenligning av dens
1 H NMR-spektrum med det som er rapportert i litteraturen [18]. Fraksjoner 40-60 inneholdende forbindelsen 3 (heretter betegnet som forbindelse 3 eller C3) (TLC) ble kombinert og konsentrert i en rotasjonsfordamper som forklart tidligere for å gi en oljeaktig rest (120 mg), og denne ble identifisert som isopulegol ved direkte sammenligning med
1H-NMR-spektrum med det som er rapportert i litteraturen [18]. Fraksjoner 64-76 inneholdende forbindelse 4 (heretter betegnet som forbindelse 4 eller C4) (TLC) ble kombinert og konsentrert for å gi en tykk olje (55 mg) som ble identifisert som citronellol fra sammenligning av dens
1H-NMR-spektrum med autentisk prøve .
forbindelse 1 (C1):
IR (CHC
3): υ 2925, 1724, 1457, 1437, 1219, 1040, 772 cm
1;
1 H NMR (CDCh
3, 300 MHz): δ 0,96 (d,
J
= 6,6 Hz, 3 H, -CH
Me
), 1,30 til 138 (m , 2H, -CHMeC
H
2
CH
2), 1,68 (s, 3H, = C
Me
), 1,98 (s, 3H, = C
Me
), 1,98 til 2,06 9m, 3H, = C
CH
2
– -C
H
Me), 2,24 (dd,
J
= 7,9, 2,6 Hz, 1 H, -C
H
HCHO), 2,37 (dd,
J
= 5,4, 1,6 Hz, 1 H, -CH
H
CHO), 5,06 (t,
J
= 7,0 Hz, 1 H, -C
H
= CMe
2), 9,75 (s, 1H, -C
H
O). MS (ESI): 155 (M
++ 1); bp 206 ° C (lit. 207 ° C)
Forbindelse 2 (C2).
IR (CHC
3): υ 2925, 1722, 1643, 1455, 1445, 1375, 1219, 1024, 889, 772 cm
1;
1 H NMR (CDCh
3, 300 MHz): δ 0,87 (d,
J
= 6,6 Hz, 3 H, -CH
Me
), 0,92 til 0,95 (m , 1H), 1.8 til 1.12 (t,
J
= 6,6 Hz, 1H), 1,47 til 1,54 (m, 1H), 1,68 til 1,75 (m, 3H), 1,79 (s, 3H,
Me
C = CH
2), 1,95 til 1,99 (m, 2H), 3,98 (m, 1H, C
H
OH), 4,78 (s, 1H, = C
H
2), 4,95 (s, 1H, = C
H
2); MS (ESI). 154 (M
+)
Forbindelse 3 (C3):
IR (CHC
3): υ 2923, 1645, 1455, 1448, 1375, 1219, 1095, 1051, 1027, 886, 772 cm
1;
1 H NMR (CDCh
3, 300 MHz): δ 0,90 til 1,03 (m, 2H), 0,95 (d,
J
= 6,6 Hz, 3H, -CH
Me
), 1,30 til 1,35 (m, 1H), 1,47 til 1,54 (m, 1H), 1,63 til 1,65 (m, 1H), 1,69 (d,
J
= 1,5 Hz, 3 H,
Me
C = CH
2), 1,87 til 1,89 (m, 1H), 2.3 til 2.6 (m, 2H), 3,50 (dt, 1H,
J
= 10,4, 4,2 Hz , C
H
OH), 4,85 (s, 1H, = C
H
2), 4,89 (s, 1H, = C
H
2); MS (ESI): 154 (M
+); bp 213 ° C (lit. 212 ° C)
forbindelse 4 (C4).
IR (CHC
3): υ 3338, 2925, 1452, 1377, 1219, 1058, 1010, 738 cm
1;
1 H NMR (CDCh
3, 300 MHz): δ 0,91 (d,
J
= 6,6 Hz, 3 H, -CH
Me
), 1,15 til 129 (m , 2H, -CHMeC
H
2
CH
2), 1,33 til 1,45 (m, 2 H, -C
H
2
CH
= 2-OH ), 1,51 til 1,53 (m, 1H, -C
H
Me), 1,60 (s, 3H, = C
Me
), 1,68 (s, 3H, = C
Me
), 1,96 til 2,01 (m, 3 H, = C
CH
2
– O
H
), 3,61 til 3,74 (m, 2H, – C
H
= 2-OH), 5,07 (t,
J
= 7,0 Hz, 1 H, -C
H
= CME
2); MS (ESI): 157 (M
++ 1); bp 223 ° C (lit. 222 ° C).
Cell kultur og behandlinger
lungekreft cellelinje A549, var en slags gave fra Dr. Partha P. Banerjee (Georgetown University Medical Centre, Washington DC, USA), som han hentet fra American Type Culture Collection (ATCC), USA. Celler ble dyrket i DMEM inneholdende Earls salter og ikke-essensielle aminosyrer supplert med 10% føtalt bovint serum, penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 ug /ml) i en fuktet 95% O
2/5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C. Konfluente cellene ble sub-dyrket ved trypsinering og deretter seedet i 6 brønners kultur plater som inneholder DMEM med essensielle kosttilskudd.
Celler ble sådd i en seks brønn plate holde en godt blottet for celler. Når konfluens nådd, ble råolje eller hver enkelt forbindelse eller VCO fortynnet i DMEM og anvendt i den tomme brønn på platen primet for behandling. VCO-inneholdende medium ble påfylt hver 24. time i løpet av forsøket. Cellene ble inkubert ved ulike tidsperioder med flere fortynninger av VCO som nevnt under tallene. Kontrollceller ble holdt i en separat inkubator for å unngå eksponering fra VCO. Ved slutten av inkubasjonen ble cellene lysert, sentrifugert i 10 min ved 10 000 g ved 4 ° C, og supernatanten ble oppsamlet. Proteininnholdet i supernatanten ble bestemt ved å følge fremgangsmåten til Lowry et al. [19]. Egge eller p53 siRNA eller SP1 siRNA ble transfektert hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) etter produsentens anvisninger.
MTT celleviabilitet analysen
Celleviabilitet ble bestemt ved hjelp av MTT assay kit (Milipore, Temecula, CA, USA) etter produsentens anvisninger. I korthet ble cellene sådd ut i 96-brønners plater, og ble utsatt for varierende fortynninger av råolje eller damp oljer i 72 timer eller VCO for forskjellige tidsperioder. 10 ul av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2-5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) ble tilsatt til hver brønn i 4 timer ved 37 ° C. Etter oppløsning i 100 ul 1 (N) isopropanol /0,04 (N) HCl, absorbansen ble avlest ved 595 nm i en mikroplateleser (Thermo Electron Corporation, MA, USA).
AnnexinV-Cy3 påvisningsmetode
AnnexinV-Cy3 apoptose deteksjon kit, kjøpt fra Sigma Aldrich, St. Louis i Missouri, USA ble brukt til å skille mellom levende (grønn fluorescens), nekrotisk (rød fluorescens) og apoptotiske celler (grønn og rød fluorescens). A549-celler inkubert uten eller med VCO av fortynning (2 x 10
3) i 36 timer ble vasket grundig med PBS, høstet og 50 ul av cellesuspensjonen ble oppdaget på poly-L-lysin-belagte objektglass. Cellene ble deretter vasket tre ganger med bindingsbuffer og flekket med dobbel merking fargeløsning (Annexin V-Cy3 og 6 Carboxy Fluorescein Di-acetat (cfda) i 10 minutter. Overskudd av merkemiddel ble fjernet ved vasking av cellene tre ganger med bindingsbuffer og celler ble observert etter fluorescens mikroskop (Zeiss Axio Scope A1, Carl Zeiss, Göttingen, Tyskland).
JC-1 mitokondriemembranen mulig analyse
JC-1 farging ble utført ved hjelp av JC- 1 mitokondriell membranpotensiale analysesett, Cayman Chemical Company, (Ann Arbor, Michigan, USA) i henhold til produsentens protokoll. korthet ble kontroll og VCO (2 × 10
3 fortynning) behandlet celler utsatt for JC-en flekk (10 ug /ml) i 20 minutter ved 37 ° C. Den forskyvning av fluorescens på grunn av VCO behandling ble observert i henhold til fluorescens mikroskop (Zeiss Axio Scope A1, Carl Zeiss, Gottingen, Tyskland).
DNA fragmenteringsanalyse
lav-molekylvekt-DNA ble ekstrahert fra 1 x 10
6 kontroll eller VCO (2 x 10
3dilution) behandlede celler ved hjelp av apoptotisk DNA stige kit fra Roche Diagnostics, (GmbH, Tyskland) ved å følge produsentens anvisninger. Elueres DNA-prøver ble deretter lastet på etidiumbromid beiset 1,5% agarosegel og bildet ble tatt av Bio-Rad Gel Doc ™ XR +, USA ved hjelp av Image Lab programvare.
elektroforese og immunoblotting
60 mikrogram av protein fra kontroll eller behandlet cellelysatene ble løst på 10% eller 12,5% SDS-PAGE og overført til PVDF membraner (Millipore, Bedford, MA) med hjelp av Semi-Dry trans blot Apparatus (TE77 Semi-Dry Transfer Unit, GE Healthcare, CA, USA). Membranene ble først inkubert over natten ved 4 ° C med forskjellige primære antistoffer ved 1:500 fortynninger fulgt av respektive alkalisk fosfatase konjugerte sekundære antistoffer ved 1:2000 fortynninger ved romtemperatur i 2 timer. Proteinbåndene ble detektert ved anvendelse av 5-bromro 4-klor-3-indolyl fosfat /nitro tetrazolium (BCIP /NBT). Intensitet av bandene ble vurdert av Image Lab programvare (Bio-Rad Gel Doc ™ XR +, USA).
Immunofluorescensanalyse studie av cytokrom c
A549 celler ble dyrket på sterile ubestrøket glass dekkglass. Både kontroll og VCO (2 x 10
3 fortynning) behandlede celler ble farget med Mitotracker (Molecular Probes, MD, USA) ved 1:10,000 fortynninger (in DMEM) i 15 minutter. Celler ble ytterligere vasket med DMEM og behandlet for fiksering. Etter fiksering ble cellene inkubert med anti-cytokrom c-antistoff (1:100) i 2 timer fulgt av inkubering med FITC-konjugert sekundært antistoff (1:50) for en annen 1 time ved romtemperatur. Celler ble teller farget og montert med DAPI montering medium og observert etter fluorescens mikroskop (Zeiss Axio Scope A1, Carl Zeiss, Göttingen, Tyskland).
caspase-Glo 3/7 analysen
A549 celler ble sådd ut i 96-brønners kulturplater og inkuberes uten eller med VCO av fortynning (2 x 10
3) for forskjellige tidsperioder. Ved opphør av inkubasjon ble caspase aktivitet målt ved hjelp av caspase-Glo ™ 3/7, Promega Corporation, Madison, WI, USA i henhold til produsentens protokoll. Luminescens ble målt i en DTX-800 multimode detektor (Beckman Coulter, CA, USA).
BrdU-inkorporering assay
DNA-syntese ble overvåket ved å måle inkorporering av tymidinanalogen 5-brom-2 « deoxyuridine (BrdU) i voksende kreftceller ved hjelp BrdU merking og deteksjon kit. Kontroll og VCO (2 x 10
3 fortynning) behandlet A549 celler ble oppfrisket med komplett medium inneholdende BrdU merkingsreagens og inkubert i 1 time. Cellene ble deretter grundig vasket med vaskebuffer og fiksert med etanol fikseringsmiddel i 20 minutter ved -20 ° C. Fikserte celler ble vasket og inkubert med anti-BrdU-antistoff, etterfulgt av anti-mus-Ig fluorescein løsning. Cellene ble deretter montert på objektglass og observert etter fluorescens mikroskop (Zeiss Axio Scope A1, Carl Zeiss, Göttingen, Tyskland).
Chromatin immunoprecipitation (chip) assay
ChIP analysen ble utført ved hjelp en brikke analysesett (Upstate, Temecula, CA, USA) etter produsentens protokollen med anti-p53 antistoff. Primere ble brukt for å forsterke kjent p53 respons element på p21 arrangøren og disse er – RE1: fremover: 5′-CAGGCTGTGGCTCTGATTGG-3’and omvendt: 5′-TTCAGAGTAACAGGCTAAGG -3 «; RE2: fremover: 5»-GGTCTGCTACTGTGTCCTCC-3 «og omvendt: 5′-CATCTGAACAGAAATCCCAC-3» [20] og PCR-produkter ble løst på etidiumbromid beiset 2% agarosegel og bildet ble tatt av Bio-Rad Gel Doc ™ XR +, USA ved hjelp av Image Lab programvare.
Co-immunoprecipitation (Co-IP) assay
200 mikrogram av protein fra kontroll eller VCO behandlede celler ble inkubert over natten med to mikrogram av anti-p21 og anti- β-aktin-antistoff ved 4 ° C med kontinuerlig omrøring. Protein A-agarose ble deretter tilsatt og inkubert i 4 timer ved 4 ° C. Antigen-antistoff-kompleksene ble samlet opp ved sentrifugering ved 10.000 rpm i 2 minutter ved romtemperatur. Pelleten ble vasket 3 ganger for å fjerne eventuelt ubundet protein og kokt med 4 x prøvebuffer i 5 min i et kokende vannbad. Prøven ble sentrifugert og supernatanten ble applisert på 10% SDS-PAGE etterfulgt av immunoblotting med anti-Cyclin D1 eller anti-β-actin-antistoffer.
Flow-cytometrisk analyse
For cellesyklus analyse, kontroll og VCO (2 x 10
3dilution) ble behandlet A549 celler ble trypsinert, vasket to ganger med PBS, og deretter fiksert i 70% etanol i 24 timer før den DNA-analyse. Etter fjerning av etanol ved sentrifugering, ble cellene vasket to ganger med PBS. Cellene ble deretter inkubert med RNase (100 ug /ml) i 30 min og deretter farget med propidiumjodid (PI-5 ug /ml) i 15 min. Fluorescens av PI behandlede celler ble målt med flowcytometer (BD FACSAria ™ II). De prosenter av G1, S og G2-M-celler ble bestemt ved bruk av FACS Diva programvare.
Primær dyrking av vanlige lungeceller
Normale lungeceller ble isolert fra Sprague Dawley rotter etter Phan et al. [21], kort, normalt friske rotter ble bedøvet, og lungene ble deretter perfusert med steril fosfatbufret saltløsning (PBS) gjennom den høyre ventrikkel inntil de var blek. Da lungene ble fjernet, hakket og oppsluttet i PBS inneholdende 0,5% trypsin i 45 minutter ved 37 ° C. Digerert celler ble separert fra ufordøyd vev og avfall ved filtrering gjennom nylonnetting. Cellene ble deretter vasket med PBS og deretter med DMEM inneholdende 10% føtalt bovint serum og antibiotika, og til slutt resuspendert i mediet. Cellene ble deretter sådd ut i en brønns plate holder en vel blottet for celler og inkubert i en fuktig 95% O
2/5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C. Etter 1 time, ble celler inkubert med 2 x 10
3 fortynning av C2 eller C3 eller C4 eller VCO i 12 timer. Kontrollceller ble holdt i en separat inkubator for å unngå tilstedeværelsen av damp. Ved slutten av inkubasjonen ble cellene lysert, sentrifugert i 10 min ved 10 000 g ved 4 ° C, og supernatanten ble oppsamlet. Proteininnholdet i supernatanten ble bestemt ved å følge fremgangsmåten til Lowry et al. [19].
Statistisk analyse
Data ble avledet fra minst tre uavhengige eksperimenter og analysert ved en-veis analyse av varians (ANOVA) hvor F-verdien angitte betydning, midler ble sammenlignet etter en post hoc multippel range test. Alle verdier var midler ± SEM.
Resultater
bioaktivitet guidet isolering og rensing av oljer fra frø av
Litsea cubeba
hentet olje oljedamp fra
Litsea Cubeba
frø ble undersøkt for anti-kreft aktivitet i A549 lungekreftceller. Flere fortynninger fra råolje ble fremstilt, og hver fortynning ble tilsatt i en av de seks brønn kulturplater, mens andre 5 brønner inneholdt A549 NSCLC-celler. Dampen som genereres fra hver fortynning ble forventet å bli spre seg gjennom hele platen og nå kreftceller. Doseavhengig eksponering av damp redusert levedyktigheten til A549 celler betydelig på 72 timer med [10
3] og [10
2] fortynninger mens inntil [10
4] fortynninger dampen hadde ingen merkbar effekt på overlevelses av celler (fig. 1A). Kromatografiske rensing av
Litsea cubeba
frø essensielle oljer ga opphav til fire typer forbindelser, identifisert gjennom Mass og
1 H NMR-spektrum med autentiske forbindelser og deres kjemiske natur ble påvist som følger – C1: citronellal; C2: neo-isopulegol; C3: isopulegol og C4: citronellol (Fig. 1B), som hver ble separat tilsatt i en fortynning på [2 x 10
3] i en av de 6 brønners kulturplate, andre 5 brønner som inneholdes A549-celler. Dampene som genereres etter tilsetning av olje til brønnen ble utsatt for cellene i 72 timer. Det kan ses fra fig. 1C som C1 hadde dårlig aktivitet, C2 og C3 viste tre ganger høyere aktivitet sammenlignet med C1, mens C4 hadde høyest aktivitet, er opptatt så langt celledødeligheten.
(A) Cellenes levedyktighet av A549 lungekreftceller ble målt når den utsettes for damper av forskjellige fortynninger (10
6 til 10
2) av råolje i 72 timer ved hjelp av MTT-analysen og dataene ble uttrykt som% av celleoverlevelsesevne i forhold til kontroll. (B) Kjemiske strukturer av fire mest tilgjengelige forbindelser (C1- citronellal, C2- neo-isopulegol, C3- isopulegol, C4 Citronellol) isolert fra
Litsea cubeba
frø essensielle olje. Det ble ikke observert (C) Prosent av celledød når A549-celler ble eksponert individuelt med disse forbindelser i 72 timer. (D) Virkning av VCO (C2:C3:C4 som 01:01:01) og C4 på celledød ved 72 timer ble observert ved MTT-analyse, som ble visualisert ved mikroskopiske bilder. (E) Celleoverlevelsesevne ble målt ved forskjellige tidsintervaller (24, 48, 72 h) med VCO eksponering på A549-celler. (F) Western blot av Akt-fosforylering ved Thr
308, Ser
473 og total Akt i A549-celler behandlet uten (Con) med C1, C2, C3, C4 og VCO i 36 timer. β-actin servert som intern lasting kontroll. Verdier er gjennomsnitt ± SEM av 3 individuelle eksperimenter. * P 0,05, ** p 0,01 versus kontroll og # p. 0,05 versus C4
Vi har kombinert C2, C3 og C4 ved 01:01:01 ratio for å observere om dampen ut av disse kombinasjonene kan produsere ytterligere eller synergistisk effekt på celledød i løpet av C4. Dampen fra de kombinerte oljer (VCO) viste signifikant (p 0,05) større aktivitet i å drepe A549-celler i forhold til damp C4 alene (figur 1D.) Indikerer at C2 og C3 frembringe ytterligere effekter til C4. Vi brukte derfor dampen fra disse kombinerte oljer, dvs. VCO. Når VCO ble eksponert ved forskjellige tidsperioder, celledød oppstod lineært med tiden (fig. 1E), noe som indikerer muligheten for apoptose-induksjon av VCO. Vi har utført forsøk for å undersøke potensialet til C1, C2, C3, C4-forbindelse ved å bestemme inhibering av Akt-aktivering. Siden det i A549 lungekreftceller pakt blir konstitutivt uttrykt, er Akt fosforylering tatt som markør for å vurdere den anticancer-effekt. C4 viste større hemmende virkning sammenlignet med andre forbindelser (C1, C2, C3), men VCO som er en kombinasjon av C2, C3 og C4 produserte signifikant høyere inhiberende virkning sammenlignet med C4 (fig. 1F). På dette tidspunkt hvorvidt VCO produserer cytotoksisk effekt på normale lungeceller ville være en relevant spørsmål. Å observere dette, damper av C2, C3, C4 individuelt og VCO ble utsatt for primærkultur lungeceller fremstilt fra rotte. Damp fra oljer og VCO ikke gi noen ugunstig virkning på cellemorfologi når sammenlignet med ubehandlede celler. I tillegg har vi også fastslått at inhibering av pakt grunn av VCO i normale lungeceller, og fant at det ikke var noen endring i pakt (fig. S1A og B). Alle disse tyder på at ved denne dosen av VCO, normale lunger celler påvirkes ikke mens samme dose gjennomføres betydelig dødelighet av lungekreft celler.
VCO induserer apoptose i lungekreftceller
For å undersøke VCO effekt på A549 lungekreft celledød, brukte vi dobbelt fluorescens farging med 6-CFDA og Annexin V-Cy3 for å differensiere de levende, apoptotiske og nekrotiske celler. VCO-indusert translokasjon fosfatidylserin fra den indre til den ytre paknings av plasmamembranen ble gjenkjent av fosfatidylserin-bindende protein Annexin V, konjugert med Cy3. 36 timer, kontroll A549-celler viste farging kun med 6-cfda (grønn), mens behandling med VCO økt antall Annexin V-Cy3 (rød) og 6-cfda (grønn) dobbelt-farget celler (Fig. 2A) og denne økte med tiden indikerer forbedring av apoptotiske celler (fig. 2B). For å utvide vår observasjon videre, brukte vi JC-1 fluorescerende fargestoff for å undersøke mitokondriemembranen potensial. I levende celler, på grunn av den fysiologiske membranpotensialet, JC-1 forbundet med den mitokondriale membran og danner J-aggregater som avgir rød fluorescens mens depolarisert mitokondriemembranen i apoptotiske celler inneholdt monomere JC-1 som fluorescerer grønn. Det kan ses fra fig. 2C som A549-celler ble mitterende rød fluorescens mens VCO inkuberes cellene ble merket med grønn fluorescens indikerer cellulær apoptose. VCO indusert apoptotisk celledød i lungekreftceller var også tydelig fra DNA stige på grunn av oligonucleosomal fragmentering av kromatin (Fig. 2D). Disse resultatene tyder på at VCO induserer apoptose bare i lungekreftceller.
(A) Annexin-Cy3 (rød) og 6-cfda (grønn) dobbel farging av apoptotiske celler ble undersøkt ved fluorescens-mikroskopering hvor VCO behandlet A549 cellene viste både grønne og røde flekker og kontroll (ubehandlet) celler farget grønn bare. (B) Prosent av apoptotiske A549-celler ble målt ved forskjellige tidspunkter (0 h, 12 h, 24 h, 36 h) med VCO behandlinger. (C) Mitokondriell membranpotensialet ble observert i kontroll og VCO eksponert (36 h) A549 lungekreftceller ved JC-1-farging assay. (D) apoptotisk DNA-fragmentering ble observert ved VCO behandlede A-549-celler på 1,5% agarosegel-elektroforese. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** p 0,01 versus kontroll (0 timer). Bar representerer 20 mikrometer.
Hemming av Akt fosforylering av VCO påvirker nedstrøms signalering for celleoverlevelse
I flertallet av kreftceller, er Akt en primær valg for terapeutisk intervensjon siden det spiller en nøkkelrolle i å fremme udødelighet og spredning av kreftceller. Fosforylering av Akt på Thr
308 og Ser
473 er avgjørende for å opprettholde disse to viktige egenskaper. VCO behandling dramatisk redusert Akt fosforylering på Thr
308 og Ser
473 uten nevneverdig endring av total Akt protein nivå i A549 kreftceller (Fig. 3A, B øvre panel). 36 h av VCO behandling redusert pakt Thr
308 nivå med 70% og pakt Ser
473 nivå med 95% sammenlignet med 0-t, dvs. kontroll kreftceller (Fig. 3A, B lavere panel). Dette indikerer at VCO sterkt deaktiverer Akt som tillater apoptotiske veien til fremgang. Aktivering av Akt er regulert av to diskrete kinases- mTOR og PDK1, er tidligere ansvarlig for Akt fosforylering på Ser
473 mens sistnevnte phosphorylates på Thr
308. Vi undersøkte derfor PDK1 fosforylering og mTOR uttrykk som svar på VCO. Det var signifikant nedgang av PDK1 fosforylering og mTOR-ekspresjon i A549 cellene på grunn av VCO eksponering (fig. 3C, D). Siden Akt medierer dens virkning på hemming av apoptose via Bad, deaktivering av Akt grunn av VCO kan alvorlig kompromisser med aktiveringen av Bad.
