Abstract
Chemoresistance i multiresistente (MDR) celler enn uttrykker P-glykoprotein ( P-gp) kodet av MDR1 genet, er et stort hinder for vellykket cellegift for tykktarmskreft. Tidligere studier har indikert at sinomenine kan øke absorpsjonen av ulike P-gp-substrater. I denne studien undersøkte vi effekten av sinomenine på chemoresistance i tykktarm kreft celler og utforsket den underliggende mekanismen. Vi utviklet multiresistent Caco-2 (MDR-Caco-2) celler etter eksponering av Caco-2-celler til økende konsentrasjoner av doksorubicin. Vi identifiserte overekspresjon av COX-2 og MDR-1-genene, så vel som aktivering av NF-kB signal bane i MDR-Caco-2-celler. Viktigere, fant vi at sinomenine øker følsomheten av MDR-Caco-2 celler mot doxorubicin ved downregulating MDR-1 og COX-2 uttrykk gjennom hemming av NF-kB signalveien. Disse funnene gir en ny potensiell strategi for reversering av P-gp-mediert kreft narkotika motstand
Citation. Liu Z, Duan Z-J, Chang J-Y, Zhang Z-f, Chu R, Li Y-L, et al. (2014) Sinomenine sensitizes multiresistent Colon kreft celler (Caco-2) til doxorubicin ved nedregulering av MDR-1 Expression. PLoS ONE 9 (6): e98560. doi: 10,1371 /journal.pone.0098560
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, Spania
mottatt: 22 januar 2014; Godkjent: 05.05.2014; Publisert: 05.06.2014
Copyright: © 2014 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen finansiering eller støtte til rapporten
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er en av de vanligste ondartede svulster. i gastrointestinal spor. De siste årene har forekomsten av tykktarmskreft betydelig økt i Kina [1]. Kirurgisk reseksjon er den optimale behandling for denne type kreft, mens kjemoterapi tjener som en av de viktigste adjuvant terapi for dens behandling. For tiden er utviklingen av multimedikamentresistens (MDR), en fenotype som kreftceller blir resistente mot et bredt spektrum av kjemoterapeutiske [2], er en stor hindring i kolorektal cancer-kjemoterapi. Det er blitt vist at veksten av MDR i kreftceller er signifikant korrelert med overekspresjon av membranpumpe proteiner, inkludert P-glykoprotein (P-gp) [3].
P-gp, kodet for av MDR- 1-genet, er et medlem av den store ATP-bindende kassett-protein-superfamilien [4]. P-gp er i stand til å pumpe en stor mengde av forbindelser fra intracellulær til ekstra-cellulære nettsteder. Når kreftceller oppstår cellegifter, liposoluble narkotika inn i cellene via konsentrasjonsgradient effekt. Etter binding til P-gp, liposoluble stoffer stadig pumpes utsiden av cellen ved en prosess som drives av ATP-hydrolyse, å fremkalle en kontinuerlig nedgang i intracellulære nivåer av legemiddel [5]. Følgelig er den legemiddeltoksisitet på kreftceller gradvis svekket, og dermed miste effekt og, til slutt, genererer legemiddelresistens i cancerceller.
Sinomenine (7,8-didehydro-4-hydroksy-3,7-dimetoksy- 17-methylmorphinae-6-en) er en av flere alkaloider utvunnet fra stammen av
Sinomenium acutumRehder
Wilson (menispermaceae), som har vært brukt tradisjonelt i Kina og Japan for å behandle ulike revmatiske og leddgikt sykdommer [6]. Det er verdt å merke seg at sinomenine er i stand til å øke absorberende transport av digoksin (et prototypiske substrat av p-glykoprotein) og redusere dens sekretorisk transport [7]. Enkelte undersøkelser tyder på at sinomenine kan blokkere aktiveringen av NF-kB [8]. Den underliggende mekanismen for disse fenomenene er fortsatt uklart.
Syklooksygenase (COX), en hastighetsbegrensende enzym som katalyserer biosyntesen av prostaglandiner (PGS) fra underlaget arakidonsyre (AA) og deltar i flere fysiologiske og patologiske hendelser . For tiden er det to isoformer av COX: COX-1 og COX-2. I de fleste vev, er COX-1 uttrykt konstitutivt, mens COX-2 fremkalles av vekstfaktorer, cytokiner, og kreftfremkallende [9]. COX-2 er vanligvis detektert i mange typer av tumorcellene, inkludert spiserør, mage, tykktarm, lever, galle systemet, bukspyttkjertel, bryst, lunge og blærekreft [10]. Nylige funn har vist at COX-2 ekspresjon er positivt korrelert med P-gp-ekspresjon i tumorvevet [11]. Relevante undersøkelser har vist at COX-2-hemmere øke følsomheten av kreftceller til kjemoterapeutika ved å regulere aktiviteten av P-gp [12], [13]. Det har vist seg at celecoxib, en selektiv COX-2 inhibitor, kan nedregulere P-gp-ekspresjon i kreftceller ved å undertrykke ekspresjonen av transkripsjonsfaktorer så som NF-kB [14], [15]. Flere studier indikerte at MDR-1-genet kan inneholde DNA-bindingsseter for transkripsjonsfaktor NF-kB [16], [17].
Enkelte undersøkelser tyder på at sinomenine inhiberer modning av monocytt-avledede dendrittceller gjennom blokkerende aktivering av NF-kB [8]. I denne studien, testet vi hypotesen om at sinomenine kan øke følsomheten av kreftceller overfor antitumorlegemidler og undersøkt de mulige molekylære mekanismene for denne effekten ved direkte å vurdere effekten av COX-2 og NF-kB trasé på P-gp uttrykk.
Materialer og metoder
Regents og Antistoffer
Sinomenine, celecoxib, doxorubicin, 3- (4, 5-dimetyl tiazol-2-yl) -2, 5- difenyl tetra-tetrazoliumsaltet-bromid (MTT) og dimetylsulfoksyd (DMSO) ble anskaffet fra Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) og føtalt kalveserum (FCS) ble oppnådd fra GIBCO Liv Technology (Grand Island, NY). PGE
2 og PGE
2 estimering kit ble kjøpt fra Cayman Chemical Co., USA. Triton X-100 ble kjøpt fra Amresco, USA. P-glykoprotein (P-gp) muse-anti-humant monoklonalt antistoff, p-IkB-α (Ser 32/36) og IkB-α kanin anti-humant polyklonalt antistoff ble levert fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) . NF-kB p65 kanin anti-humant polyklonalt antistoff ble oppnådd fra Proteintech Group, USA. Monoklonale mus anti-beta-aktin og polyklonalt kanin anti-COX-2 ble oppnådd fra Biosyntese Biotechnology (Beijing, Kina). FITC-merket geite-anti-mus-IgG og FITC-merkede geite-anti-kanin-IgG ble ervervet fra Amersham Pharmacia Biotech. (Piscataway, NJ).
Cell Culture
De Caco-2 cellelinjer som benyttes i denne studien ble kjøpt fra den kinesiske Academy of Medical Sciences. Caco-2-celler ble dyrket i høy glukose Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Gibco, Bethesda, MD, USA) kulturmedium inneholdende 10% føtalt kalveserum ved 37 ° C med 5% CO
2. MDR-Caco-2-celler ble utviklet ved eksponering av Caco-2-celler til økende konsentrasjoner av doksorubicin (fra 0,1 pM til 1,6 pM i 7 dager). Deretter MDR-Caco-2 celler ble inkubert uten doksorubicin for en uke før forsøkene.
MTT kolorimetrisk analyse
Søknaden konsentrasjon av sinomenine, celekoksib, PGE
2 og evnen til sinomenine for å sensibilisere tykktarmskreftceller mot doksorubicin ble evaluert ved hjelp av MTT kolorimetrisk analyse. Caco-2-celler og MDR-Caco-2-celler i den logaritmiske fase ble oppsamlet, inkubert i en 96-brønns plate ved en konsentrasjon på 2 x 10
4 celler per brønn og dyrket i 24 timer med DMEM supplementert med 10% FCS. Etter festing av cellene til å veggen, DMEM-medium (uten FCS) inneholdende sinomenine (0, 50, 100, 300, 400, 500, 1000, 2000 uM), celecoxib (0, 5, 10, 15, 20, 25 , 30, 35 mm) og PGE
2 (0, 10
-5, 10
-4, 10
-3, 10
-2, 10
-1, 1, 10 uM) ble tilsatt til et sluttvolum på 200 pl /brønn i 48 timer. Etter behandling, ble mediet fjernet og cellene ble vasket to ganger med DMEM. Deretter 200 mL DMEM supplert med 10% FBS og 10% MTT (5 mg /ml) ble tilsatt. Etter inkubering i ytterligere 4 timer ble redusert intracellulære formazanprodukt oppløst ved å erstatte 150 ul DMEM med det samme volum av DMSO. Den optiske tetthet (OD) verdi ble påvist ved en bølgelengde på 490 nm med en mikroplateleser (Bio-rad680, CA, USA). Fire duplikater ble beregnet for hver brønn, og den midlere verdi ble beregnet tre ganger. Den hemming av cellevekst ble beregnet fra den følgende formel:. Cellevekstinhibering hastighet = (1 -OD verdi i studie gruppe /OD-verdien i kontrollgruppe) x 100%
vekstinhibering test ble gjennomført for å evaluere evnen til sinomenine og celekoksib å bevisst Caco-2 og MDR-Caco-2 celler mot doxorubicin. Etter festing av cellene til å veggen, DMEM-medium (uten FCS) inneholdende sinomenine (500 uM), celecoxib (25 uM), sinomenine (500 pM) pluss PGE
2 (1 uM) med et intervall på 2 timer . Etter inkubering i 48 timer ble mediet erstattet med DMEM (FCS-fri) inneholdende doksorubicin (1,6, 2,0, 2,4, 2,8, 3,2, 3,6, 4,0, 5,0, 6,0 pM) i 24 timer.
WST -1 celleproliferasjonsanalyse
Caco-2-celler og MDR-Caco-2-celler i den logaritmiske fase ble oppsamlet, inkubert i en 96-brønns plate ved en konsentrasjon på 2 x 10
4 celler pr brønn og dyrket i 24 timer med DMEM supplementert med 10% FCS. Etter festing av cellene til å veggen, DMEM-medium (uten FCS) inneholdende sinomenine (500 uM), celecoxib (25 uM), sinomenine (500 pM) pluss PGE
2 (1 uM) med et intervall på 2 timer . Etter inkubering i 48 timer ble mediet erstattet med DMEM (FCS-fri) inneholdende doksorubicin (1,6, 2,0, 2,4, 2,8, 3,2, 3,6, 4,0, 5,0, 6,0 pM) i 24 timer. 10 pl av reagens WST-1 ble tilsatt (Roche Applied Science, Vilvoorde, Belgia) og inkubert i 2 timer ved 37 ° C. Den optiske tetthet ble avlest ved 450 nm ved mikroplateleser Labnet (Celbio, Milano, Italia). De WST-1 dataene ble presentert som gjennomsnitt (± SD) fra tredoble eksperimenter.
PGE
2 Evaluering
MDR-Caco-2 og Caco-2 celler ved en tetthet på 5 × 10
6 ble sådd i 90 mm kultur retter. De ble inkubert med eller uten snomenine (500 uM) i 48 timer. Ved slutten av behandlingsperioden, ble kulturmediet samlet opp for å bestemme mengden av PGE
2 utskilt av disse cellene og lagret ved) -80 ° C. Kvantitativ analyse av PGE
2 utgitt i mediet ble vurdert ved hjelp av PGE
2 immunoassay kit som per produsentens instruksjoner (Cayman Chemical Company, USA).
Immunocytochemistry
Fordelingen av P-gp i cellemembranen og nukleær translokasjon av NF-kB p65 ble analysert ved hjelp av immunocytokjemi som standardprosedyrer. I korthet ble Caco-2 og MDR-Caco-2-celler ble behandlet med sinomenine (500 uM) og kontrollmedium (uten sinomenine) i 48 t og fiksert med 4% paraformaldehyd. Cellene ble inkubert med et P-glykoprotein (P-gp) muse-anti-humant monoklonalt antistoff (1:200 fortynning) eller et NF-kB-p65 kanin anti-humant polyklonalt antistoff (1:200 fortynning) i 1 time, etterfulgt av inkubasjon med FITC-merket geite-anti-mus IgG (1:200 fortynning) eller FITC-merket geite-anti-kanin-IgG (1:200 fortynning) i 1 time, respektivt. Til slutt ble cellene undersøkt under et fluorescens mikroskop (Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA).
Sanntids Relativ Kvantitativ revers transkriptase Polymerase Chain Reaction (PCR) Analyse
For å undersøke effekten av sinomenine og celekoksib på P-gp og COX-2 ekspresjon, ble sanntids relativ kvantitativ PCR utført. Celler ble sådd ut i 6-brønns plater med DMEM supplementert med 10% FCS i 24 timer. Caco-2 og MDR-Caco-2-celler ble behandlet med sinomenine (500 uM) eller celecoxib (25 uM) i 48 timer.
Total RNA ble isolert med TRIzol-reagens (Keygen Biotech Co Ltd, Nanjing , Kina), i henhold til protokollen fra produsenten. Det isolerte RNA ble kvantifisert ved hjelp av spektrofotometri (optisk denisty 260/280 nm). MRNA ble deretter revers-transkribert til cDNA, ifølge PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time kjøpt fra Takara Bio Inc. (Dalian, Kina).
Sanntids relativ kvantitativ PCR ble utført ved hjelp av Applied Biosystems 7500 raskere real-Time PCR System med SYBR Premiks Ex Taq (tli RNaseH Plus) Master Mix kjøpt fra Takara Bio Inc (Dalian, Kina) i tre eksemplarer for hver prøve og hvert gen. PCR ble utført ved anvendelse av oligonukleotidprimere som er oppført i tabell 1, som beskriver størrelsen av forventede fragmentene. PCR-betingelsene som ble benyttet var: denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder, etterfulgt av 40 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 5 s og 30 s ved 60 ° C for utglødning og 30 s ved 72 ° C for forlengelse. Resultatene ble uttrykt som forholdet mellom verdien av CT-verdien for mål-mRNA til den av β-aktin mRNA (Ct prøve /Ctβ-aktin).
Western Blot analyse
Western blot ble utført basert på standard prosedyrer. I korthet, ble høstede cellene vasket to ganger med kald PBS (pH 7,4). Atom ekstrakter ble isolert ved hjelp av Nuclear /cytosol Fraksjone Kit (Keygen Biotech Co., Ltd, Nanjing, Kina) i henhold til produsentens anbefalinger. Totalt protein ble hentet følge produsentens instruksjoner fra testsettet fra Nanjing Keygen Biotech. CO., LTD (Kina). Etter bestemmelse av proteinkonsentrasjon på prøver ved å bruke bicinchoninic syre (BCA) proteinanalyse, like mengder av proteinprøver (30 ug protein) ble separert på SDS-polyakrylamid-geler (8% for P-gp, 15% for COX-2, 12% for NF-kB p65, p-IkB-α, IkB-α og beta-aktin).
De separerte proteiner ble overført til en PVDF-membran. Etter blokkering i 5% skummet melk i Tris-bufret saltvann inneholdende 0,05% Tween-20 (TTBS), ble PVDF-membranen inkubert over natten i blokkeringsbuffer med fortynnede primære antistoffer: anti-P-glykoprotein (1:500 fortynning), anti- p-IkB-α (Ser 32/36) og anti-IkB-α (1:300 fortynning), anti-NF-kB p65 (1:400 fortynning), anti-COX-2 (1:500 fortynning) og anti -beta-aktin (1:1000 fortynning), ved 4 ° C. Deretter ble PVDF-membranen ble vasket tre ganger ved anvendelse av TTBS, etterfulgt av eksponering til det sekundære antistoff: Peroksidase-konjugert Affinipure geit-anti-kanin og anti-mus IgG (Biosyntese Biotechnology, Beijing, Kina, 1:2000 fortynning). Produkt band ble fotografert, og tettheten av hvert produkt bandet ble kvantifisert ved ChemiDoc XRS dokumentasjonssystem (Bio-Rad Laboratories). Intensiteten av hvert signal ble rettet opp ved hjelp av verdier hentet fra immundeteksjon av beta-aktin.
Statistiske analyser
Data er presentert som gjennomsnitt ± SE. En foreløpig analyse var. gjennomført for å avgjøre om de datasett tilstås med et vanlig. distribusjon, og en beregning av homogenitet av variansen ble utført ved anvendelse av Bartlett «s test. Midlene mellom ulike prøver ble sammenlignet ved ANOVA, og multiple sammenligninger mellom gruppene ble utført ved bruk av den minst signifikante forskjell (LSD) -metoden. Dersom F verdiene var signifikant (P 0,05), ble Dunnetts metode som anvendes for å vurdere individuelle forskjeller mellom midler og P 0,05 ble betraktet som signifikant. Alle data ble statistisk analysert ved hjelp av SPSS 11.5 programvare for Windows.
Resultater
Effekt av Sinomenine, Celecoxib og PGE
2 on Caco-2 Livskraftig
eksperimenter utført ved inkubasjon av Caco-2-celler i opptil 48 timer med økende konsentrasjoner sinomenine, viste at denne forbindelsen ikke påvirker Caco-2 cellelevedyktighet ved konsentrasjoner på 500 uM eller mindre (fig. 1A). En konsentrasjon på 500 mikrometer ble valgt som programmet konsentrasjon.
De cytotoksiske effektene av angitte forbindelser på Caco-2 celler ble bestemt ved MTT-analyse. Tre uavhengige eksperimenter ble utført. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SE. Bærer-behandlede celler ble anvendt som en normaliseringskontroll. * P 0,5, ** P. 0,05
Dose-respons og tidskurs studier viste at celecoxib, ikke en COX-2 spesifikk hemmer ikke påvirke Caco-2 celleproliferasjon i doser fra 0 til 25 uM (fig. 1B). Tidligere studier viser at celecoxib regulerer MDR1 ekspresjon ved inhibering av COX-2-enzymaktivitet i en konsentrasjon på 25 uM. Så ble en dose på 25 mikrometer valgt for våre eksperimenter [18].
For å vurdere om PGE
2 kan påvirke effekten av sinomenine, ble Caco-2 celler inkubert med eller uten økende konsentrasjoner (0 til 10 uM) av PGE
2, en COX-2-sluttprodukt, demonstrerte at denne forbindelse ikke påvirker Caco-2 cellelevedyktighet ved hvilken som helst konsentrasjon testet (fig. 1C). Studier har vist at PGE
2 regulerer MDR1 uttrykk ved en konsentrasjon på 1 uM [12], [18], [19], og det er underforstått at Akt er blokkert i mekanismen. Derfor valgte vi dosen av en mikrometer i våre forsøk.
Sinomenine og Celecoxib Enhanced Doxorubicin-indusert Ctotoxicity både i Caco-2 og MDR-Caco-2 celler
For å vurdere om sinomenine og celecoxib kan sensibilisere Caco-2 og MDR-Caco-2-celler for de cytotoksiske effekter av doxorubicin, Caco-2 og MDR-Caco-2-celler ble behandlet med doksorubicin (10
-5 til 10 uM) i fravær eller nærvær av sinomenine (500 uM), celecoxib (25 uM), eller sinomenine (500 pM) pluss PGE
2 (1 uM) i 48 timer. Celleformering ble bestemt ved MTT-analysen (fig. 2 A og B) og WST-1-analysen (fig. 2 C og D). Doxorubicin redusert cellelevedyktighet på doseavhengig både i Caco-2 og MDR-Caco-2-celler med et IC
50 verdi på ca. 2,41 ± 0,15 uM og 4,67 ± 0,12 uM (fig. 2 A), henholdsvis. I MTT analyse, cotreatment av Caco-2 celler med sinomenine, eller celecoxib, sensitiv Caco-2 celler til cytotoksiske effektene av doxorubicin med en reduksjon i IC
50 verdier fra 2,41 ± 0,15 mikrometer til 1,91 ± 0,16 mikrometer og 1,85 ± 0,2 uM (fig. 2 A), henholdsvis. Ikke desto mindre, cotreatment med sinomenine pluss PGE
2 hadde ingen effekt på følsomheten av Caco-2-celler mot doksorubicin.
Caco-2 og MDR-Caco-2-celler ble behandlet i 48 timer med doksorubicin (10
-5 til 10 uM) alene eller i kombinasjon med sinomenine (500 uM), celecoxib (25 uM), eller sinomenine (500 pM) pluss PGE
2 (1 uM). Cellelevedyktigheten ble deretter bestemt ved MTT-analyse. Ct gruppe (A og C) refererer til doxorubicin-behandlede Caco-2-gruppe og ct gruppe (B og D) viser til doxorubicin-behandlede MDR-Caco-2-gruppe. Data er presentert som gjennomsnitt ± SE. (N = 3) av et representativt eksperiment utført in triplo. ** P 0,01, * P 0,05, sammenlignet med doksorubicin-behandlet Caco-2-gruppen. ## P 0,01, # P. 0,05, sammenlignet med doksorubicin behandlet MDR-Caco-2 gruppen
Sinomenine og celekoksib også forbedret den cytotoksiske virkningen av doxorubicin i MDR-Caco-2 celler, som redusert IC henholdsvis
50 verdi fra 4.67 ± 0.12 uM til 2,45 μ ± 0,14 uM og 2,56 uM ± 0,11 uM (fig. 2 B),. Overraskende, cotreatment med sinomenine pluss PGE
2 hadde en negativ effekt på følsomheten MDR-Caco-2 celler mot doxorubicin med økt IC
50 verdi fra 4,67 ± 0,12 mikrometer til 5,35 μ ± 0,13 mikrometer.
i WST-1-analysen, IC
50 verdien av Caco-2 celler ble redusert fra 2,33 ± 0,14 mikrometer til 1,85 ± 0,13 mikrometer og 1,88 ± 0,21 um (fig. 2 C). Men cotreatment med sinomenine pluss PGE
2 svekket følsomheten av Caco-2-celler mot doksorubicin med en reduksjon i IC
50-verdier fra 2,33 ± 0,14 uM til 2,55 ± 0,17 uM (fig. 2 C). Sinomenine og celekoksib også forbedret den cytotoksiske virkningen av doxorubicin i MDR-Caco-2 celler, som sank IC
50 verdi fra 4,55 ± 0,19 mikrometer til 2,55 μ ± 0,25 mikrometer og 2,52 mikrometer ± 0,18 mikrometer (Fig. 2 D) hhv. Utrolig, cotreatment med sinomenine pluss PGE
2 hadde en negativ effekt på følsomheten MDR-Caco-2 celler mot doxorubicin med økt IC
50 verdi fra 4,55 ± 0,19 mikrometer til 5,15 um ± 0,14 mikrometer (Fig. 2 D).
Sinomenine Redusert PGE
2 Slipp
for å se nærmere på involvering av COX-2, PGE
2, en COX-2 sluttprodukt, løslatt fra Caco-2 og MDR-Caco-2-celler ble bestemt ved hjelp av ELISA-metoden. Resultatene viser klart en betydelig økning i PGE
to nivåer i MDR-Caco-2-celler i forhold til Caco-2-celler og en betydelig reduksjon i nivåene av PGE2 i MDR-Caco-2-celler som ble behandlet med sinomenine (fig. 3).
MDR-Caco-2 og Caco-2-celler ble dyrket i 48 timer i nærvær eller fravær av 500 pM sinomenine, som vist, og høstet. Supernatantene ble deretter samlet for PGE
2 måling. Data er presentert som gjennomsnitt ± SE. (N = 3) av et representativt eksperiment utført in triplo. Sammenlignet med Caco-2 celler, PGE
2 nivåer i MDR-Caco-2 celler betydelig økt (P 0,01), som i betydelig grad redusert i MDR-Caco-2 celler behandlet med sinomenine (P 0,01).
Sinomenine og Celecoxib downregulated uttrykk for P-gp /MDR1 i MDR-Caco-2 celler
for å forstå mekanismen av resistens utvikles i MDR-Caco-2 celler, og mekanismen involvert i sinomenine og Celecoxib sensibiliserende MDR-Caco-2 celler mot doxorubicin, immunfluorescens cytochemistry, kvantitativ real-time PCR, og western blotting ble utført. Resultatene viste overekspresjon av MDR1 mRNA og protein betydelig redusert i nærvær av sinomenine og celecoxib (fig. 4).
multiresistente Caco-2 (MDR-Caco-2-celler) ble utviklet ved eksponering av Caco -2 celler til økende konsentrasjoner av doksorubicin (fra 0,1 pM til 1,6 pM i 7 dager). MDR-Caco-2-celler ble inkubert uten doksorubicin i en uke før forsøkene. Deretter MDR-Caco-2-celler ble behandlet med eller uten sinomenine (500 uM) og celecoxib (25 uM) i 48 timer. (A) immunocytochemistry rettet mot P-gp (grønn). (B) Western blot-analyse av sinomenine og celekoksib mediert effekt på P-gp-ekspresjon i Caco-2 celler og MDR-Caco-2-celler. Antistoff mot beta-aktin ble benyttet for å sikre lik belastning av protein i hver bane. (C) De relative bandet tetthetsverdiene i P-gp uttrykk baner er beskrevet i baren chat. (D) Real-time PCR-analyse av MDR1 uttrykk i Caco-2 celler og MDR-Caco-2 celler behandlet med eller uten sinomenine. Beta-aktin ble benyttet som intern referanse for påvisning av MDR1 uttrykk. Alle de ovenfor angitte resultater er uttrykt som gjennomsnitt ± SE (n = 3) av tre uavhengige eksperimenter. *, P 0,05 og **, P 0,01 sammenlignet med MDR-Caco-2 gruppen
Sinomenine nedregulert ekspresjon av COX-2 i MDR-Caco-2 celler
for å forstå rollen til COX-2 i utvikling av resistens, og effekten av sinomenine på COX-2 ekspresjon, Caco-2 og MDR-Caco-2-celler ble behandlet med eller uten sinomenine og celecoxib, en COX-2- spesifikk hemmer, ved kvantitativ real-time PCR og Western blotting. Resultatene viste at COX-2 er overuttrykt i MDR-Caco-2-celler og sinomenine trykkes COX-2 ekspresjon (fig. 5). Bortsett fra det, har celekoksib ingen effekt på uttrykket. Vi kan konkludere med at celecoxib, som en COX-2 spesifikk inhibitor, inhiberer funksjonen av COX-2 i stedet for regulering av dets ekspresjon.
MDR-Caco-2-celler ble inkubert uten doksorubicin i en uke før forsøkene. Deretter MDR-Caco-2-celler ble behandlet med eller uten sinomenine (500 uM) og celecoxib (25 uM) i 48 timer. (A) Western blot-analyse av sinomenine og celekoksib mediert virkning på COX-2 ekspresjon i Caco-2 celler og MDR-Caco-2-celler. Antistoff mot beta-aktin ble benyttet for å sikre lik belastning av protein i hver bane. (B) De relative bandet tetthetsverdiene i COX-2 uttrykk baner er beskrevet i baren chat. (C) Real-time PCR-analyse av COX-2 ekspresjon i Caco-2 celler og MDR-Caco-2-celler som ble behandlet med eller uten sinomenine og celekoksib. Beta-aktin ble benyttet som intern referanse for påvisning av COX-2 ekspresjon. Alle de ovenfor angitte resultater er uttrykt som gjennomsnitt ± SE (n = 3) av tre uavhengige eksperimenter. *, P 0,05 og **, P . 0,01 sammenlignet med MDR-Caco-2 gruppen
Sinomenine og Celecoxib Redusert NF-kB aktivering
P-gp uttrykk har vært klart korrelert til NF-κ B-aktivering [17], [20], [21], som blir mediert av fosforylering av IicB-α. Deretter aktiveres NF-kB p65 subenheten translocates til kjernen og binder seg til DNA-området, som til slutt aktiverer transkripsjon av MDR-1 [22]. For å forstå mekanismen ved hvilken sinomenine og celekoksib øke følsomheten av MDR-Caco-2-celler mot doxorubicin, immunfluorescens cytochemistry, kvantitativ real-time PCR, og western-blotting ble utført for å påvise p65 subenheten i atom og cytoplasmisk p-IkB-α og IkB-α. Resultatene viste at NF-kB veien ble aktivert i MDR-Caco-2-celler, mens sinomenine og celekoksib trykkes aktivering av NF-kB bane i MDR-Caco-2-celler (Fig. 6).
deretter MDR-Caco-2-celler ble behandlet med eller uten sinomenine (500 uM) og celecoxib (25 uM) i 48 timer. (A) immunocytochemistry målretting P65 (grønn). (B) Western blot-analyse av sinomenine og celekoksib mediert effekt på nukleær translokasjon av P65 i Caco-2 celler og MDR-Caco-2-celler. Antistoff mot beta-aktin ble benyttet for å sikre lik belastning av protein i hver bane. (C) De relative bandet tetthetsverdier i atom uttrykk P65 baner er beskrevet i baren chat. (D) De relative båndtetthetsverdier i den cytoplasmiske p-IkB-a baner er beskrevet i bar chat. Alle de ovenfor angitte resultater er uttrykt som gjennomsnitt ± SE (n = 3) av tre uavhengige eksperimenter. *, P 0,05 og **, P . 0,01 sammenlignet med MDR-Caco-2 gruppen
Diskusjoner
Kjemoterapi fungerer som en av de viktige behandlinger for tykktarmskreft. Langsiktig kjemoterapi fører uunngåelig til legemiddelresistens og dette har blitt en stor utfordring for triumf av kjemoterapi. Fremveksten av resistens kan korrelere med en økning i efflukspumpen aktivitet, en reduksjon i absorpsjonen, aktivering av avgiftning enzymer, endringer i narkotika mål og en reduksjon i celle apoptose [23]. Tidligere studier på efflukspumpen har vist at P-gp, kodet for av MDR-1-genet, spiller en viktig rolle, da den pumper legemiddelsubstansen utsiden for å redusere cytotoksisitet presenteres av cancerceller og øker motstanden av carcinoma til kjemoterapeutika. Imidlertid kan den medikamentresistens presenteres av cancerceller bli effektivt reverseres ved å undertrykke P-gp ekspresjon og funksjon [24], [25], [26].
Sinomenine, en bioaktiv alkaloid avledet fra
Sinomenium acutum
, brukes til å behandle revmatiske og leddgikt sykdommer i Kina. Sinomenine har en rekke funksjoner, inkludert anti-inflammasjon og immunosuppresjon [27], [28]. Tidligere studier har indikert at sinomenine redusert utstrømningen av prototypiske p-gp-substrater, såsom digoksin og paeoniflorin [6], [7], og sinomenine seg selv kan være et substrat for P-gp [29]. Så reguleringsmetoder sinomenine til P-gp forble ukjent. Våre resultater viste at sinomenine downregulated P-gp-ekspresjon i MDR-Caco-2-celler (fig. 4) og forbedret følsomhet av MDR-Caco-2-celler mot doxorubicin (fig. 2). Noen studier har indikert at sinomenine hemmet ekspresjon av COX-2 [30], [31]. I samsvar med disse resultatene, våre funn manifestert som sinomenine downregulated COX-2 ekspresjon i MDR-Caco-2-celler (fig. 4) og reduserte PGE
2, en ende produksjon av COX-2, frigjort fra MDR-Caco- 2-celler (fig. 3).
COX-2, en av de hastighetsbegrensende enzym i metabolismen av arakidonsyre til prostaglandiner, er overuttrykt i et stort antall humane primære og metastatiske svulster [32]. Enten COX-2 er involvert i utviklingen av resistens preget av P-gp overekspresjon er kontroversielt. Mange studier viste at COX-2 ekspresjon er korrelert med P-gp uttrykk [33], [34]. Det er rapportert at adenovirus transfeksjon av COX-2-gen oppregulerer MDR-1-genekspresjon i rotte glomerulus-celler og opprettholdt toksisitet av adriamycin mot nyreceller. I nærvær av COX-2 inhibitor NS-398, ble MDR-1-genet ekspresjonsnivåer betydelig redusert og cytotoksisiteten av adriamycin ble forbedret [35]. I tråd med disse funnene, fant vi at uttrykket av både COX-2 og P-gp er betydelig forbedret i MDR-Caco-2 celler. Celecoxib, COX-2-spesifikk hemmer, downregulated P-gp uttrykk i MDR-Caco-2 celler og sensitivisert MDR-Caco-2 celler mot doxorubicin. Som nevnt ovenfor, sinomenine hemmet ekspresjon av COX-2 og P-gp. I tillegg, når MDR-Caco-2-celler ble behandlet med sinomenine pluss PGE
2, sinomenine mislyktes i å øke toksisiteten av doxorubicin mot MDR-Caco-2-celler (Fig. 2).
Tidligere studier viste at MDR-1-genet inneholder bindingsseter for NF-kB, som kan korrelerer med MDR-1-genekspresjon [16], [17].
NF-kB vanligvis foreligger som en heterodimer av P50 og P65 polypeptider , bundet i cytoplasma av inhibitor-proteinet IicB [36], [37]. Etter cellulær stimulering av en rekke cytokiner eller patogener blir IkB fosforylert av IKB-kinase (IKK) kompleks ved seriner 32 og 36, så brytes ned ved 26S-proteosom. Deretter NF-kB translocates til kjernen, hvor det binder til regulatoriske elementer i promoterregionen av målgener. Det er dokumentert at NF-kB var nedstrøms av COX-2 [38], likevel studier har indikert at den nedregulering av COX-2 ekspresjon kunne inhibere NF-kB [39], [40]. I denne studien fant vi at sinomenine og celekoksib trykt aktivering av NF-kB veien i MDR-Caco-2 celler (Fig. 6).
I konklusjonen, har vi utviklet en multiresistent Caco-2 (MDR-Caco-2) cellelinje ved eksponering av Caco-2-celler til økende konsentrasjoner av doxorubicin, som overuttrykt både P-gp og COX-2. Sinomenine downregulated ekspresjonen av MDR1 mRNA og protein via NF-kB vei, og inhiberte ekspresjon av COX-2, som ble korrelert med P-gp uttrykk. Våre funn, derfor, forutsatt ny innsikt i reguleringen av P-gp-ekspresjon i multiresistente celler og foreslått nye potensielle strategier for reversering av P-gp-mediert anticancer-medikament-resistens. Imidlertid kan andre signalmolekyler også deltar i reguleringen av aktiviteten av MDR-Caco-2-celler og dermed bidra til utvikling multimedikamentresistent. Videre studier er nødvendig for å undersøke hvordan COX-2, NF-kB og andre signaliseringsmolekyler interagere i utviklingen av P-gp-mediert multimedikamentresistente kreftceller.
