Abstract
CD47 er et vidt uttrykte celleoverflate-protein som fungerer som en regulator av fagocytose mediert av celler av medfødte immunsystemet, slik som makrofager og dendrittiske celler. CD47 tjener som ligand for en reseptor på det iboende immunceller, SIRP-alfa, som i sin tur leverer en inhibitorisk signal for fagocytose. Vi har tidligere funnet økt uttrykk av CD47 på primære humane akutt myelogen leukemi (AML) stamceller, og vist at blokkering monoklonale antistoffer rettet mot CD47 aktivert fagocytose og eliminering av AML, non-Hodgkin lymfom (NHL), og mange solide svulster i xenograft modeller. Her rapporterer vi utviklingen av en humanisert anti-CD47 antistoff med potent effekt og gunstige toksikokinetiske egenskaper som en kandidat terapeutisk. Et nytt monoklonalt anti-humant CD47-antistoff, 5F9, ble generert, og antistoff humanisering ble utført ved poding av dens komplementære bestemmende regioner (CDR) til en human IgG4 format. Den resulterende humanisert 5F9 antistoff (Hu5F9-G4) bundet monomert menneskelig CD47 med en 8 nM affinitet. Hu5F9-G4 indusert potent makrofag-mediert fagocytose av primære humane AML celler in vitro og helt utryddet menneske AML in vivo, som fører til langsiktig sykdomsfri overlevelse av pasient-avledet xenografter. Videre til Hu5F9-G4 synergized med rituximab eliminere NHL engraftment og kurere xenopodet mus. Til slutt, toksikokinetiske studier i ikke-humane primater viste at Hu5F9-G4 kan trygt administreres intravenøst i doser i stand til å oppnå potensielt terapeutiske serumnivåer. Dermed er Hu5F9-G4 aktivt utviklet for og er inngått kliniske studier hos pasienter med AML og solide tumorer (ClinicalTrials.gov identifikator: NCT02216409).
Citation: Liu J, Wang L, Zhao F, Tseng S, Narayanan C, Shura L, et al. (2015) Pre-kliniske Utvikling av en humanisert anti-CD47 antistoff med Anti-Cancer terapeutisk potensial. PLoS ONE 10 (9): e0137345. doi: 10,1371 /journal.pone.0137345
Redaktør: Kevin D. Bunting, Emory University, USA
mottatt: 02.06.2015; Godkjent: 14 august 2015; Publisert: 21.09.2015
Copyright: © 2015 Liu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:.. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra California Institute for Regenerative Medicine og finansiering fra Virginia og DK Ludwig fond for kreftforskning
Konkurrerende interesser: JL, RM, og ILW har innlevert internasjonal patentsøknad WO 2011/143624 A2 tittelen «Humaniserte og kimære monoklonale antistoffer mot CD47». JL, RM, ILW, SW, JV, MH, og SP har innlevert patentsøknad nummer PCT /US2014 /018 743 med tittelen «metoder for å oppnå terapeutisk effektive doser av anti-CD47 agenter «. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Utviklingen av kreft krever normale celler til å tilegne seg metoder for å dysregulate spredning, unngå programmert celledød, og få mange av de andre kjennetegnene til kreft [1]. I tillegg må kreftcellene unngå programmert celle fjerning, som er den fagocytisk eliminering av avvikende celler av celler av den medfødte immunsystemet, inkludert makrofager, dendrittiske celler, nøytrofiler og [2]. Stimulering av programmert celle fjerning benytter en rekke pro-fagocyttiske signaler, hvorav mange ikke er molekylært karakterisert, men kan omfatte protein signaler slik som calreticulin [3], fosfolipider slik som fosfatidylserin, og unormal glykosylering. Imidlertid er hemmingen av programmerte cellefjerning hovedsakelig inhiberes ved en enkelt dominerende molekyl, CD47. Alle menneskelige kreft studert til nå, inkludert både solide svulster og leukemi, hurtig CD47, noe som gjør CD47 en universell mål i kreft hos mennesker.
Menneskelig akutt myelogen leukemi (AML) er en aggressiv malignitet av benmarg stamceller, preget av en økning i umodne hvite blodceller og benmargssvikt. AML er den vanligste typen av akutt leukemi påvirker voksne, med en dårlig prognose og noen terapeutiske alternativer. Gjeldende standard vare for medisinsk skikkede AML pasienter består av høydose kjemoterapi, ofte inkludert allogen hematopoietisk celletransplantasjon. Selv med disse aggressiv behandling, som forårsaker betydelig sykelighet og dødelighet, er tilbakefall vanlig og fem-års overlevelse er bare 30-40%. Dessuten er de fleste pasienter over 65 år og er ikke kandidater for høye doser med kjemoterapi, noe som fører til en fem-års overlevelse på 5-10% i denne gruppen [4,5].
Siste studier har vist at AML er organisert som en mobil hierarki initiert og vedlikeholdt av leukemi stamceller (LSC) som besitter de kanoniske stamcelleegenskaper av selvfornyelse og kapasitet til å generere store antall leukemistamfedre og blasts [6,7]. En viktig implikasjon av denne kreftstamcelle modellen er at LSC må elimineres for kur; imidlertid LSC har vist motstand mot standard kjemoterapi og strålebehandling [8,9]. Identifikasjon av celleoverflatemolekyler fortrinnsvis uttrykt på klinisk relevante AML stamceller har en attraktiv strategi for utvikling av nye AML behandlingsformer, da disse celleoverflatemolekyler kan tjene som potensielle mål for monoklonal antistoffterapi. En rekke celleoverflatemolekyler fortrinnsvis uttrykt på AML LSC sammenlignet med normale humane hematopoietiske stamceller og forløperceller er blitt identifisert, inkludert CD47 [10].
CD47 besitter en enkelt immunoglobulin variabel region (IGV) -lignende ekstracellulære domenet og regulerer flere cellulære prosesser involvert i immunresponser [11]. Det er allment uttrykt på hematopoietiske og ikke-hematopoietiske celler; Men vi tidligere funnet at CD47 ble mer høyt uttrykt på AML LSC enn sine vanlige kolleger, og at økt CD47 uttrykk i AML er assosiert med dårlig klinisk utfall [6,7,12]. CD47 gjør en rekke protein-protein interaksjoner inkludert
i cis
med inte og
i trans
med to ligander, thrombospondin-1 (TSP-1) og signal regulatorisk protein alfa (SIRPα). SIRPα koder en Ig-super reseptor som cytoplasmatiske region inneholder immunoreceptor tyrosin-basert hemming motiver (ITIMs) og uttrykkes på makrofager, dendrittiske celler og nevroner [13-18]. Ved å binde CD47, SIRPα initierer en inhiberende signaltransduksjon kaskade via rekruttering av src-homologi-2-domene som inneholder protein tyrosin fosfataser SHP-1 og SHP-2, som på sin side leverer signaler hemmende for fagocytose [19-22]. I normal fysiologi, ble CD47 oppdaget å være en alder markør på mus RBC-er, som utviser gradvis avtagende ekspresjon av CD47 sannsynlig fører til deres eventuelle fagocytisk fjernelse av sinusformede makrofager i milt, noe som tyder på at mer alderen RBCs vil trolig være mest utsatt for ekstravaskulær fagocytose av CD47 blokkerende antistoffer [17,18,23].
den komplekse prosessen med fagocytose avhenger av den relative balansen mellom pro-fagocyterende og anti-fagocyterende innganger [2]. Basert på disse observasjoner har vi foreslått en modell der leukemiceller akkumulerer pro-fagocyttiske signaler, hvorav mange ikke er molekylært karakterisert. Som en konsekvens, er leukemi-celler som uttrykker høye nivåer av CD47 sannsynlig valgt for å motvirke pro-fagocyttiske signaler. På denne måten, leukemiceller er avhengig av CD47 ekspresjon for å forhindre fagocytisk eliminering av medfødte immunceller [24].
Fra denne modellen forutsagte vi at blokade av CD47-SIRPα interaksjon ville resultere i dominans av pro- fagocyttiske signaler som resulterer i fagocytose av leukemicellene. Vi har bekreftet denne hypotesen ved å vise at en tilgjengelig blokkering av mus anti-human CD47-antistoff, B6H12, stimulert fagocytose og redusert belastningen av AML innpoding i primære, humane xenograft-modeller [6]. Vi antok også at en blokkerende anti-CD47-antistoff vil virke synergistisk med et andre antistoff i stand til å binde Fc-reseptorer og levere en potent pro-fagocyttiske signaler. I samsvar med denne ideen, fant vi at B6H12 og rituximab potent synergized i utryddelsen av NHL i xenograft modeller [25]. Til slutt, ble CD47 ekspresjon detektert på kreftceller fra mange hematologisk og solide tumorer, og vi har funnet at B6H12 aktivert fagocytose av primære humane kreftceller in vitro, hemmet veksten av orthotopically xenotransplanted humane tumorer, og hindret den metastasering av humane tumorceller [ ,,,0],26-30].
Sammen er disse studier tyder på at en humanisert blokkerer anti-CD47 antistoff kan være et effektivt anti-kreft terapeutiske både som monoterapi og i kombinasjoner. I den foreliggende undersøkelse, rapporterer at det er utvikling av en ny humanisert anti-humant CD47-antistoff, til betegnet Hu5F9-G4, som genereres av komplementaritetsbestemmende region (CDR) poding på en human IgG4 stillas minimal rekrutteringen av antistoff-Fc-avhengig effektorfunksjoner. Hu5F9-G4 indusert potent makrofag-mediert fagocytose av primære humane AML celler in vitro og helt utryddet menneske AML in vivo, som fører til langsiktig sykdomsfri overlevelse av pasient-avledet xenografter. Videre til Hu5F9-G4 synergized med rituximab eliminere NHL engraftment og kurere xenopodet mus. Til slutt, toksikokinetiske studier i ikke-humane primater viste at Hu5F9-G4 kan trygt administreres intravenøst i doser i stand til å oppnå potensielt terapeutiske serumnivåer. Dermed er Hu5F9-G4 aktivt utviklet for kliniske studier i menneskelig AML og solide tumorer.
Materialer og metoder
Antistoff generasjon
Et cDNA fragment av humant CD47 som koder ekstracellulære domene ble klonet fra en full-lengde human CD47 cDNA (Åpen Biosystems) og ble fusjonert med muse-Fc for å generere et CD47 /MFC-fusjonsprotein, som ble brukt til å immunisere mus for å produsere monoklonalt mus anti-humane CD47 antistoffer. Hybridomer ble generert ved hjelp av standardprotokoller. Kort fortalt ble 4-6 uker gamle Balb /c-mus immunisert med renset rekombinant huCD47 /MFC-fusjonsprotein to ganger i uken i totalt 4 uker. Titere ble vurdert deretter, og miltcellene ble fusjonert med SP2 /0-celler. Hybridomer ble valgt ut og supernatanter fra de resulterende kloner ble screenet ved hjelp av enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) og fluoriserende aktivert cellesortering (FACS).
Antistoff V kloning og sekvensering
kloningsstrategien anvendt her involverte en innledende RNA isolert fra hybridomceller (Qiagen). CDNA-sekvenser som koder for de tunge og lett-kjede variable områder av 5F9 monoklonalt antistoff ble oppnådd ved anvendelse av 5 «RACE-PCR-teknikker (Clontech) og ble sekvensert ved anvendelse av standard DNA sekvenseringsteknikker.
Molekylær modellering og antistoff humanisering
Humanisering av mus anti-CD47-antistoff 5F9 ble utført ved å installere CDR-rester fra mus-antistoff på et humant kimlinje rammeverk (FR) [31]. Kort fortalt ble mus 5F9 humanisert ved forstandig rekruttering av tilsvarende CDR-rester. Forskjeller mellom mus 5F9 og de menneskelige FR restene ble individuelt modellert for å undersøke deres mulige innvirkning på CDR konformasjon. Humanisert VH og VL gener ble syntetisert ved McLab (South San Francisco, California).
Cell transfeksjon
293F celler ble dyrket under FreeStyle ™ 293 Expression Medium (Invitrogen). Forbigående transfeksjon ble utført ved ko-transfeksjon av ekspresjonsvektorer som koder for antistoff tungkjede og lettkjede ved hjelp av 293fectin transfeksjon reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Fire til fem dager senere, ble supernatanter fra de transfekterte cellene høstet og testet for antistoff-sekresjon ved hjelp av ELISA. I korthet ble 96-brønners plater (Nunc, Roskilde, Danmark) belagt med 1 pg /ml geite-anti-humant Fc-gamma-antistoff i fosfat-bufret saltvann (PBS) i 16 timer ved 4 ° C. Etter blokkering i 1 time med 0,4% BSA i PBS ved romtemperatur, ble isolerte supernatanter tilsatt i 1/3 sekvensielle fortynninger og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Platene ble deretter vasket tre ganger og inkubert med HRP-konjugert geite-anti-humant kappa-spesifikt antistoff i 1 time ved romtemperatur. Etter vasking ble platene utviklet med OPT. Reaksjonen ble stanset med 2 M H
2SO
4, og OD ble målt ved 490 nM.
Antistoff rensing og karakterisering
kultur supernatanten ble påført på protein A sepharose-kolonner (GE Healthcare). Kolonnen ble vasket med PBS, og protein ble deretter eluert med eluering buffer (0,1 M natrium-citrat-buffer, pH 3,0). Oppsamlede fraksjoner ble nøytralisert med 1 M Tris pH 9,0. Til slutt ble det rensede prøvene dialysert mot PBS. Renheten av den eluerte antistoffet fraksjon ble analysert ved hjelp av natriumdodecylsulfat polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) på 10% geler under reduserende eller ikke-reduserende betingelser. Bånd ble visualisert ved Coomassie brilliant blå farving.
Cell-overflateantigen-bindingsanalysen
YB2 /0 celler som var blitt stabilt transfektert med human CD47 ble inkubert med 10 ug /ml Hu5F9-G4 eller HuIgG4 ved 4 ° C i 1 time. Deretter ble cellene vasket med PBS tre ganger, etterfulgt av incabation med 10 ug /ml PE-merket anti-humant Fc-gamma-spesifikt antistoff (eBiosciences, San Diego, CA, USA) ved 4 ° C i 1 time. Binding ble målt ved hjelp av en FACSCanto (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Un-transfekterte YB2 /0 celler ble anvendt som en negativ kontroll.
konkurranse ELISA
A kompetitive bindingsanalyse ble brukt til å evaluere den antigen-bindende spesifisitet av anti-CD47-mAbs. I korthet ble 96-brønners plater (Nunc, Roskilde, Danmark) belagt med 1 pg /ml huCD47 /MFC-fusjonsprotein i fosfat-bufret saltvann (PBS) i 16 timer ved 4 ° C. Etter blokkering i 1 time med 0,4% BSA i PBS ved romtemperatur, 10 ug /ml biotin-merket 5F9 mus ble tilsatt til platene i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av umerket Hu5F9-G4 ved romtemperatur i 1 time. Platene ble deretter vasket tre ganger og inkubert med HRP-konjugert streptavidin (Thermo Scientific Pierce) i 1 time ved romtemperatur. Etter vasking ble platene utviklet med OPT. Reaksjonen ble stanset med 2 M H
2SO
4, og OD ble målt ved 490 nM.
antistoffaffiniteten måling
A cynomolgus CD47 cDNA ble klonet fra cynomolgus milt-cDNA-bibliotek (BioChain, Kina). Det ekstracellulære domene av CD47 cynomolgus ble klonet og fusjonert til muse Fc for å generere et cynoCD47 /MFC-fusjonsprotein, som ble benyttet i affinitets-målingen. Humant CD47 /MFC ble gjort ved å fusjonere det ekstracellulære domene av human CD47 cDNA (Open Biosystems) med mus Fc som beskrevet ovenfor og anvendt for måling av dimerisk bindingsaffinitet til Hu5F9-G4. I tillegg er human CD47 /hans fusjonsprotein ble fremstilt ved å smelte sammen det ekstracellulære domene av human CD47 til His-tag og anvendt for måling av monomere bindingsaffinitet til Hu5F9-G4. Bindingsstudier ble gjort ved hjelp av en Biacore 2000 (GE). Rennende buffer var 10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,005% Tween-20. Data ble samlet inn ved 25 ° C. Hver prøve ble mAb amin koplet til en CM4 sensor chip ved å bruke standard NHS /EDC aktivering (7 minutter). Hvert antistoff ble fortynnet til 10 ug /ml i 10 mM NaAcetat pH 5,0 og injisert inntil det ønskede nivå av immobilisering ble oppnådd. Hver flate ble deretter blokkert med 1 M etanolamin i 7 minutter. Hver prøve ble testet i duplikat.
CD47-interaksjon SIRPα blokkeringsanalyse
96-brønners plater (Nunc, Roskilde, Danmark) ble belagt med 1 pg /ml SIRPα /human Fc-fusjonsprotein i fosfat-bufret saltvann (PBS) i 16 timer ved 4 ° C. Etter blokkering i 1 time med 0,4% BSA i PBS ved romtemperatur ble 1 ug /ml CD47 /mus Fc-protein tilsettes enten i fravær eller nærvær av økende konsentrasjoner av Hu5F9-G4 ved romtemperatur i 1 time. Platene ble deretter vasket tre ganger og inkubert med et HRP-konjugert anti-muse-Fc-sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. Etter vasking ble platene utviklet med OPT. Reaksjonen ble stanset med 2 M H
2SO
4, og OD ble målt ved 490 nM. Hver prøve ble testet i tre paralleller.
In vitro
fagocytose analysen
In vitro fagocytose ble utført som beskrevet tidligere. I korthet, HL-60 eller primære humane AML-celler fra forskjellige pasienter ble CFSE-merket og inkubert med humane perifere blodmakrofager i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av mus 5F9, Hu5F9-G4, eller et isotype kontroll-antistoff i 2 timer ved 37 ° C. Cellene ble vasket med IMDM serumfritt medium og resuspendert i 200 ul media. Deretter ble cellene analysert ved fluorescens mikroskopi for å bestemme den fagocytisk indeks (antall celler inntatt per 100 makrofager). Statistisk analyse ved hjelp av Student t test ble utført med GraphPad Prism.
antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC) assay
ADCC ble utført i henhold til instruks fra Acella-TOX ™ Bioluminesens Cytotoksisitet kit (Cell Technology). I korte trekk, ble human-PBMC inkubert over natten ved 10
6 celler /ml i IMDM-human komplett medium med 400 enheter /ml IL-2 (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA). Den neste dag, aktiverte PBMC ble anvendt som effektorceller. 5 x10
3 HL60-celler i 25 pl IMDM-human komplett medium ble tilsatt per brønn i en U-bunn 96-brønners plate. Deretter ble 25 ul IMDM-human komplett medium inneholdende forskjellige antistoffer ved de ønskede konsentrasjoner tilsatt til hver brønn. Etter 5 minutters inkubering ved 37 ° C, 2,5 x 10
5 PBMC i 25 ul IMDM human komplett medium ble tilsatt til hver brønn for å gi et forhold mellom effektorceller og målceller på 50: 1. Blandingene ble inkubert ved 37 ° C i 4 timer, etterfulgt av påvisning ved anvendelse av reagenser levert av settene. Analysene ble gjentatt tre ganger og representative tallene er vist her.
komplementavhengig cytotoksisitet (CDC) assay
5 x 10
4 målceller i 50 mL IMDM + 10% FBS + Pen /Strep ble tilsatt i hver brønn i en 96-brønners U-bunnplate. 50 ul av antistoff ble tilsatt i forskjellige konsentrasjoner (fortynnet med medium), med start fra 10 ug /ml til 10
-5 ug /ml, sammen med 100 x fortynning intervaller. Blandingen ble inkubert ved romtemperatur i 5 minutter, og deretter 50 ul human komplementserum ble tilsatt til hver brønn, blandet og platen ble inkubert ved 37 ° C. Etter 2 timers inkubasjon, 50 ul Alamar blue (ABD Serotec) ble tilsatt i hver brønn, blandet og platen ble inkubert ved 37 ° C over natten. På den neste dag, ble platen avkjølt til værelsestemperatur i 15 minutter og lest av SpectraMax plateleser M3 for fluorescens-signaler ved eksitasjonsbølgelengde på 530 nm og emisjonsbølgelengde på 590 nm. Relativ fluorescens enhet (RFU) var bruker til å indikere relative mengden for levende celler etter analysen. Analysene ble gjentatt tre ganger og representative tallene er vist her.
CD47 reseptorer analysen
CD47 bindende standardkurve på AML celler ble gjort ved hjelp av AF488-konjugert Hu5F9-G4 ved forskjellige konsentrasjoner. Reseptorer ble målt ved å inkubere målcellene med umerket Hu5F9-G4 under forskjellige konsentrasjoner, og deretter ble cellene enten analysert i
in vitro
fagocytose eller inkuberes med en mettende konsentrasjon av AF488-Hu5F9-G4, basert på standardkurve og analysert for binding ved hjelp av strømningscytometri. -reseptorer Ble beregnet som følger:
Apoptose assay
humane primære AML-celler ble tint og levedyktige mononukleære celler ble isolert ved sentrifugering over Ficoll ved bruk av standardprotokoller. Levedyktige celler ble resuspendert ved 1×10
6 per 50 ul i IMDM + 5% FBS. 10 ug /ml Hu5F9-G4 eller isotype kontroll-antistoff ble tilsatt, og cellene ble inkubert ved 37 ° C i 3 timer. Staurosporin ble anvendt som en positiv kontroll. Apoptotiske celler ble identifisert ved farging med Annexin V (BD Biosciences, Cat. # 556547) i henhold til produsentens instruksjoner og analysert ved flowcytometri.
In vivo
antistoff behandling av menneskelig AML innpodet mus
Alle mus forsøkene ble utført i henhold til en Institutional Animal Care og bruk komité-godkjent protokoll (Stanford APLAC # 22264) og i tilslutning til National Institutes of Health
guide for omsorg og bruk av forsøksdyr
. Alle musene i denne studien ble kjøpt fra The Jackson Laboratory eller avlet i huset. Enhver dyr som viste vekttap, slapphet, krum holdning, eller ruffled pels som ikke ble bedre innen en uke etter behandling med Nutrical og væsker ble avlivet. Vi avlives dyrene ved sykelig per institusjonelle protokoller
Det var to grupper av mus i studiene:. Kontrollgruppen behandlet med mus-IgG og forsøksgruppen ble behandlet med Hu5F9-G4 antistoff. Dødsfall var forventet i kontrollgruppen på grunn av beinbrudd marg fra fulminant leukemi. Den eksperimentelle gruppen overlevde godt og ble avlivet ved slutten av studien.
kryopreserveres celler fra menneskelige prøve SU028, SU048, og SU266 ble tint i 10 ml medier (IMDM + 10% FBS + Glutamax + penicillin streptomycin) og 100 ug DNase i (StemCell) for å utføre T-celle-uttømming. I korthet ble cellene vasket og resuspendert i Robosep buffer. Human CD3-positiv utvelgelse 18051-høy gjenopprettingsprogram ble valgt, og etter programmet er avsluttet, ble den CD3- fraksjon, telles, og forberedt for intravenøs injeksjon i HBSS (livet IT) + 2% FBS-buffer (Omega Science). Menneskelig primære AML xenograft modell ble etablert i NOD /SCID /IL-2Rgnull (NSG) hunnmus 8-10 uker gamle. Mus ble kondisjonert med 200 rad ved hjelp av en Faxitron CP-160 gammastråle inntil 24 timer før intravenøs injeksjon. 100 ul av 5 x 10
6 primære AML-celler ble deretter injisert i mus NSG ved halevenen med en Terumo 29 G nål. På 5 uker etter transplantasjonen, ble benmargceller aspirert fra femur ved hjelp av BD 27g nåler og farget med mus anti-mus CD45.1 PECy7 (eBiosciences, San Diego, CA, USA), rotte anti-mus Ter119 PECy5 (eBiosciences , San Diego, CA, USA), mus anti-human CD45 PB (BD Biovitenskap, San Jose, CA, USA), mus anti-human CD3 APC-Cy7 (BD Biovitenskap, San Jose, CA, USA), mus anti- human CD33 PE (BD Biovitenskap, San Jose, CA, USA), og mus anti-human CD19 APC (BD Biovitenskap, San Jose, CA, USA). Prosentandelen av humane CD45 + CD33 + AML-celler ble bestemt ved flow-cytometri. Basert på den humane celle AML innpoding nivå, ble fem mus transplantert med hver SU028 eller SU048 prøven inndelt i en av to behandlingsgrupper: mus IgG kontroll eller Hu5F9-G4 på 100 ug daglig ved intraperitoneal injeksjon. Behandlingen startet på dag 1 og varte i 14 sammenhengende dager. Serum ble samlet ved forbehandling og 2 timer etter behandling etter første, femte, åttende, 12., og 14. doser for PK analyse. Benmargceller ble aspirert ved ulike tidspunkt for å analysere AML engraftment. En komplett blodprosent ble analysert en gang i måneden ved hjelp HemaTrue Hematologi Analyzer. På dag 159 ble overlevende mus tatt ned for histologi analyse av tibia bein. For behandling av mus transplantert med SU266, ble fire eller fem er tilordnet til en av tre behandlingsgrupper: mus-IgG-kontroll, Hu5F9-G4 på 100 ug daglig, og Hu5F9-G4 på 500 pg to ganger i uken. Behandlingen startet på dag 1 og varte i 14 dager. Serum ble oppsamlet ved forbehandlingen og 2 timer etter behandling for PK-analyse. Benmargceller ble aspirert ved ulike tidspunkt for å analysere AML engraftment. Alle mus ble fulgt for total overlevelse, og p-verdien for å overleve i Hu5F9-G4 behandlede grupper ble sammenlignet med mus IgG kontrollgruppene. I slutten av studien, ble musene avlivet ved bruk av CO2 til gnager aktiv dødshjelp.
Synergy av Hu5F9-G4 og rituximab i Raji Luc-EGFP innpodet NSG mus
Mus ble innpodet med Raji Luc-EGFP ved en konsentrasjon på 1 million celler /mus via haleveneinjeksjon. De ble fotografert
in vivo
å bestemme nivået av engraftment sju dager etter engraftment. Behandling begynte samme dag i 21 påfølgende dager. Alle mus ble injisert via intraperitoneal injeksjon. Musene ble fotografert
in vivo
via IVIS Spectrum Imaging System på følgende tidspunkter: Pre-behandling på dag 7 av engraftment, Post sju doser på dag 14 av engraftment, Post fjorten doser på dag 21 av engraftment, Post tjueen doser på dag 28 og en uke etter behandling på dag 35. Survival vurderingen ble utført på dag 217. i slutten av studien, ble musene avlivet ved bruk av CO2 til gnager aktiv dødshjelp.
toksisitetsstudie i ikke-menneskelige primater
Alle ikke-menneskelige primater eksperimenter ble utført i henhold til en Institutional Animal Care og bruk komité-godkjent protokoll (Stanford APLAC # 26070) og i tilslutning til National Institutes of Health
guide for omsorg og bruk av forsøksdyr
. Apene ble sosialt plassert (oppdatering til 3 dyr av samme kjønn og dosering gruppe sammen) i rustfritt stål bur utstyrt med et rustfritt stål etasje og en automatisk vanning ventil. Alle primær kabinetter var i samsvar med det som er angitt i USDA dyrevernloven (9 CFR, del 1, 2 og 3) og som beskrevet i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr (National Research Council. Guide for Care og bruk av forsøksdyr Washington, DC.. National Academy Press Current edition). Hvert bur var tydelig merket med et bur etikett som indikerer studien, gruppe, dyr nummer, og sex. Temperatur: 64 ° F til 84 ° F (18 ° C til 29 ° C); Fuktighet: 30% til 70%; Lys Cycle: 12 timer lys og 12 timer mørke (unntatt i utpekte prosedyrer); Ventilasjon: Ti eller flere luftvekslinger per time med 100% frisk luft (ingen resirkulering)
For doseeskaleringsstudie ble to hunndyr registrert og dosert på en ukes mellomrom. En NHP ble administrert en enkelt dose av EPO (17000 U /kg) 5 dager før den første dosen av Hu5F9-G4 (3, 10, 30, 100 og 300 mg /kg), og en NHP ble administrert Hu5F9-G4 (1, 3, 10 , 30, og 100 mg /kg) uten noen forbehandling av EPO. Blodprøver ble tatt for måling av fullstendige blodtellinger, inkludert hemoglobin og for Hu5F9-G4 serumnivået.
I separate NHP studier, kvinnelig cynomolgusape ble administrert en enkelt 1-times intravenøs infusjon på 0,1, 0,3, 1, 3, 10 eller 30 mg /kg av Hu5F9-G4 eller PBS kjøretøy som en kontrollgruppe (en dyr per gruppe) på dag 1, eller et primærdose (PD) på dag 1 ved doser på 1 eller 3 mg /kg, fulgt av ukentlige vedlikeholdsdoser (MD) på 10 eller 30 mg /kg Hu5F9-G4 gjennom Day 43. Prøvene er samlet inn i de ulike studiene var som følger:
Hematologi. Enkeltdose: blod ble trukket to ganger før injeksjonene og ved 3, 6, 10 og 14 dager etter administrering. PD /MD dose: blod ble trukket to ganger før injeksjonene og ved 3, 6, 10, 13, 17, 20, 24, 27, 29, 36, og 43 dager etter at administrasjonen
Klinisk kjemi.. Enkeltdose: blod ble trukket to ganger før injeksjoner og ved 6 og 14 dager etter administrasjon. PD /MD dose: blod ble trukket to ganger før injeksjoner og ved 6, 13, 20, 29, 36, og 43 dager etter administrasjon
Urinanalyse.. Enkeltdose: opp til 14 ml urin ble samlet to ganger før injeksjonen og ved 3 og 10 dagen etter injeksjonen. PD /MD dose: opp til 14 ml urin ble samlet to ganger før injeksjonen og ved 3, 10, 17, og 24 dagen etter injeksjonen
Farmakokinetiske analyser.. Blod ble oppsamlet ved venepunksjon inn i rør uten antikoaguleringsmiddel ved forskjellige tidspunkter som vist i figur 4B og 4D. Serumnivå av Hu5F9-G4 ble målt ved ELISA som beskrevet ovenfor ved anvendelse av CD47 /mus Fc-fusjonsprotein som belegget reagens, etterfulgt av deteksjon med et HRP-konjugert anti-human Kappa sekundært antistoff.
Alle dyr ble overvåket to ganger daglig for dødelighet og moribundity sjekker. Kroppsvekt ble målt minst en gang forstudie og ukentlig deretter starter på dag 7.
Resultater
Generering av monoklonale antistoffer mot humant CD47
Et cDNA fragment av humant CD47 som koder for det ekstracellulære domenet fusjonert med muse-Fc for å generere et hCD47 /MFC-fusjonsprotein, som ble brukt til å immunisere mus for å produsere monoklonalt mus anti-humane CD47 antistoffer. Spesifisiteten av utvalgte hybridom-kloner ble undersøkt ved FACS binding til enten foreldre eller humane CD47-transfekterte rotte YB2 /0 celler. En av de positive kloner ble erholdt og betegnet som 5F9. Ved hjelp av universelle antistoff primere, ble tung og lett kjede variable regioner av 5F9 vellykket klonet. Flere kloner av hver V-genproduktet ble sekvensert for å overvåke PCR-induserte feil, og aminosyresekvensene til VH og VL av 5F9 ble bestemt (Fig 1A og 1B). DNA-sekvensanalyse viste at den tunge kjeden av 5F9 anvender et V-segment av IGHV1 familien, og at den lette kjede tilhører IGKV1 undergruppen.
(AB) Sammenligning av mus og humanisert 5F9 variable tunge (A) og lys (B) regioner. CDR er merket som angitt. (C) Rotte YB2 /0 celler som er stabilt transfektert med human CD47 og foreldre YB2 /0-cellene ble farget med humant IgG4-isotype kontroll eller Hu5F9-G4 og analysert for overflatebinding ved strømningscytometri. (D) biotinylert mus 5F9-binding til human CD47 /MFC ble påvist ved ELISA i fravær eller nærvær av økende konsentrasjoner av umerket Hu5F9-G4 eller isotypekontroll. Hver prøve ble analysert i duplikat, og SEM-verdiene er presentert. Indikert p-verdier ble bestemt av Two-Way ANOVA i sammenligning. (E) Binding av Hu5F9-G4 til monomere eller dimere CD47 ble analysert ved overflate-plasmonresonans som ga de angitte rester og bindende konstanter. Dataene ble prosessert ved å subtrahere svar fra referanseflaten, så vel som et gjennomsnitt av buffer injeksjoner. Svarene var globalt skikket til en 1: 1 samhandlingsmodell inkludert et begrep for massetransport. Tallet i parentes representerer standard feil i den siste rapporterte tall.
Molekylær modellering og menneskeliggjøring av 5F9 antistoffet
For å menneskelig 5F9, flere 3D-modeller av Fv av målet antistoff ble bygget ved hjelp av kombinasjoner av kjente strukturer. 2PCP og 2JEL oppviser 93% og 95% identitet til 5F9, respektivt, ble anvendt for VL modellering. 2PCP og 1CIC oppviser 70% og 78% identitet til 5F9, respektivt, ble anvendt for VH modellering. For å velge human-antistoff rammeverk-regioner (FR) som skal anvendes som templater for CDR-poding, ble musen 5F9 VL og VH-områder sammenlignet med de av humane kimlinje-sekvensene. Forsøket ble gjentatt 3 ganger. Forsøket ble gjentatt 3 ganger.
