Abstract
Bakgrunn
metastaser til regionale lymfeknuter via lymfekar spiller en nøkkelrolle i kreft progresjon. Tumor lymphangiogenesis er kjent for å fremme lymfatisk metastase, og vaskulær endotelial vekstfaktor C (VEGF-C) er et kritisk aktivator av tumor lymphangiogenesis under prosessen med metastasering. Vi har tidligere identifisert periostin som en invasion- og angiogenese fremmende faktor i hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC). I denne studien, oppdaget vi en ny rolle for periostin i tumor lymphangiogenesis.
Metoder og funn
Periostin overekspresjon oppregulert VEGF-C mRNA uttrykk i HNSCC celler. Ved å bruke kondisjonert medium fra periostin-overekspresjon HNSCC celler, undersøkte vi tube dannelsen av lymfatisk endotelceller. Betinget media fra periostin-overekspresjon celler forfremmet tube formasjon. Å vite sammenhengen mellom periostin og VEGF-C, sammenlignet vi Periostin uttrykk med VEGF-C uttrykk i 54 HNSCC tilfeller ved immunhistokjemi. Periostin uttrykk var korrelert godt med VEGF-C uttrykk i HNSCC tilfeller. Dessuten ble det observert korrelasjon mellom periostin og VEGF-C-sekresjon i serum fra pasienter HNSCC. Interessant, periostin selv fremmet tube dannelsen av lymfatiske endotelceller uavhengig av VEGF-C. Periostin-forfremmet lymphangiogenesis ble formidlet av Src og Akt aktivitet. Faktisk mulig sammenheng mellom periostin og lymfatiske status i periostin-overekspresjon xenografttumorer og HNSCC tilfeller ble observert.
Konklusjoner
Våre funn tyder på at periostin selv samt periostin-indusert oppregulering av VEGF-C kan fremme lymphangiogenesis. Vi foreslår at periostin kan være en markør for prediksjon av ondartede atferd i HNSCC og et potensielt mål for fremtidig terapeutisk intervensjon for å hindre tumor lymfatisk invasjon og lymphangiogenesis i HNSCC pasienter
Citation. Kudo Y, Iizuka S, Yoshida M Nguyen PT, Siriwardena SBSM, Tsunematsu T, et al. (2012) Periostin direkte og indirekte fremmer Tumor Lymphangiogenesis av hode og nakke kreft. PLoS ONE 7 (8): e44488. doi: 10,1371 /journal.pone.0044488
Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu «, Italia
mottatt: 19 april 2012; Godkjent: 03.08.2012; Publisert: 30 august 2012
Copyright: © Kudo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Grants-in-Aid fra departementet for utdanning, vitenskap og kultur i Japan (Y. Kudo og T. Takata), en Stipendiat Unge Forskere og utmerket unge forskere Seas Besøk Program fra Japan Society for Promotion of Science (S. Iizuka), og en Kurozumi Memorial Foundation grant (Y. Kudo). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser: Forfatter. Masahiro Maeda er ansatt av Immuno-Biologiske Laboratories, Co., Ltd. endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Millioner av mennesker dør hvert år av metastatisk kreft. Metastasering skjer via blod eller lymfekar eller direkte inn i vev og kroppshulrom. Selv om biokjemiske mekanismene for metastasering er dårlig forstått, er prosessen antas å være systematisk i stedet for tilfeldig [1]. Regionale lymfeknuter er ofte de første stedene i spredning, antagelig på grunn av svulst celle drenering via pre-eksisterende afferente lymfekar og /eller nydannede lymfatisk kapillærer [2], [3]. Hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) er en av de mest vanlige typer kreft hos mennesker, med en årlig forekomst på over 500.000 tilfeller på verdensbasis [4]. Litteraturen tyder på at den viktigste årsaken til den høye dødeligheten er at sykdommen er ofte ikke diagnostisert eller behandlet før det har nådd et avansert stadium. Til tross for aggressive, tverrfaglige behandlingsmetoder, inkludert preoperativ eller postoperativ kjemoterapi og /eller strålebehandling med rekonstruktiv kirurgi, har 5-års overlevelse av HNSCC ikke bedret seg vesentlig i løpet av de siste 20 årene [5]. Som de fleste andre epiteliale kreftformer, HNSCC utvikler seg i en flertrinnsprosess gjennom opphopning av flere genetiske og epigenetiske forandringer. Den viktigste prognostiske indikator for HNSCC pasienter er metastaser til cervical lymfeknuter eller fjerne organer [6]. Vi har tidligere etablert en HNSCC cellelinje fra et metastatisk lymfeknute [7] og brukt en
in vitro
invasjon assay for å isolere en meget inngripende klon fra denne cellelinjen [8]. Vi deretter sammenlignet transkripsjons profiler av foreldre HNSCC celler og meget inngripende klone av microarray analyse og identifiserte periostin (osteoblastspesifikk faktor 2) som genet mest forskjellig uttrykt i invasiv klone [9]. Periostin er et utskilt protein som er blitt foreslått for å fungere som et celleadhesjonsmolekyl for pre-osteoblaster og til å delta i osteoblast rekruttering, festing, og sprer [10], [11]. Periostin overekspresjon forbedret invasjon og forankringsuavhengig vekst i HNSCC celler [9]. Interessant, periostin-overekspresjon celler var aggressivt invasiv og spontant spredning til cervical lymfeknuter og til lungene i en orthotopic musemodell av HNSCC [9]. Bao et al. viste også at en tykktarmskreft cellelinje med lavt metastatisk potensiale vist påfallende akselererende tumormetastatisk vekst i en dyre xenograft modell av metastaser når konstruert for å overuttrykke periostin [12]. Disse funnene tyder på at periostin overekspresjon kan være vanlig i ulike typer kreft, og at periostin kan være viktig for tumorinvasjon. Periostin har tidligere blitt vist å stimulere metastatisk vekst ved å indusere angiogenese [12], [13] og forbedrer VEGF reseptor Flk-1 /KDR ekspresjon i endotelceller gjennom et integrin αvβ3-FAK-mediert signalveien [13]; Videre øker rekombinant periostin kapillær formasjon
in vitro product: [14]. Viktigere, har kliniske studier av periostin ekspresjon i humane krefttyper viste at økt ekspresjon av periostin korrelerer med antallet tumorblodkarene og med metastase [14]. På den annen side, tidligere immunhistokjemiske studier viste en mulig sammenheng mellom periostin ekspresjon og lymfeknutemetastase i krefttilfeller [15]. Men det er ingen studier på rollen periostin i tumor lymphangiogenesis. I denne studien, viser vi en ny handling av periostin: direkte og indirekte markedsføring av tumor lymphangiogenesis
Resultater
VEGF-C oppregulert ved periostin overekspresjon fremmer tube dannelsen av lymfatiske endotelceller
Vi har tidligere identifisert periostin som en invasjon fremmende faktor ved å sammenligne genuttrykk profiler av de overordnede HNSCC celler (MSCC-1) og en meget inngripende klone (MSCC-Inv1) [9] (figur 1A). VEGF-C ble også oppregulert i meget inngripende klone av microarray analyse (figur 1A). Økt VEGF-C uttrykk i MSCC-Inv1 celler i forhold til overordnede cellene ble observert (figur 1B). Videre, i vår forrige microarray analyse for å sammenligne genuttrykket profilen mellom kontroll og periostin-overekspresjon HNSCC celler, ble VEGF-C oppregulert i periostin-overekspresjon celler [9]. Her fikk vi bekreftet at ektopisk overekspresjon av periostin oppregulert VEGF-C uttrykk (figur 1B). Både periostin og VEGF-C ble oppdaget i kondisjonert medium fra periostin-overekspresjon celler, men ikke kontroll celler (Figur 1b). VEGF-C er kjent for å være en kritisk aktivator av tumor lymphangiogenesis under prosessen med metastasering. Derfor undersøkte vi tube dannelsen av lymfatisk endotelceller ved å legge kondisjonert medium fra tomme vektor transfekterte celler eller periostin-overekspresjon celler til TR-LE celler. TR-LE celler ble tidligere etablert som en udødeliggjort rotte lymfatisk endothelial cellelinje [16]. Kondisjonert medium fra periostin-overekspresjon celler bemerkelsesverdig fremmet tube dannelsen av TR-LE celler (figur 1C og 1D).
(A) Schema viser strategi for å identifisere Periostin og VEGF-C ved å sammenligne genuttrykket profilen mellom morselskapet (MSCC-1 celler) og en meget inngripende klone (MSCC-Inv1 celler). (B) høyere ekspresjon av VEGF-C-mRNA i celler av meget inngripende klon MSCC-Inv1 og VEGF-C-ekspresjon i periostin-overekspresjon celler. HSC4 celler uten periostin uttrykk ble omformet ved hjelp av en retroviral plasmid koding Hexa-histidin-merket periostin. Periostin og VEGF-C-mRNA-ekspresjonsnivåer i MSCC-1-celler, MSCC-Inv1 celler, tom vektor-transfiserte celler HSC4 (tomme) og periostin-overuttrykkende celler (HSC4 His-periostin) ble undersøkt ved hjelp av RT-PCR. GAPDH ekspresjon ble anvendt som en kontroll lasting. Betinget media ble samlet fra tomme vektor transfektert HSC4 celler (tom) og periostin-overekspresjon HSC4 celler (Hans-periostin) etter inkubasjon i 4 dager. Betinget media ble konsentrert og analysert ved western blotting for ekspresjon av Hans-periostin og VEGF-C i kondisjonert medium. (C), kondisjonert medium fra periostin-overekspresjon celler fremmer tube dannelsen av lymfatisk endotelceller. Tube dannelsen av TR-LE celler ved å legge kondisjonert medium fra periostin-overekspresjon celler. TR-LE-celler ble sådd ut på Matrigel-belagte brønner i nærvær av kondisjonert medium fra tomme vektor-transfekterte (kontroll CM) eller periostin-overekspresjon (periostin CM) HSC4 celler. Etter inkubering i 0-9 timer ble lengdene av rør-lignende strukturer som dannes evaluert. Figuren viser celler etter inkubering i 9 timer. (D) Grafen viser tube score etter 0-9 timers inkubasjon av kontroll CM eller periostin CM. Søylene viser gjennomsnittsverdiene og SDS fra 3 uavhengige eksperimenter.
For å demonstrere effekten av periostin-indusert VEGF-C uttrykk på tube formasjon, brukte vi VEGF reseptor 3 (VEGFR-3) kinase inhibitor MAZ51, som er rapportert å blokkere både VEGF-C- og VEGF-D-indusert fosforylering av VEGFR-3 i PAE-celler [17]. TR-LE-celler er kjent for å uttrykke VEGFR-3 [16]. Vi bekreftet at MAZ51 markert hemmet VEGF-C-indusert tube dannelse (Figur S2A og S2B). MAZ51 sterkt hemmet tube dannelse indusert av kondisjonert medium fra periostin-overekspresjon celler (Figur S2A og S2B). Inhiberingen av røret dannelse ved MAZ51 i kondisjonert medium fra tomme vektor-transfiserte celler, ble også observert. Denne hemmingen kan gjøres rede for etter VEGF-C sekresjon fra lymfatiske endotelceller selv. Den hemmende effekten av MAZ51 var lav i celler behandlet med kondisjonert medium fra tomme vektor-transfekterte celler (figur S2C). Disse funnene tyder på at periostin kan fremme lymphangiogenesis gjennom oppregulering av VEGF-C.
Korrelasjonen av periostin uttrykk med VEGF-C og lymfatiske status i kliniske krefttilfeller
For å bestemme sammenhengen mellom periostin og VEGF -C uttrykk nivåer i kliniske krefttilfeller, sammenlignet vi periostin uttrykk med VEGF-C uttrykk i 54 HNSCC tilfeller av immunhistokjemisk analyse. Vi definert gradering av periostin og VEGF-C-farging så høy (over 10% av tumorcellene som viser ++ +++ eller intensitet) eller lavt (ingen farging eller mindre enn 10% av tumorcellene som viser intensitet +). For det kriterium av 10% positive celler, vurderte vi at HNSCC tilfeller med mindre enn 10% av tumorcellene som viser svak /fokal immunopositivity var samme som HNSCC tilfellet uten noen positiv farging. Figur 2A viser et representativt tilfelle av høy ekspresjon av både periostin og VEGF-C. Både Periostin og VEGF-C-ekspresjon ble observert i cytoplasma av HNSCC-celler (figur 2A). Faktisk, de fleste tilfeller med høy uttrykk for periostin eller VEGF-C viste sterk og diffus immunopositivity som vist i figur 2A og de fleste tilfeller med lav uttrykk for periostin eller VEGF-C viste ingen immunopositivity som vist i figur S3A. Bare noen få tilfeller viste det heterogene farging (figur S3b). For heterogene flekker, vi helt evaluert antallet fargede celler og deres fargeintensitet ved å sjekke minst ti områder, inkludert overflatiske, sentrale og dype invasive områder av svulsten. Av de 54 HNSCC tilfellene ble høy uttrykk for periostin observert i 39 (72,2%) tilfeller og høy ekspresjon av VEGF-C i tilfeller (figur 2B) 37 (68,5%). Tretti-tre av de 39 (84,6%) HNSCC tilfeller med periostin uttrykk uttrykt VEGF-C; denne korrelasjonen var statistisk signifikant (P 0,001).
(A) Immunhistokjemisk farging for periostin og VEGF-C i HNSCC tilfeller. Representative HNSCC tilfeller (høy og lav forstørrelse) med periostin og VEGF-C uttrykk vises. Scale bar er vist på hvert bilde. (B) Diagram viser VEGF-C uttrykk status i HNSCC tilfeller med høy eller lav uttrykk for periostin. (C) Serum nivå periostin og VEGF-C i 81 HNSCC pasienter ble undersøkt med ELISA. Serumnivå av periostin og VEGF-C ble sammenlignet med tumorstadiet. Grafen viser andel av periostin eller VEGF-C positive saker i forskjellige tumorstadium (fra trinn 1 til 4). (D) serumnivået av periostin og VEGF-C ble sammenlignet med lymfeknutemetastase. Grafen viser prosentandelen av periostin eller VEGF-C-positive tilfeller i tilfeller med eller uten lymfeknutemetastaser (E) serumnivået av periostin ble sammenlignet med serumnivået av VEGF-C. Grafen viser andel av VEGF-C positive saker i tilfeller med periostin positiv eller negativ.
Som både periostin og VEGF-C utskilles proteiner, vi undersøkte serumnivåene av periostin og VEGF-C i HNSCC pasienter ved hjelp av ELISA. I denne studien brukte vi perifert blod samlet fra 81 HNSCC kreftpasienter. Disse tilfellene var forskjellig fra saker som brukes i immunhistokjemisk undersøkelse. Klinisk informasjon, inkludert lymfeknutemetastaser, tumorstadium og TNM klassifikasjon ble samlet fra kirurgiske registreringer av pasientene (Tabell S2). I prøver fra 5 friske kontroller, periostin serumnivået var 0 ng /ml og VEGF-C serumnivå mindre enn 11,0 ng /ml (data ikke vist). Periostin ble oppdaget på 11,4 ng /ml i kondisjonert medium fra MSCC-Inv1 celler. Basert på disse resultatene, ble en periostin-positiv tilfelle definert som å ha et serumnivå periostin 0 ng /ml og en VEGF-C-positive tilfelle som å ha et serum VEGF-C nivå ≥12.0 ng /ml. Prosentandelen av periostin-positive tilfeller økes med den fasen av progresjon og med lymfeknutemetastaser (figur 2C og 2D). Dataene på serumnivåer av periostin og VEGF-C og de relevante kliniske data på HNSCC pasienter er listet opp i tabell S2. Prosentandelen av VEGF-C-positive tilfeller også økes med den fasen av progresjon og med lymfeknutemetastaser (figur 2C og 2D). Interessant, 32,4% av periostin-positive tilfeller, men bare 18,2% av periostin-negative tilfellene var VEGF-C-positive (figur 2E).
Periostin direkte fremmer tube dannelsen av lymfatiske endotelceller
som vist ovenfor, fant vi at periostin uttrykk korrelert godt med VEGF-C uttrykk. Periostin har tidligere blitt vist å fremme angiogenese, som vist ved flere funn: (i) periostin forsterker VEGF-reseptor Flk-1 /KDR ekspresjon i endotelceller gjennom et integrin αvβ3-FAK-mediert signalveien [13], (ii) rekombinant periostin forbedrer kapillar formasjon [12], og (iii) øket ekspresjon av periostin er korrelert med antall blodkar og med metastaser i HNSCC [14]. På den annen side, klinisk-patologiske undersøkelser viste at periostin var godt korrelert med lymfeknutemetastase i forskjellige cancere [15]. Disse funnene gjort oss hypotese at periostin kan direkte påvirke til lymfatiske endotelceller i likhet med vaskulære endotelceller. Derfor undersøkte vi om periostin kanskje direkte fremme lymphangiogenesis. Vi undersøkte effekten av periostin på tube dannelsen av TR-LE celler. I tidligere rapporter, 100 ng /ml av rekombinant periostin protein ble anvendt for
in vitro eksperimenter
[12], [13]. Shao et al. undersøkt Flk1 uttrykk etter behandling med rekombinant periostin (0, 50, 100 og 250 ng /ml). Som 100 ng /ml periostin bemerkelsesverdig oppregulert Flk1 uttrykk, brukte de 100 ng /ml periostin i sine studier. I vår ELISA analyse, vi har oppdaget 11,4 ng /ml periostin i kondisjonert media fra MSCC-Inv1 celler. I tillegg har vi oppdaget 0 til 15,1 ng /ml periostin i serum fra pasient HNSCC (tabell S2). Selv om 100 ng /ml periostin synes å være høy konsentrasjon, tenkte vi at konsentrasjonen av periostin kan være høyere i lokal tumorområdet enn i serum. I tillegg har vi funnet at periostin fremmet rør formasjon i en konsentrasjonsavhengig måte (0, 50, 100 og 200 ng /ml) (figur S4), og effekten av 100 ng /ml periostin på røret dannelse er bemerkelsesverdig (figur 3A -C og fig S4). Selv om 100 ng /ml periostin synes å være høyere nivå sammenlignet med fysiologisk nivå, brukte vi 100 ng /ml periostin i følgende studier. 100 ng /ml VEGF-C ble anvendt som en positiv kontroll for lymphangiogenesis. I ulike studier, 100 ng /ml VEGF-C ble anvendt for
in vitro eksperimenter
[18] – [20]. Interessant, behandling med rekombinant periostin fremmet rør formasjon i forhold til ingen behandling (figur 3A og 3B). Overraskende er effekten av periostin på røret dannelsen var lik den til VEGF-C (figur 3C). Videre samtidig behandling med periostin og VEGF-C markant fremmet rør dannelse (figur 3D og 3E).
(A) TR-LE-celler ble sådd ut på Matrigel-belagte brønner i nærvær av periostin (100 eller 200 ng /ml) eller VEGF-C (100 ng /ml). Etter inkubering i 1-9 timer ble lengdene av rør-lignende strukturer som dannes evaluert. Figuren viser celler etter inkubering i 9 timer. (B) Grafen viser tube score etter inkubasjon i 1-9 timer. Søylene viser gjennomsnittsverdiene og SDS fra 3 uavhengige eksperimenter. (C) Grafen viser tube rilleforhold etter behandling med VEGF-C eller periostin i 9 timer. Røret resultatet av kontrollen ble definert som 1,0. (D) TR-LE-celler ble sådd ut på Matrigel-belagte brønner i nærvær av periostin (100 ng /ml) og VEGF-C (100 ng /ml). Etter inkubering i 1-9 timer ble lengdene av rør-lignende strukturer som dannes evaluert. Grafen viser røret stillingen etter inkubasjon i 1-9 timer. Søylene viser gjennomsnittsverdiene og SDS fra 3 uavhengige eksperimenter. (E) Grafen viser tube rilleforhold etter behandling med VEGF-C og periostin i 9 timer. Røret resultatet av kontrollen ble definert som 1,0. (F) Periostin fremmer Src og Akt fosforylering. Nivåene av total og fosforylerte formene for Src, Akt, ERK, og FAK etter behandling av TR-LE celler med periostin (100 ng /ml) vist av western blotting. p-aktin-ekspresjon ble anvendt som en kontroll lasting. (G) Lengdene av rør-lignende strukturer dannet av TR-LE-celler inkubert i 1-9 timer med rekombinant periostin (100 ng /ml) med eller uten SU6656 (400 nM) ble evaluert. Den øverste grafen viser tube score etter inkubasjon i 1-9 timer. Søylene viser gjennomsnittsverdiene og SDS fra 3 uavhengige eksperimenter. Den nederste grafen viser tube poengsum forholdet. Røret resultatet av kontrollen ble definert som 1,0. (H) Lengdene av rør-lignende strukturer dannet av TR-LE-celler inkubert i 1-9 timer med rekombinant periostin (100 ng /ml) med eller uten LY294002 (10 pM) ble undersøkt. Den øverste grafen viser tube score etter inkubasjon i 1-9 timer. Søylene viser gjennomsnittsverdiene og SDS fra 3 uavhengige eksperimenter. Den nederste grafen viser tube poengsum forholdet. Røret score på kontroll ble definert som 1,0.
Vi har undersøkt hvordan periostin fremmer lymphangiogenesis ved hjelp western blotting med fosforylering-spesifikke antistoffer for å bestemme aktivitetsnivået av cellesignalmolekyler, som Src, Akt, ERK og FAK, i periostin behandlet TR-LE celler. Src og Akt men ikke ERK og FAK ble aktivert ved rekombinant periostin behandling (figur 3F). For å bekrefte rollen Src og Akt i periostin fremmet lymphangiogenesis, brukte vi SU6656 å hemme Src aktivitet og LY294002 å hemme Akt aktivitet. Disse kinase hemmere hemmet periostin-indusert tube dannelse av TR-LE celler (Figur 3G og 3H), noe som tyder på at periostin-indusert lymphangiogenesis kan være mediert av Src og Akt aktivitet.
Deretter undersøkte vi effekten av periostin på spredning og migrasjon av TR-LE celler. Rekombinant periostin bare litt fremmet cellevekst (figur 4A), men i stor grad fremmet migrasjon (figur 4B). Focal adherens, som er klynger av inte med opphopning av flere cytoskeletal og signalproteiner rundt inte cytoplasmatiske domener, ha betydelige effekter på cellemigrasjon og signalering. Derfor undersøkte vi effekten av periostin på dannelsen av fokale sammenvoksninger. Vi Last tryptinisert TR-LE celler på dekkglass belagt med PBS eller rekombinant periostin og farget for fokale sammenvoksninger med anti-vinculin antistoff og for F-aktin med phalloidin. TR-LE celler effektivt festet og raskt gjenvunnet sin morfologi på periostin-belagt dekkglass sammenlignet med PBS-belagt dekkglass (Figur 4C). Spesielt, TR-LE celler dannet mange vinculin holdig fokale sammenvoksninger på de periostin belagt, men ikke de PBS-belagte dekkglass (Figur 4C). Forbedring av rør formasjon ved periostin kan påvirkes av markedsføringen av migrasjon og økt fokale adhesjon.
(A) spredning av TR-LE celler etter rekombinant periostin behandling. Celler ble sådd ut på fibronektin-belagte 24-brønners plater på 1,5 x 10
4 /brønn. Etter pre-inkubering ved 33 ° C i 24 timer, ble temperaturen endret og rekombinant periostin (100 ng /ml) ble tilsatt til mediet. Cellene ble trypsinert og telt 0, 2, 4 eller 6 dager etter tilsetning av rekombinant periostin. Søylene viser gjennomsnittsverdiene og SDS fra 3 uavhengige eksperimenter. (B) Effekten av periostin på celle migrasjon av TR-LE celler. Celler ble sådd ut på filtre forhåndsbelagt med 10 ug av fibronektin. Det nedre kammer inneholdt 0,5 ml serumfritt medium med eller uten 100 ng /mL rekombinant periostin. Etter inkubering i 4 timer ble celler som hadde migrert til de nedre overflatene av filtrene visualisert ved farging hematoksylin og telles. Analysen ble gjentatt 3 ganger. Figuren viser celler som hadde migrert til den lavere overflaten av filteret (øvre panel). Diagrammet viser antallet celler i de nedre overflatene av de filtre med eller uten periostin (100 ng /ml) (nedre panel). (C) TR-LE-celler ble sådd ut på dekkglass belagt med PBS eller rekombinant periostin (200 ng /ml) og fikk feste seg i 60, 120, 180, eller 240 min. Cellene ble farget med Alexa Fluor 488-phalloidin antistoff og anti-vinculin-FITC antistoff. DNA ble visualisert ved 4 «, 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI) farging.
Periostin uttrykk korrelerer bra med antall lymfatiske endotelceller i kliniske kreftprøver
Å kjenner rolle periostin i tumor lymphangiogenesis
in vivo
, bekreftet vi korrelasjonen mellom periostin ekspresjon og antallet av lymfekarene i en tumor xenograft modell i nakne mus. Vi har tidligere injisert kontroll eller periostin-overekspresjon HNSCC celler subkutant i hårløse mus og funnet ut at transplanterte periostin-overekspresjon celler produsert relativt større tumorvolumet etter 28 dager enn gjorde tom vektor-transfekterte celler [9] (Figur S5). Vi brukte disse tumorvev (10 styre- og 10 periostin-overuttrykkende svulster) for å telle antallet av lymfekar som uttrykker LYVE-1, som ble spesielt observert i lymfekar i både kontroll og periostin-overuttrykkende tumorer (Figur 5A og figur S4). Interessant, antall lymfeårer var signifikant høyere i periostin-overekspresjon tumorer (36,3 ± 11,1) enn i kontroll tumorer (14,95 ± 2,0) (figur 5B).
(A) Periostin-overekspresjon (periostin) og tom vektor-transfektert (kontroll) HSC2 celler (1 x 10
7 celler) ble individuelt injisert subkutant på 2 steder i hver av 5 nakne mus. Etter en måned ble tumorene resekterte og farget med et anti-mus LYVE-1 antistoff som gjenkjenner lymfekar. Representative tilfeller av immunhistokjemisk farging for LYVE-en i kontroll og periostin-overekspresjon svulster vises. Pilen viser LYVE-1 positive lymfekar. (B) De LYVE-1 positive lymfekar i kontroll og periostin-overekspresjon svulster ble talt opp. Grafen viser gjennomsnittlig antall lymfekar i kontroll og periostin-overekspresjon svulster. Søylene viser gjennomsnittsverdiene og SDS.
Til slutt, vi undersøkt sammenhengen mellom periostin uttrykk og lymfatiske status i HNSCC tilfeller ved immunhistokjemi hjelp av D2-40 antistoff. Den D2-40 antistoff spesifikt anerkjent lymfatiske endotelceller, men ikke blodårer (data ikke vist). Lymfekar ble ujevnt fordelt i hele svulster. Vi telles antall lymfekar i intratumoral (innen svulsten) og peritumoral (innen 1 mm fra invasive foran) områder. HNSCC tilfeller med periostin uttrykk hadde en tendens til å ha høyere antall lymfekar i både intratumoral og peritumoral områder (figur 6A og 6B), men denne korrelasjonen var ikke statistisk signifikant. Som forventet, D2-40 farging uthevet tilstedeværelsen av lymfatisk invasjon. Av 54 HNSCC tilfeller, 27 (50%) oppviste lymfekar invasjon av tumorceller. Påfallende, ble periostin uttrykk observert i 25 av 27 HNSCC tilfeller med lymfatisk invasjon (figur 6C). Periostin uttrykk var signifikant korrelert med lymfatisk invasjon (
P
0,001).
(A) Periostin og D2-40 uttrykk nivåer ble undersøkt ved immunhistokjemisk farging av HNSCC case prøver. En representant tilfelle av periostin og D2-40 uttrykk i HNSCC vises. Pilen viser D2-40 positive lymfekar. (B) Grafen viser sammenligningen mellom gjennomsnittlig antall lymfeårer i intratumoral, peritumoral, og total områder i HNSCC tilfeller med høy eller lav uttrykk for periostin. (C) Grafen viser status for lymfatisk invasjon i HNSCC tilfeller med høy eller lav uttrykk for periostin.
Diskusjoner
Den samlede fem års overlevelse for HNSCC, en av de vanligste kreftformene, er lav, hovedsakelig på grunn av tilbøyelighet av noen svulster til å spre via lymfekar. Faktisk er spredning til lymfeknuter en av de sterkeste dårlige prognostiske indikatorer. Nyere studier med dyremodeller tyder på at solide tumorer kan indusere lymphangiogenesis som igjen kan fremme tumorspredning [21]. Videre kan lymphangiogenesis forekomme ved siden av eller innenfor kreftformer og korrelerer med lymfeknutemetastase [22], [23]. Vi har tidligere vist at antallet lymfekar i begge intratumorale og peritumoral områder var godt forbundet med en økt tendens til knutepunkt-metastase i HNSCC [24]. Mens lymphangiogenesis i primære svulster er kjent for å forutsi nodal metastaser, forblir dens mekanisme uklart.
Vi har tidligere identifisert periostin som en invasjon fremmende faktor ved å sammenligne genuttrykk profiler av foreldre og svært invasive klone HNSCC celler [9] . Periostin, opprinnelig kalt osteoblastspesifikke faktor-2 (Osf2), ble først identifisert i ben, hvor det ble innblandet i regulering av osteoblast adhesjon og differensiering [10], [25]. Akkumulert bevis viser at høyt uttrykk for periostin er ofte observert i ulike kreftformer og korrelerer godt med ondartet oppførsel [15]. Nylig har periostin blitt avslørt for å stimulere metastatisk vekst ved å indusere angiogenese [13], [14]. Periostin utskilles av tumorceller virker på en parakrin måte for å øke overlevelse av endoteliale celler og induserer neovaskularisering, i samsvar med forestillingen om at forbedret overlevelse av intratumorale endotelceller er kritisk for vellykket tumor angiogenese [26] – [28]. Vår forrige microarray analyse av foreldre og svært invasive klone HNSCC celler funnet at VEGF-C ble oppregulert i den svært invasive celler [9] (Figur 1A og 1B). Faktisk periostin overekspresjon indusert oppregulering av VEGF-C uttrykk i HNSCC celler, og VEGF-C protein ble utskilt fra periostin-overekspresjon HNSCC celler (figur 1B). VEGF-C, den opprinnelige Flt-4 /VEGFR-3 ligand [29], [30], er et medlem av VEGF-familien av polypeptid-vekstfaktorer, som består av VEGF-A, -B, -C, -D og parapoxvirus ORF virus VEGFs [31], [32]. Basert på sin ekspresjon profil og dens binding til FLT-4, og VEGF-C vært implisert i utviklingen av lymfesystemet [33], [34]. Videre transgen overekspresjon av VEGF-C under keratin 14 promoteren induserer lymfekar utvidelse i huden [35], og rekombinant VEGF-C induserer lymphangiogenesis i dama chorioallantoic membranen [36]. Aktivering av VEGF-C /Flt-4 akse i lymfatiske endotelceller kan lette metastase ved å øke dannelsen av lymfekar i og rundt svulster [37]. VEGF-C /Flt-4 akse uttrykkes derfor ikke bare ved lymfatisk endotel-celler, men også av en rekke humane tumorceller. Som vi forventet, klimaanlegg media fra periostin-overekspresjon HNSCC celler fremmet tube dannelsen av lymfatisk endotelceller. Videre er VEGFR-3-kinase inhibitor inhiberte røret formasjonen indusert av kondisjonert medium fra periostin-overuttrykkende celler, hvilket antyder at periostin-promo lymphangiogenesis kan være forårsaket delvis av økt sekresjon av VEGF-C fra kreftceller (figur S2B). Ved å bruke kliniske prøver, viste vi at periostin uttrykk korrelert godt med VEGF-C uttrykk i HNSCC tilfeller av immunhistokjemi og at serum periostin nivå korrelert godt med det av VEGF-C i HNSCC pasienter (figur 2E). I denne studien, kunne vi ikke påvise periostin i serum fra 5 normale friske frivillige. Tidligere rapporter viste at ville rekke serum periostin (0,2 til 194 ng /ml) ble påvist hos friske frivillige [35] – [38]. Dermed serumnivået av periostin i normale friske frivillige synes å være kontroversiell, og det er fortsatt uklart om periostin er produsert av normale celler eller ikke. I fremtiden vil vi undersøke serumnivået periostin i stort antall friske frivillige. Men alle rapporter med denne studien viste at økt nivå av periostin ble observert hos kreftpasienter [38] – [41]. Viktigere, serumnivå av periostin og VEGF-C ble godt korrelert med tumorprogresjon inkludert lymfeknutemetastase.
