Abstract
Eukaryote oversettelse initiering faktor 5A2 (EIF5A2) spiller en viktig rolle i tumorprogresjon og prognose evaluering. Imidlertid er lite informasjon tilgjengelig om dens potensielle rolle i magekreft. Denne studien hadde som mål å undersøke funksjonen av EIF5A2 i tumorprogresjon og dets potensielle mekanismer. EIF5A2 ekspresjon ble målt i humane magecancercellelinjer, er udødeliggjort gastrisk mucosal epitelcellelinje (GES-1) og human magekreft vev og kjørt ned av RNA-interferens eller oppregulert ved EIF5A2 plasmid transfeksjon. Celleproliferasjon, migrasjon og invasjon ble vurdert
in vitro
. Nedstrøms målene for EIF5A2 ble undersøkt ved Western blotting. EIF5A2 og dens potensielt mål metastase-assosiert protein 1 (MTA1) uttrykk ble undersøkt i 160 par av menneskelig magekreft og tilstøtende ikke-vevsprøver ved hjelp av immunhistokjemi (IHC) flekker, og dens korrelasjon med clinicopathological funksjoner og overlevelse ble undersøkt. Knockdown av
EIF5A2
eller
MTA1
forårsaket en tilsynelatende undertrykkelse av HGC27 celleproliferasjon, migrasjon og invasjon. Etter knockdown av
EIF5A2
i HGC27 celler, E-cadherin nivåer ble oppregulert og vimentin, ble cyclin D1, cyclin D3, C-MYC og MTA1 nivåer nedregulert. Oppregulering av EIF5A2 i MKN45 celler resulterte i det motsatte. IHC Resultatene viste en positiv sammenheng mellom EIF5A2 og MTA1 uttrykk i mage kreft (
P
0,001). Både EIF5A2 og MTA1 overekspresjon var korrelert med PT scenen (
P
= 0,018 og
P
= 0,042), pN scenen (
P
= 0,037 og
P
= 0.020) og lymphovascular invasjon (
P
= 0,016 og
P
= 0,044). EIF5A2 eller MTA1 overekspresjon var signifikant assosiert med dårlig total overlevelse og sykdomsfri overlevelse (alle
P
0,05). Multivariate analyser identifisert EIF5A2 som en uavhengig prediktor for både total overlevelse (
P
= 0,012) og sykdomsfri overlevelse (
P
= 0,008) i mage kreftpasienter. Våre funn tyder på at EIF5A2 oppregulering spiller en viktig onkogen rolle i magekreft. EIF5A2 kan representere en ny prediktor for dårlig overlevelse og er en potensiell terapeutisk mål for magekreft
Citation. Meng Q-B, Kang W-M, Yu J-C, Liu Y-Q, Ma Z-Q, Zhou L, et al. (2015) Overuttrykte av eukaryote Oversettelse Initiation Factor 5A2 (EIF5A2) korrelerer med Cell Aggressivitet og dårlig overlevelse i magekreft. PLoS ONE 10 (3): e0119229. doi: 10,1371 /journal.pone.0119229
Academic Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, KINA
mottatt: 22 januar 2014; Godkjent: 29 januar 2015; Publisert: 20 mars 2015
Copyright: © 2015 Meng et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Beijing Municipal Natural Science Foundation (No. 7,132,209), Hubei-provinsen helse og familieplanlegging vitenskapelig forskningsprosjekt (nr WJ2015MB137) og Major vitenskap og teknologi prosjekter i Beijing City (No. D141100000414004). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er en meget metastatisk sykdom og en av de mest dødelige av gastrointestinale maligniteter. [1] til tross for fremskritt innen kirurgiske og cytotoksiske terapier for GC, den nåværende behandlinger som er tilgjengelige for pasienter med langt fremskreden GC svært begrenset. [2, 3] for å utvikle nye terapeutiske strategier, er det avgjørende å belyse de molekylære mekanismene som fremmer invasive og metastatiske egenskaper GC celler.
Eukaryote oversettelse initiering faktor 5A2 (EIF5A2) ligger på menneskelig kromosom 3q26.2, og er medlem av
EIF5A
genet familien. [4] overuttrykte
EIF5A2
mRNA i visse humane kreftceller, i motsetning til overekspresjon begrenset til menneskelig testis og deler av hjernen,
EIF5A2
er en potensiell onkogen. foreslår [4] Tidligere studier har funnet at EIF5A2 ble overuttrykt i mange humane kreftformer som bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom, kreft i eggstokkene, leverkreft, lungekreft, tykktarmskreft og føflekkreft , og er korrelert til dårlig overlevelse hos kreftpasienter og /eller kreftcelle aggressivitet. [5-11] Nylige studier har vist at EIF5A2 har kreftfremkallende egenskaper gjennom sin aktivering av EIF5A2-MTA1 /C-MYC aksen. [8] imidlertid lite informasjon er tilgjengelig om EIF5A2 protein uttrykk, sin prognostisk betydning og potensial onkogen rolle i menneskelig GC.
Derfor må vi først undersøkt uttrykk for
EIF5A2
i humane GC cellelinjer og dens potensielle rolle i celle-proliferasjon, migrering og invasjon. Deretter identifiserte vi mulige nedstrøms target proteiner for å belyse effekten av EIF5A2 uttømming eller oppregulering på cellulære funksjoner av GC-celler. Til slutt, analyserte vi korrelasjonen mellom EIF5A2 og MTA1 uttrykk i menneskelig GC og dens relevans for clinicopathological faktorer og overlevelse i GC pasienter.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
studien ble godkjent av etikkomiteen av PUMCH, Chinese Academy of Medical Science og Peking Union Medical College, Beijing, Kina, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient.
Pasienter og prøver
GC vev og matchet vevsprøver tilstøtende ikke-tumor ble innhentet fra 160 påfølgende pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon for primær GC på Peking Union Medical College Hospital (PUMCH) mellom januar 2002 og desember 2006. Ingen pasienter fikk neoadjuvant kjemoterapi eller strålebehandling. Overlevelses data ble oppnådd på grunnlag av både pasientenes poster og telefonoppfølging. Median oppfølgingstid var 53 måneder (range, 1-113 måneder). Ytterligere to par av ferske GC vev og noncancerous gastrisk mucosa vev ble oppnådd fra pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon for dårlig differensiert adenokarsinom i magen ved PUMCH i 2014.
Vi definert lymphovascular invasjon som tilstedeværelse av tumorcelle emboli innenfor områder omgitt av en tydelig visualisert endotelial foring i periferien av tumorsnitt. [12, 13] Pasientene ble satt opp i henhold til den syvende utgaven av AJCC TNM klassifikasjon karsinom i magesekken. [14] Lauren histotype ble delt inn i tarm og diffuse- blandet type kategorier. [15]
Cell kultur
Fem typer menneskelige GC cellelinjer ble hentet fra Cell Center of Shanghai Institutes for Biological Sciences (AGS og MGC803, Shanghai, Kina) og Cell Center of institutt for medisinske basalfag (MKN45, SGC7901 og HGC27, Beijing, Kina). Den foreviget mage mucosal epitel cellelinje GES-en er hentet fra Beijing ComWin Biotech Co., Ltd (Beijing, Kina). Alle celler ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) ved 37 ° C i en fuktet luftatmosfære inneholdende 5% CO
2. Celler i logaritmisk vekstfase ble brukt til videre forsøk.
Pusse EIF5A2 eller MTA1 av små-interfererende RNA (siRNAs)
siRNA spesielt mot EIF5A2 og MTA1 [16] og deres ikke-måls kontroll siRNA (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) ble kjemisk syntetisert for denne studien. De EIF5A2 siRNA-sekvensene var som følger: # 1: 5′-GGAUCUUAAACUGCCAGAATT-3 «, 5′-UUCUGGCAGUUUAAGAUCCTT-3′; # 2: 5»-GGUUCACCUUGUUGGAAUUTT-3 «, 5′-AAUUCCAACAAGGUGAACCTT-3; og # 3: 5»-GCUUCCAGCACUUACCCUATT-3 «, 5′-UAGGGUAAGUGCUGGAAGCTT-3; den ikke-targeting kontroll (NC1) siRNA: 5»-UUC UCC GAA CGU HiG ACG UTT-3 «; 5»-ACG CAC UGA GUU CGG AGA ATT-3 «). De MTA1 siRNA-sekvenser (siRNA Target 2, T2-siRNA) var: 5»-GCUGAGAGCAAGUUAAAGCdTdT-3 «, 5′-GCUUUAACUUGCUCUCAGCdTdT-3») og FAM-merkede siRNA (AM4620) ble anvendt som et ikke-målsøkende kontroll siRNA (NC2 ).
Tjuefire timer etter plating i seks-brønns plater ble GC-celler transfektert med 100pmol EIF5A2-siRNA, MTA1-siRNA eller kontrollere siRNA hjelp Lipofectamine 2000 transfeksjon reagens (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA ) i henhold til produsentens instruksjoner. Cellene ble høstet for western blotting på 48 timer etter transfeksjon.
Plasmid konstruksjon og transient transfeksjon
EIF5A2 uttrykk vektor (PIRES2-EGFP-EIF5A2) ble syntetisert av Life Technologies. Cellene ble transfektert med PIRES2-EGFP-EIF5A2 eller kontroll plasmid hjelp Lipofectamine 2000 (Life Technologies) i henhold til produsentens instruksjoner.
Real-time kvantitativ RT-PCR
Total RNA ble isolert ved hjelp TRIzol reagens (Life Technologies) i henhold til produsentens protokoll. PCR ble utført ved hjelp av sekvenser for EIF5A2: fremover: 5’AACTGCCAGAAGGTGAACTAGG-3 «; omvendt: 5’GTTTCCGTTTATTTGCAGGGT-3 «og sekvensene for MTA1: fremover: 5′-CCGGGCCTGCGAGAGCTGTTACAC-3′; omvendt: 5»-CACGGCTTCCAGCGGCTTGCGTAC-3 «. PCR ble utført ved anvendelse av UltraSYBR Blanding (CWbio.Co.Ltd) i henhold til produsentens protokoll. Revers transkripsjon ble utført ved hjelp av en PrimeScript RT Master Mix kit (TAKARA Bioteknologi Co Ltd, Dalian, Kina). CDNA produkter ble utsatt for real-time PCR ved hjelp av en SYBR Premiks Ex Taq II kit (TAKARA Bioteknologi Co Ltd). Sanntids PCR ble utført i en StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) ved bruk av følgende program: 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 minutt.
GAPDH
mRNA i hver prøve ble kvantifisert som en endogen kontroll.
Western blotting
Proteinkonsentrasjonen ble kvantifisert ved hjelp av en BCA protein assay kit (Thermo Scientific Pierce). Natriumdodecylsulfat polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) ble anvendt for å separere cellelysatene. Proteiner ble overført til PVDF-membraner og blokkert med Tris-bufret saltoppløsning og 0,1% Tween 20 (TBST) inneholdende 5% bovint serumalbumin, og deretter inkubert med følgende primære antistoffer ved 4 ° C over natten: kanin anti-EIF5A2 eller -C- MYC (1: 1000, Epitomics, USA, Catalog # 5549-1 eller 1472-1), kanin anti-MTA1, -E-cadherin eller -vimentin (1: 1000, Cell Signaling, USA, Catalog # 5647, 3195 eller 5741 ), eller mus anti-GAPDH (1: 1000, Santa Cruz, Catalog # sc-25778). Membranene ble vasket tre ganger med TBST og inkubert med pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert anti-kanin eller anti-mus sekundære antistoff (1: 3000, Santa Cruz, USA, katalog # sc-2004 eller sc-2005) i 1 time ved romtemperatur. Proteinbåndene ble synliggjort ved bruk av ECL-påvisning reagenser (Pierce, USA). De relative protein uttrykk nivåer ble normalisert til GAPDH.
Celleproliferering analysen
Spredning av HGC27 og MKN45 celler ble undersøkt ved hjelp av en Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo, Japan ) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, 24 timer etter transfeksjon med siRNA eller plasmid, ble cellene sådd ut ved en tetthet på 1 x 10
4 celler /brønn i 96-brønners plater og dyrket i 0, 24, 48 og 72 timer. Deretter, på forskjellige tidspunkter, ble 10 ul CCK-8-løsning tilsatt til hver brønn og inkubert i 2 timer. Absorbansen ble avlest ved 450 nm på en plateleser.
Transwell analyser
trekkfugl og invasive evne til GC-celler ble oppdaget ved hjelp av 24-brønnen Transwell cellekulturkammer (8.0μm porestørrelse, Costar , Cambridge, MA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. For cellen invasjon analysen, innleggs membraner ble pre-belagt med Matrigel (BD, San Diego, CA, USA). For den cellemigrering analysen, ble det ikke Matrigel anvendt. Ved 24 timer etter transfeksjon ble cellene sådd ut ved en passende tetthet (HGC27, 5 x 10
5 /ml; MKN45, 1 x 10
7 /ml) i det øvre kammer og dyrket i OPTI-MEM (GIBCO, USA) uten FBS i ytterligere 24 timer. Cellene ble tillatt å migrere inn i RPMI 1640 medium inneholdende 20% FBS i bunnkammeret. De ikke-migrerende cellene på den øvre membranoverflate ble fjernet med en bomullstupp, og den vandrende celler festet til den nedre membranoverflaten ble fiksert med 4% paraformaldehyd og farget med H E. Antallet invaderte celler ble talt opp i fem tilfeldig utvalgte områder under et mikroskop.
Immunohistochemistry (IHC) farging og vurdering
IHC farging ble utført på 5 nm tykke seksjoner fra parafin-embedded prøver. Monoklonale kanin anti-human EIF5A2 antistoff (Epitomics, USA, Catalog # 5549-1), kanin anti-human MTA1 antistoff (Cell Signaling, USA, Catalog # 5647) og PV-6000 Polymer Detection System (ZSBG-BIO, Kina) var brukes til farging i samsvar med produsentens anvisninger. I korte trekk, ble lysbilder med parafinsnitt deparaffinized med xylen og rehydrert med etanol. Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert med 3% hydrogenperoksid i 10 minutter. For antigen gjenfinning, slides ble mikrobølgebehandlet og kokt i en 0,01 M citratbuffer (pH 6,0) i 10 minutter, og deretter inkubert med 0,1% trypsin ved 37 ° C i 5 minutter. Glassene ble inkubert med monoklonalt kanin anti-human EIF5A2 eller MTA1 antistoff (1: 100 fortynning) i 1,5 timer ved 37 ° C i et fuktet kammer. Som en negativ farging kontroll ble primært antistoff erstattet med ikke-spesifikt kanin IgG. To uavhengige patologer evaluert immunhistokjemisk farging av EIF5A2 og MTA1. En semikvantitativ scoring metoden ble brukt med referanse til forrige undersøkelse. [7]
Statistisk analyse
Alle analysene ble utført ved hjelp av SPSS 12.0 programvare (Chicago, IL, USA). Den McNemar test ble anvendt for sammenligning av EIF5A2 eller MTA1 farging i human GC og tilstøtende ikke-tumorprøver. Chi-kvadrat test ble brukt for å sammenligne forskjeller mellom kategoriske variabler, mens paret, tosidige Student
t
-UNDERSØKELSER ble brukt for å sammenligne forskjeller mellom kategoriske variabler. Korrelasjonen mellom EIF5A2 og MTA1 ble analysert ved hjelp av Spearmans rank test. For univariat overlevelse analyse, ble overlevelseskurver bygget ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og sammenlignet med Log-rank test. Den Cox modell med multivariate analyser ble benyttet for å undersøke de uavhengige prognostiske faktorer. Alle
P
verdiene var tosidig, og
P
verdier av 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant. Alle forsøkene ble utført i hvert fall i tekniske og biologiske triplicates.
Resultater
EIF5A2 Expression i GC celler og vev og validering av intervensjonen
Vi undersøkte uttrykk for EIF5A2 i fem GC cellelinjer og foreviget mage mucosal epitel cellelinje GES-en
in vitro
av både QRT-PCR (fig. 1A) og western blotting (fig. 1B). EIF5A2 protein i humane vev GC var høyere enn for de sammenkoblede fjerne ikke-tumorvev (Fig. 1C). På grunn av den høye endogene ekspresjon nivå av EIF5A2 og den relativt høye transfeksjonseffektiviteten i HGC27, valgte vi denne cellelinje for RNAi analyse, og valgt MKN45 celler for EIF5A2 oppregulering eksperimenter på grunn av sin relativt lave EIF5A2 ekspresjon og høy transfeksjonseffektivitet.
(A)
EIF5A2
mRNA uttrykk ble undersøkt av sanntids kvantitativ RT-PCR med
GAPDH
tjener som en lasting kontroll. (B) Protein ekspresjon i cellelinjer ble bekreftet ved western blot-analyse med GAPDH som en lasting kontroll. (C) EIF5A2 protein i humane vev GC var høyere enn for de sammenkoblede fjerne ikke-tumorvev. (D) Alle tre EIF5A2-sirnas, spesielt # 1, effektivt undertrykt
EIF5A2
mRNA uttrykk i HGC27 celler. (E) Western blotting viser at EIF5A2 ble slått ned ved behandling av EIF5A2- siRNAs i HGC27 celler. (F)
EIF5A2
mRNA ble betydelig oppregulert ved transient transfeksjon av EIF5A2 plasmider i MKN45 celler. (G) EIF5A2 protein ble signifikant oppregulert ved transient transfeksjon av plasmider EIF5A2 i MKN45 celler. (H og I) T2-siRNA kan effektivt undertrykke MTA1 uttrykk i HGC27 celler.
Alle tre sirnas kan effektivt undertrykker EIF5A2 uttrykk i HGC27 celler (fig. 1D, E). Vi brukte siRNA # 1 som EIF5A2 målrettet siRNA (T1-siRNA) i de påfølgende forsøkene. EIF5A2 ekspresjon var signifikant oppregulert ved transient transfeksjon av plasmider EIF5A2 i MKN45 celler (fig. 1F, G). T2-siRNA kan effektivt undertrykke MTA1 uttrykk i HGC27 celler (Fig. 1 H, I).
EIF5A2 eller MTA1 uttrykk nivåer påvirket aggressivitet av GC-celler in vitro
Knockdown av EIF5A2 ved T1 siRNA signifikant hemmet celleproliferasjon (fig. 2A), migrering og invasjon (fig. 2B) i HGC27 celler sammenlignet med dem av foreldrecellene. Oppregulering av EIF5A2 ved EIF5A2 plasmid ekspresjon fremmet økt proliferasjon (fig. 2C), migrering og invasjon (fig. 2D) av MKN45 celler. Knockdown av MTA1 av T2-siRNA signifikant hemmet celleproliferasjon (fig. 2E), migrering og invasjon (fig. 2F) i HGC27 celler sammenlignet med dem av foreldrecellene.
(A) spredning av EIF5A2 rettede siRNA (T1-siRNA) og ikke-målrettet kontroll (NC) HGC27 celler ble målt ved hjelp av CCK-8-analysen hver 24 timer etter transfeksjon siRNA. (B) Cell migrasjon og invasjon ble redusert etter transfeksjon av T1-siRNA inn HGC27 celler (Student
t
-test,
P
0,001 og
P
= 0,001 , henholdsvis). Kolonne, mener; barer, ± SD (fra tre paralleller). (C) Spredning av EIF5A2-plasmid og kontroll plasmid MKN45 celler ble målt ved hjelp av CCK-8-analysen hver 24 timer etter transfeksjon plasmid. (D) Cell migrasjon og invasjon ble økt etter transient transfeksjon av EIF5A2-plasmid inn MKN45 celler (Student
t
-test,
P
= 2,06 × 10
-5 og
P
= 7,65 × 10
-6, henholdsvis). Kolonne, mener; barer, ± SD (fra tre paralleller). Bilde innsats (B rett og D til høyre) viser et representativt synsfelt fra hver behandling. (E) Spredning av MTA1 rettede siRNA (T2-siRNA) og ikke-målrettet kontroll (NC2) HGC27 celler ble målt ved hjelp av CCK-8-analysen hver 24 timer etter transfeksjon siRNA. (F) Cell migrasjon og invasjon ble redusert etter transfeksjon av T2-siRNA inn HGC27 celler (Student
t
-test, både
P
= 0,001). Kolonne, mener; barer, ± SD (fra triplicates).
Mulig target genekspresjon etter EIF5A2 knockdown eller overekspresjon
Etter knockdown av EIF5A2 i HGC27 celler, nivåene av epitel markør E-cadherin ble oppregulert, mens nivåene av mesenchymale markør vimentin ble nedregulert og ledsaget av spredningsrelaterte proteiner cyclin D1 og cyclin D3 og metastaseassosierte C-MYC og MTA1 downregulation (fig. 3A). I motsetning til dette, etter EIF5A2 overekspresjon i MKN45 celler, ble ekspresjon av E-cadherin nedregulert, mens nivået av vimentin ble oppregulert og ledsaget av cyklin D1, cyklin D3, C-MYC og MTA1 oppregulering (Fig. 3B). Knockdown eller overekspresjon av EIF5A2 hadde ingen signifikant effekt på MMP9 uttrykk i HGC27 og MKN45 celler (fig. 3A, B).
(A) Etter knockdown av EIF5A2 i HGC27 celler, ble E-cadherin nivåer oppregulert, mens vimentin ble nedregulert ledsaget av cyklin D1, cyklin D3 og C-MYC, og MTA1 nedregulering. (B) Ektopisk overekspresjon av EIF5A2 etter transient transfeksjon av EIF5A2-plasmid vesentlig oppregulert cyclin D1, cyclin D3, C-MYC og MTA1, ledsaget av nedregulering av E-cadherin, mens vimentin ble oppregulert.
forening av EIF5A2 og MTA1 uttrykk med clinicopathological funksjoner hos pasienter med GC
Positive signaler med EIF5A2 ble hovedsakelig lokalisert i cytoplasma og cellekjernen av tumorceller, mens MTA1 signaler ble hovedsakelig lokalisert i kjernen av tumorceller (fig. 4). Vi definerte farging verdier av 0-3 som vanlig uttrykk nivået EIF5A2 eller MTA1, mens farging verdier av 4-12 ble definert som overuttrykk av EIF5A2 eller MTA1. EIF5A2 overekspresjon ble funnet i 75 av de vevsprøver, sammenlignet med bare sju av 160 matchet tilstøtende ikke-tumor slimhinnevevet (
P
0,001). Representative IHC-farging av EIF5A2 i moderately- eller dårlig differensiert gastrisk adenokarsinom, kar invasjon tumorceller og ikke-tumorvev er vist i fig. 4A, B, C og D, henholdsvis. Av de 160 sakene som ble analysert, 70 (43,75%) var positive for MTA1, statistisk analyse av uttrykk mønstre viste at det var en positiv korrelasjon mellom EIF5A2 og MTA1 uttrykk (r = 0,510,
P
0,001) . Den typiske fargebilder for overekspresjon av EIF5A2 og MTA1 i adenokarsinom i ventrikkel ble vist i fig. 4E og 4F.
(A) Representative immunhistokjemi bilder som viser EIF5A2 overekspresjon i moderat differensiert adenokarsinom (× 200). (B) Overuttrykte EIF5A2 i dårlig differensiert adenokarsinom i ventrikkel (× 200). (C) Overekspresjon av EIF5A2 i tumorceller å invadere fartøy (x 200). (D) normal ekspresjon av EIF5A2 i ikke-tumorvev (x 100). (E) De typiske fargebilder som viser både EIF5A2 og MTA1 overekspresjon i samme adenokarsinom i ventrikkel; (G) Totalt overlevelseskurver for 160 mage kreftpasienter som får gastrektomi, gruppert i henhold til EIF5A2 uttrykk (
P
0,001). (H) sykdomsfri overlevelse kurver for 145 kreftpasienter mage som får kurativ kirurgi, gruppert etter EIF5A2 uttrykk (
P
= 0,001).
Som vist i tabell 1, både EIF5A2 og MTA1 overekspresjon var positivt korrelert med mer avansert pT stadium (
P
= 0,018 og
P
= 0,042), pN scenen (
P
= 0,037 og
P
= 0,020) og positiv lymphovascular invasjon (
P
= 0,016 og
P
= 0,044), mens de ikke var assosiert med andre clinicopathological funksjoner.
Økt EIF5A2 eller MTA1 uttrykk korrelert med dårligere overlevelse i GC pasienter
i siste oppfølging, hadde 75 av 160 pasienter døde. Av disse 73 mennesker døde av svulst tilbakefall. Kaplan-Meier analyse viste at både 5-års total overlevelse (OS) og sykdomsfri overlevelse (DFS) for EIF5A2 overekspresjon gruppen var kortere enn for normal EIF5A2 uttrykk gruppe (
P
0,001 og
P
= 0,001, fig. 4G, H). Konsekvent, pasienter med MTA1 overekspresjon vises en dårlig prognose for OS og DFS (
P
0,001 og
P
= 0,001)
Variabler med betydning i univariat analyse av. Kaplan-Meier-metoder ble inkludert i multivariat Cox regresjonsanalyser. Som vist i S1 tabell og S2 Table, multivariat analyse avdekket at overekspresjon av EIF5A2 var en selvstendig faktor som påvirker både OS (hazard ratio 1,831, 95% KI 1,135 til 2,857,
P
= 0,012, S1 Table) og DFS (hasardratio 1,880, 95% CI1.177 til 3,002,
P
= 0,008, S2 Table) av pasientene som fikk kurativ reseksjon for GC. Men den overekspresjon av MTA1 ikke produsere uavhengig prognostisk betydning for OS og DFS i multivariat analyse.
Diskusjoner
Eukaryote initiering faktor 5A 2 (EIF5A2) er lokalisert ved en kromosom region ofte bemerket for kromosom ustabilitet i GC og mange andre kreftformer, 3Q. [17-20] EIF5A2, som en av de eneste to isoformer av EIF5A familie, er bekreftet som en onkogen protein og kan også være en viktig biomarkør for prognose og terapeutisk mål av mange typer humane tumorer. [21] Selv om en tidligere studie hadde undersøkt
EIF5A2
genuttrykk i primær GC, gir denne studien den første bevis for den kliniske betydningen av EIF5A2 uttrykk i menneskelig GC og dens mulige rolle i reguleringen av GC celle aggressivitet. [22]
Vi urfremført EIF5A2 knockdown og overekspresjon eksperimenter
in vitro
. Resultatene viste at undertrykkelse av EIF5A2 i HGC27 celler førte til en signifikant reduksjon i celleformering, migrering og invasjon, mens dens oppregulering i MKN45 celler resulterte i det motsatte. Disse resultatene er i samsvar med tidligere funn i andre svulster. [8, 10, 23] Vi har også funnet ut at MTA1 knockdown i HGC27 celler betydelig hemmet celle spredning, migrasjon og invasjon. Men mekanismen som EIF5A2 forbedrer GC celle aggressivitet er fortsatt ukjent.
Derfor har vi utført videre studier av de mulige målene for EIF5A2
in vitro
. Våre resultater viste at EIF5A2 positivt regulert cyclin D1 og cyclin D3, som spiller viktige roller i GC celleproliferasjon og cellesyklusregulering. [24, 25] Alle disse resultatene støtter hypotesen om at EIF5A2 fremmer GC celleproliferasjon via oppregulering av cyclin D1 og cyclin D3. På samme tid, tidligere studier viste at EIF5A2 fremmer celle invasjon /metastase og epitelial-mesenchymale overgang (EMT) ved å aktivere MTA1 /C-MYC in colorectal cancer. [8] MTA1 og C-MYC, samt EMT-programmet, ble også involvert i reguleringen av GC metastaser. [26-28] Vi undersøkte derfor MTA1, C-MYC og to EMT-assosiert markører, E-cadherin og vimentin. Våre studier viser at EIF5A2 positivt regulert MTA1, C-MYC og vimentin og negativt regulert E-cadherin. Alle disse resultatene tyder på at EIF5A2 kan regulere celle migrasjon og invasjon av regulering av MTA1, C-MYC og EMT
in vitro
, men videre studier er nødvendig for å undersøke de nøyaktige mekanismene.
Resultatene av denne studien viste også at EIF5A2 protein var positivt korrelert med PT scenen og pN scenen. Lignende resultater ble også observert i human ovarian cancer. [5] Disse resultater antyder at EIF5A2 kan være forbundet med tumorinvasjon og lymfeknutemetastase i visse typer av humane kreftformer, inkludert GC. Mer interessant, i den aktuelle studien, EIF5A2 overekspresjon ble også funnet i invaderende kreftceller (fartøy invasjon), og overekspresjon av EIF5A2 protein i primær GC vev korrelert med tilstedeværelse av lymphovascular invasjon. I samsvar med resultatene funnet i tidligere studier av andre menneskelige maligniteter inkludert epiteliale ovarietumorer, blære carcinoma, lungekreft og tykktarmskreft, overekspresjon av EIF5A2 i denne studien var korrelert med dårlig overlevelse av pasienter med GC. [5, 8, 29] i tillegg, multivariat analyse viste at EIF5A2 protein er en uavhengig prediktor for dårlig overlevelse hos pasienter som gjennomgår kirurgi for GC.
MTA1, som en kandidat metastase-assosierte genet, er blitt demonstrert å spille en avgjørende rolle i magekreft celle aggressivitet. [27] Overuttrykte MTA1 er signifikant assosiert med dårlig prognose i pN0 GC pasienter. [30] Den aktuelle studien viste at EIF5A2 uttrykk var positivt korrelert med MTA1 uttrykk i menneskelige GC vev. Immunhistokjemisk analyse kombinert i vitro studier vist at EIF5A2-MTA1-aksen kan spille en viktig rolle i magekreft aggressivitet.
I sammendraget, resultatene av denne studien viste at overekspresjon av EIF5A2 var nært knyttet til GC celle proliferasjon, migrering og invasjon via metastase-assosierte proteiner MTA1. På samme tid, kan EIF5A2 være viktige i regulering EMT i GC. Overekspresjon av EIF5A2 kan være en faktor forutsi dårlig overlevelse og en attraktiv terapeutisk mål for GC, men videre studier er nødvendig.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. Analyse av faktorer assosiert med total overlevelse (OS)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0119229.s001 plakater (DOC)
S2 Table. Analyse av faktorer assosiert med sykdomsfri overlevelse (DFS)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0119229.s002 plakater (DOC)
Takk
Forfatterne ønsker å takke Mr De-Tian Wang, Ms Yu Feng Luo og professor Pei Gu for sine tekniske støtte.
