Abstract
Nyere bevis tyder på at CXCR2 signalering er avgjørende for kreft progresjon, og dens antagonist SB225002 induserer apoptose i Wilms tumorceller. Her undersøkte vi effekten av SB225002 på cellesyklusprogresjon og apoptose-induksjon
in vitro
, ved hjelp av CDDP-sensitive og -resistente OVCA cellelinjer med forskjellig p53 status (villtype, mutant eller null). Adenovirus infeksjon av villtype p53 eller transfeksjon av p53 siRNA ble brukt til å over-express eller knock-down p53. Cellesyklus og apoptose ble bestemt ved flowcytometri eller Hoechst flekker og observasjon av kjernefysisk morfologi. Våre data viser at SB225002 indusert apoptose i både villtype og p53-mangel eggstokkreft (OVCA) celler gjennom alternative mekanismer. SB225002 fremmet mitotisk katastrofe, noe som gjenspeiles av opphopning av mitotiske celler med spindel abnormiteter, kromosom mis-segregering, multi-polar celledeling, flere kjerner, Aneuploidy /polyploidi og påfølgende omfattende apoptose. SB225002-indusert mitotisk katastrofe ut til å være formidlet av nedregulering av sjekkpunktet kinase Chk1 og Cdk1-cyclin B aktivering. I celler som uttrykker villtype p53 (OV2008 og C13 *), økt SB225002 totalt og fosfo-Ser p53-nivåer, og p53 knock-down redusert SB225002-indusert apoptose, uten å påvirke mitose for tidlig. Disse resultatene tyder på at SB225002 induserer p53-avhengig apoptose, og provoserer mitotisk katastrofe i p53-uavhengig måte i p53 villtype-celler. Tilberedning med vill-type P53 i P53-null SKOV3 celle dempes SB225002-indusert mitotisk katastrofe, noe som tyder på p53 forhindret mitotisk katastrofe indusert av SB225002 i p53-mangel OVCA celler. Til slutt, er effekten av SB225002 kan ikke forebygges ved forbehandling med CXCR2 ligand eller dens nøytraliserende antistoff. De foreliggende studier viser for første gang at SB225002 har to handlinger i OVCA celler, induserer apoptose klassiske gjennom p53-aktivering og vekk mitotisk katastrofe i både p53 villtype og manglende celler ved Chk1 inhibering og Cdk aktivering. Disse funnene øke muligheten for SB225002 som en ny kandidat molekyl for OVCA behandling uavhengig av p53 status
Citation. Du M, Qiu Q, Gruslin A, Gordon J, Han M, Chan CC, et al. (2013) SB225002 Fremmer Mitotisk Catastrophe i Chemo-Sensitive og motstandsdyktig eggstokkreft celler Uavhengig av p53 status
In Vitro
. PLoS ONE 8 (1): e54572. doi: 10,1371 /journal.pone.0054572
Redaktør: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, USA
mottatt: 15 oktober 2012; Akseptert: 12. desember 2012; Publisert: 24 januar 2013
Copyright: © 2013 Du et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Major International Joint Research Project av National Natural Science Foundation of China (30910103909 til DJ Li), National og Shanghai Ledende akademisk disiplin Project (211XK22 til DJL), Program for fremragende medisinsk faglig leder av Shanghai (til DJL) og Nasjonal Foundation Natural Science of China (81070537 til MRD), National Natural Science Foundation of China (31171437 til MRD), og Shanghai Pujiang talent Program (10PJ1401600 til MRD), og tilskudd fra den kanadiske Institutes of Health Research (MOP-15691 til BKT) og World Class University (WCU) program gjennom departementet for utdanning, vitenskap og teknologi i Korea og finansiert av National Research Foundation of Korea (R31-10056 til BKT). . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser: Selv om to av forfatterne (Miao han og Chi Chung Chan) er ansatt i selskapet Wuxi AppTech Co., Ltd., betyr ikke dette endre forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Selskapet har ingen erklæringer knyttet til sysselsetting, rådgivning, patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter som de forholder seg til dette prosjektet /manuskriptet. Andre forfattere av dette manuskriptet (Meirong Du, Qing Qiu, Andree Gruslin, John Gordon, Dajin Li og Benjamin K. Tsang) har ingen økonomiske eller andre interesser i selskapet og har bekreftet sin erklæring om at de ikke har noen konkurrerende interesser som definert av PLoS ONE.
Innledning
Eggstokkreft (OVCA) er den mest fatale gynekologisk kreft som har frustrert både klinikere og forskere i flere tiår. Det er den femte største årsaken til kreft dødsfall blant kvinner, med anslagsvis 21,990 nydiagnostiserte tilfeller og 15,460 dødsfall i USA i 2011 (https://seer.cancer.gov/statfacts/html/ovary.html). Selv om kjemoterapi og cytoreduserende kirurgi er nå standard regler for OVCA behandling, forblir chemo-motstand en viktig årsak til kjemoterapeutisk svikt. Forskjellige mekanismer er blitt implisert for chemoresistance, inkludert endret medikamenttransport, forbedret DNA-reparasjon og økt toleranse for DNA-skade [1], [2], [3]. I tillegg pattedyrceller utviser komplekse cellulære responser til genotoksiske spenning, inkludert cellesyklus kontrollpunkt, DNA-reparasjon og apoptose, og genaktivering er et viktig første trinn i løpet av den cellulære respons på DNA-skade. Selv om adjuvant kjemoterapi med cisplatin paclitaxel og oppnår klinisk respons i en høy prosentdel av tilfellene, systemisk toksisitet sterkt begrenser behandlingsmulighet [4]. Dermed blir mer effektive og trygge terapeutiske strategier presserende behov for å bekjempe denne sykdommen.
Apoptose er preget morfologisk av cytoplasma svinn, kromatin kondens og kjernekraft fragmentering med chromatinolysis [5], og biokjemisk ved caspaseaktivering og permeabilization av ytre mitokondriemembranen [6], [7], [8]. Mitotisk katastrofe er et spesialtilfelle av apoptose, og forekommer i løpet av mitose med en kombinasjon av mangelfulle celle-sykluskontrollen og cellulær skade [9]. DNA-skade aktiverer kontrollpunkter for å utsette cellesyklusprogresjon. P53 regulerer G1 /S-overgangen (G1-sjekkpunkt), mens CHK1 hindrer oppføring av DNA-skadede celler i M-fase (G2-sjekkpunktet). I tilfelle av chemoresistance, DNA-skade indusert av kjemoterapeutiske midler unnlater å arrestere kreftceller i G1 fase og for å fremme apoptose på grunn av hovedsaklig til mangelfull p53-signalering. Imidlertid kan DNA-skader aktivere CHK1 vei, indusere S- og G2-sjekkpunkter arrest [10], [11] og legge til rette for DNA-reparasjon før innreise til mitose (M fase). Det kan derfor tenkes at midler som kan indusere konvensjonell apoptose (gjennom DNA-skade og P53 aktivering), og fremme mitotisk katastrofe (via CHK1 inaktivering og oppheving av G /M arrest) kan tilby potensielt nye terapeutiske fordeler.
Kjemokiner , en superfamilie av små cytokin-lignende proteiner, er kjent for sin sentral rolle som regulatorer i cellulær migrasjon, intercellulær kommunikasjon og tumorprogresjon ved å tilby en passende tumor mikromiljø [12], [13], [14]. CXCR2, en funksjonell reseptor for ELR
+ kjemokiner, uttrykkes hovedsakelig i endotelceller og er en potent promoter av angiogenese i faste cancere. Mye tyder på at mobilnettet transformasjon av onkogene ras induserer høy uttrykk for alle CXCR2 ligander, og bidrar til flere kreftutvikling. I OVCA, ELR
+ kjemokiner, så som IL-8, GRO-1 og ENA-78, er signifikant oppregulert [15], [16], [17], [18]. Det høye nivået av GRO-1 induserer senescence av fibroblaster og fremmer ondartet transformasjon av ovarie epitelceller og OVCA cellevekst [19] SB225002 [N- (2-hydroksy-4-nitrofenyl) -N»- (2-bromfenyl) urea ] er antatt å være et potent selektiv ikke-peptid-antagonist CXCR2 ved å inhibere bindingen av både IL-8 og GRO-1 til CXCR2 [20]. Selv om SB225002 først ble utviklet for behandling av inflammatoriske sykdommer [20], [21], nylige studier antyder at retrovirusinfeksjoner, Wilms tumor og Alzheimers sykdom kan være potensielle terapeutiske indikasjoner for CXCR2-antagonist [22], [23], [24 ]. SB225002 har blitt rapportert å indusere apoptose i Wilms tumorceller, selv om den underliggende mekanisme er uklar [23].
I den foreliggende studien undersøkte vi effekten av SB225002 på cellesyklusprogresjon og apoptose-induksjon
in vitro
, ved hjelp av CDDP-sensitive og -resistente OVCA cellelinjer med ulik p53 status (villtype, mutant eller null). Vi fant ut at SB225002, uavhengig av CXCR2, indusert klassisk apoptose gjennom aktivering P53 og provosert mitotisk katastrofe både P53 villtype og manglende celler via sjekkpunkt kinase 1 (Chk1) hemming og Cdk aktivering. I tillegg til sin hemmende virkning av tumor angiogenese gjennom CXCR2-mediert cellesignalisering (Matsuo
et al
., 2009), vår studie viser at SB225002 kan være en potensiell terapeutiske midler for kjemoresistent OVCA gjennom sin virkning på cellesyklus progresjon og apoptose uavhengig av reseptor-mediert signalering.
Materialer og metoder
Reagenser
Cis-diaminedichloroplatinum (CDDP) og Hoechst 33258 ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO, USA). SB265610 ble kjøpt fra Tocris Biovitenskap (USA). SB225002 ble kjøpt fra Calbiochem (San Diego, California, USA), liten hemmende RNA (siRNA) til p53 var fra Cell Signaling Technology (Beverly, CA). Kontroll siRNA var fra Dharmacon inc. (Lafayette, CO, USA). Ribojuice siRNA transfeksjon reagens var fra Novagen Inc. (San Diego, California, USA). Primære antistoffer for Western blot var kanin polyklonale anti-PARP, anti-fosfor-chk1 (S345) og fosfor-p53 (S15, Cell Signaling Technology), mus monoklonalt anti-chk1, anti-caspase 3, anti-fosfor-Histone H3 ( Serine 10), og anti-p21
WAF1 /CIP1 (Cell Signaling Technology), anti-p53 (DO-en, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-IL-8 og GRO-en (R D system, Minneapolis, MN) og anti-GAPDH (ab8245, Abcam, Cambridge, UK). Pepperrotperoxydase-konjugert sekundært antistoff var fra Bio-Rad (Hercules, CA, USA). Primære antistoffer for immunocytochemistry var kanin polyklonale Alexa Fluor® 488-konjugert anti-fosfor-Histone H3 (Ser 10; Cell Signaling Technology,) og FITC-konjugert anti-β-tubulin (Clone TUB 2.1, Sigma). Det monoklonale anti-humant CXCR2-PE, human rekombinant IL8 og GRO1 var fra R Ambion). Real-time kvantitativ PCR ble utført med følgende primere: GRO-1: F: TGCAGCTGTGTCTCTCTTTCCTCT og R: AAAGCTTGCCTCAATCCTGCATCC; IL-8: F: AGCCTTCCTGATTTCTGCAGCTCT og R: AATTTCTGTGTTGGCGCAGTGTGG; CXCR2: F: AGAAGTTTCGCCATGGACTCCTCA og R: AGTGGAAGTGTGCCCTGAAGAAGA; F: GGGGAGCCAAAAGGGTCATCATCT og R: GAGGGGCCATCCACAGTCTTCT for GAPDH. Amplification reaksjonen ble utført ved hjelp av QuantiTect SYBR Grønn PCR kit. De termiske sykkel betingelser omfattet et innledende denatureringstrinn (95 °, 15 min) og etterfulgt av PCR (95 ° C i 15 minutter, 50 sykluser ved 95 ° C i 15 sek, 56 ° C i 20 sekunder og 72 ° C i 30 sekunder). PCR produktene ble deretter smeltet ved 60 ° C i 30 sek og mRNA-overflod av IL-8, GRO-1 og CXCR2 ble uttrykt som et forhold til GAPDH-verdier. Hver verdi ble sammenlignet med den OV2008.
Adenovirus Infeksjon, RNA interferens og SB225002 Behandling
SKOV3 celler ble infisert med adenovirus villtype p53 eller LacZ kontroll (MOI = 10) [25] . Tjuefire timer etter infeksjon, ble cellene behandlet med SB225002 (750 nM, 24 timer eller 48 timer). OV2008 og C13 *-celler ble transfektert med p53 siRNA (100 nmol /l; 36 h). Krafse eller sekvens (kontroll) [26], og deretter behandlet med SB225002
Western analyse
Western blotting ble utført som tidligere beskrevet [25], [26]. Membraner ble inkubert over natten ved 4 ° C i primære antistoffer (anti-p53 1: 10.000, anti-fosfo-p53 (S15) 1:1,000, anti-chk1 1: 1000, anti-fosfo-chk1 (S345) 1:1,000; anti-fosfor-chk1 (S317) 1:1,000, anti-caspase 3 1: 1000, anti-PARP, 1:1,000, anti-fosfor-Histone 3 (S10, 1:1,000), anti-GAPDH, 1:20,000) , etterfulgt av inkubasjon (romtemperatur, 1 time) med pepperrot-peroksidase-konjugert anti-kanin eller anti-mus sekundært antistoff (1:5,000). Peroksidase-aktivitet ble visualisert med ECL (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Resultatene ble skannet og analysert ved hjelp av Scion Bilde programvare (Scion, Inc., Frederick, MD).
propidiumjodidfarging og flowcytometri
Floa og tilhenger celle ble samlet og fiksert i 70% etanol over natten. De ble behandlet med RNase A og inkubert med propidiumjodid (50 ug /ml; PI) og ble analysert på en Beckman Coulter FC500. For identifisering av mitotiske celler, ble celler inkubert (2 h, RT) med anti-fosfo-histon H3 (Alexa 488, 1:10, Cell Signaling) og vasket med PBS før PI farging. For å detektere ekspresjonen av CXCR2 uttrykk på OVCAs, ble cellene høstet og vasket i PBS, deretter en gang farget ved en standard immunofluorescens-analyse med fykoerytrin (PE) -konjugert anti-humant CXCR2 mAb og PE-konjugert anti-humant isotype antistoff (BD Pharmingen). Den prosent av CXCR2-positive celler ble bestemt ved flow-cytometri.
Immunofluorescence
Celler ble fiksert og permeabilisert, deretter blokkert med 2% BSA, etterfulgt av inkubasjon (over natten, 4 ° C) med FITC-konjugert mus anti-beta-tubulin (1:50) eller FITC-konjugert isotype IgG (negativ kontroll). Etter vasking ble Hoechst nukleær flekk (33258) tilsatt til cellene, som var montert med Vectashied (Vector, Burlingame, CA, USA). Florescence bildene ble tatt ved hjelp av en Leitz DMRX mikroskop og analysert med Adobe Photoshop 7,01 (Adobe, Ottawa, Canada).
kromosom Spre analysen
Kromosom oppslag ble utarbeidet ved hjelp av standardprotokollen [32] ; DNA ble farget med 0,1% SYTOX grønn, og bilder ble oppnådd med et Leitz DMRX mikroskop.
Vurdering av apoptose
Vedlagte og flytende celler ble resuspendert i nøytral buffret formalin (4%) inneholdende Hoechst 33258 fargestoff (3,75 ng /ml, 24 timer). Prosentandelen av apoptose ble bestemt ved kjerne morfologi. Minst 400 celler ble telt i hver gruppe med disken «blindet» for å prøve identitet for å unngå eksperimentell skjevhet [25], [26].
Statistical Analysis
Alle resultater presenteres som gjennomsnitt ± SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter. Data ble analysert ved toveis ANOVA og Bonferroni posttest ble brukt til å bestemme statistisk forskjell mellom forsøksgruppene (PRISM programvare versjon 5.0, GraphPad, San Diego, California). Statistisk signifikans ble utledes på P . 0,05
Resultater
Uttrykk for CXCR2 og dens ligander IL-8 og GRO-1 i CDDP-sensitive og -resistente OVCA Cells
vi først undersøkt mRNA og proteininnhold av CXCR2 og dets ligander IL-8 og GRO-1 i to par av CDDP-sensitive og -resistente OVCA cellelinjer. Strømningscytometri viste at CXCR2 var positiv på 9,08%, 5,87%, 6,66% og 7,63% av OV2008, C13 *, A2780s og A2780cp celler, respektivt, og viste ingen signifikant forskjell mellom de cellelinjer. Likeledes var det ingen signifikant forskjell i CXCR2 mRNA-overflod (Fig. 1A). I motsetning til dette ble den IL-8 hovedsakelig uttrykt i OV2008 og C13 * cellelinjer, mens GRO-1 var overveiende i A2780s og A2780cp celler både på mRNA og proteinnivå. IL-8 sekresjon var fem ganger høyere i C13 * enn i OV2008, mens GRO-en sekresjon ble fem ganger høyere i A2780s enn i A2780cp celler (figur 1B, 1C.)
A:. CXCR2 mRNA og protein ekspresjon i kjemosensitiv OVCA celler (OV2008 C: mRNA-overflod og protein sekresjon av IL-8 (B) og GRO-1 (C) [Western blot (øverst) og qPCR (lavere)]. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av tre eksperimenter. Representative bilder av FCM og Western blot er vist.
SB225002 apoptose og Mitosis i begge CDDP-sensitive og -resistente OVCA Cells
For å finne ut om CXCR2 antagonist SB225002 ville føre til celle død i cisplatin-sensitive og -resistente OVCA celler, vurderes vi apoptose morfologisk i OV2008 /C13 * (både p53-villtype) og A2780s /A2780cp (p53-villtype og p53 mutant henholdsvis) celler følgende SB225002 eller CDDP behandling for 24 h. Som forventet, CDDP indusert apoptose (tydelig ved cytoplasmisk krymping, kromatin kondensasjon og atom fragmentering) i chemo-følsomme celler (OV2008 og A2780s), men ikke i de resistente celler (C13 * og A2780cp). I motsetning til dette, SB225002 indusert apoptose i alle cellelinjene i en konsentrasjonsavhengig måte (fig. 2A), en observasjon som støttes av kaspase 3 aktiveringen og PARP-spaltning (Fig. 2B). Interessant, «blomsteraktig» celler med større og kondens kromosomer var tydelig når det utsettes for SB225002 (≥500 nM, Fig. 2C)., Som er forbundet med øket celle-akkumulering i G2 /M og sub-G1 faser (fig 2D – øverste). Mesteparten av den økte G2 /M fase populasjonen var fosfo-histon H3-positive celler (Fig. 2D-lav), noe som tyder på at SB225002 øker antallet av mitotiske celler, muligens enten ved å fremme for tidlig mitose innførsel eller forsinke mitose utgang.
A: CDDP (0-10 mikrometer, 24 h) indusert apoptose i chemo-sensitive OV2008 og A2780s men ikke deres resistente kolleger C13 * og A2780cp, mens SB225002 (0-1000 nM, 24 h) indusert apoptose i alle celle linjer. De OVCAs ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av SB225002 eller av CDDP i 24 timer. Vedlagte (levedyktighet) og flyte (apoptotiske) celler ble samlet, vasket og resuspendert i nøytral buffret formalin (4%) inneholdende Hoechst 33258 fargestoff (3,75 ng /ml, 24 timer). Prosentandelen av apoptose ble fastsatt basert på kjernefysisk morfologi. Minst 400 celler ble tellet i hver gruppe, og telleren «blindet» for å prøve identitet for å unngå eksperimentelle skjevhet. B: SB225002 indusert kaspase 3 aktiveringen og PARP-spaltning (Western blot) i alle OVCA celler undersøkt. C: SB225002 indusert morfologiske trekk ved apoptose i OV2008, som ble fulgt av mitose-lignende celler. D: Flow-cytometrisk analyse av cellesyklusfordelingen av OV2008 etter SB225002 behandling ved forskjellige konsentrasjoner (0, 250, 500, 750 og 1000 nM) i 24 timer. Celler i M fase ble identifisert med anti-fosfo-Histone H3 (P-H3), som vist i dot plots (lavere). Bildene er representative for minst tre forsøk.
SB225002 apoptose i villtype-P53 OVCA cellene gjennom p53 Activation
P53 er avgjørende for induksjon av apoptose i OVCA celler, og er en determinant av CDDP følsomhet [25]. Som vist på fig. 3A, SB225002 (≥500 nM) signifikant opp-regulert p53 samlede og fosfo-p53 (Ser15) i alle cellelinjene som ble undersøkt. Dempe p53 av siRNA nedregulert SB225002-indusert apoptose i både OV2008 og C13 * celler (fig. 3B), noe som tyder på at SB225002 induserer apoptose gjennom aktivering av p53. I motsetning til dette ble antallet fosfo-histon H3-positive celler ikke påvirket av p53 siRNA (Fig. 3C), noe som tyder på rollen til p53 i den SB225002-indusert apoptose er ikke avhengig av mitotiske celle-akkumulering.
A: SB225002 (0-1000 nM, 24 h) økt total-og fosfor-p53 (S15) nivå i OV2008, C13 *, A2780s celler og økt fosfor-p53 i A2780cp celler. SB225002 økte fosfo-p53 /total-p53-forholdet i alle cellelinjer (Western blot). B: Dempe p53 [p53 siRNA (100 nM, 36 h, eller rykke siRNA (kontroll)] redusert SB225002 (750 nM, 24 h) indusert apoptose, men ikke mitose i OV2008 og C13 * celler. C: Dempe p53 hadde ingen effekt på cellenumrene til inngåelse av mitose i OV2008 og C13 * celler behandlet med SD225002 ved 750 nM. Cell i mitose ble identifisert ved FCM, ved hjelp av anti-fosfor-Histone H3 (P-H3).
SB225005 induced opphopning av Pre-modne Mitosis og påfølgende apoptose i p53 Wild-type og Mangel OVCA Cells
Siden SB225002 indusert mitose akkumulering i både p53-villtype og manglende OVCA celler, vi videre stilling til om SB225002 -indusert mitotiske celle opphopning bidratt til apoptose. SB225002 behandling førte til en tidsavhengig økning i prosentandelen av mitotiske celler (fosfo-Histone H3 positive), som begynte på 6 timer, noe som øker og som varer i 24 timer, deretter avtar deretter. SB225002 induserte en sen økning i cellepopulasjonen i sub-G1 fase (apoptose), begynnende ved 12 timer og nådde en topp ved 48 timer. Den tidsavhengige tap i mitotiske celler etter 24 timers eksponering av SB225002 var assosiert med en markert økning i apoptotiske celler, noe som tyder på at SB225002 forårsaket OV2008 celler til å arrestere i mitosen før du går videre til apoptose (fig. 4A).
A: Tidsavhengig avhengig~~POS=HEADCOMP induksjon av mitose (fylte sirkler) og deretter apoptose (fylte firkanter) i OV2008 celler ved SB225002. B: 24 timer etter SB225002 behandling ble mitosetråder visualisert med en Alexa Fluor® konjugert til anti-α-tubulin (grønn) og motfarget med Hoechst (blå). I kontrollceller, ble normal bipolar spindel godt organisert med kondenserte kromosomer innrettet langs ekvator platene under meta-fase og søsterkromatider segregerte ved utbruddet av anaphase (B-1). SB225002-behandlede celler vises mitotiske avvik. Frekvensene for lagging kromosomal materiale, multipolar mitotiske spindler og flere kjerner ble alle økt i SB225002-behandlede celler (B-2, B-3). C:. Kromosom sprer viser SB225002-indusert Aneuploidy /polyploidi
Den morfologi av celler som gjennomgår SB225002-indusert mitose ble ytterligere bekreftet for spindel formasjon, kromatin kondens, og β-tubulin og DNA separasjon. I kontrollceller, ble normal bipolar spindel godt organisert i en oval form, kondenserte kromosomer innrettet langs ekvator platene under meta-fase og søsterkromatider segregerte ved utbruddet av anaphase. SB225002 økt dannelse av bestemte typer multipolar spindler, som i pseudobipolar,-veis og multipolar celler. Det var heller ingen kromosom kondens under profase, eller kondensert kromosomer ikke klarte å justere riktig langs ekvator plater under metafase, men i stedet spredt over cellene. Cell taste anaphase viste åpenbare kromosom lagging, en indikasjon på unormal kromosom segregering i SB-225 002-arrestert mitotiske celler. SB225002 også indusert utseendet på flere kjerner, noe som var mer hyppig med lengre eksponering (Fig. 4B). Avvikende mitose var forbundet med fremkalle aneuploidi /polyploidi celler, som bekreftet av kromosom spre analysen (fig. 4C). Samlet våre data viste at SB225002 forårsaket unormale mitosetråder, endret kromosom segregering i arrestert mitotiske celler, og resulterte i unormal celledeling og dannelse av flere kjerner, som alle var en indikasjon på tidlig mitose, en hendelse til slutt førte til mitotisk katastrofe.
SB225002-indusert Mitotisk Catastrophe er gjennom Chk1 Nedregule gule~~POS=TRUNC og Cdk1 Activation
DNA skade resultater i Chk1 aktivering, noe som fører til CDC25 nedbrytning, redusert Cdk1 aktivitet og G2 arrest [10]. Vi har vist at OVCA celler behandlet med SB225002 avsluttet G2-fasen og føres M fase, og gjennomgikk for tidlig mitose, noe som tyder på G2 /M fase sjekkpunkt deregulering. Derfor undersøkte vi om Chk1 inaktivering og Cdk1 aktivisering var involvert i SB225002 aksjon. SB225002 redusert total og fosfo-Chk1 (S345) nivåer i en konsentrasjonsavhengig måte (fig. 5A), noe som tyder på at fremme for tidlig mitosen oppføring av SB225002 er forbundet med Chk1 inhibering og for tidlig Cdk1 aktivering. Denne forestillingen ble støttet av den observasjon at forbehandling med Cdk1 inhibitor roscovotine forhindret SB225002-indusert mitotiske celle akkumulering og apoptose (fig. 5B). Samlet utgjør disse resultatene indikerer at SB225002 er i stand til å fremme apoptose gjennom mitotisk katastrofe mest sannsynlig gjennom Cdk1 aktivering
A:. SB225002 (0-1000 nM, 24 h) redusert total og fosfor-Chk1 (S317 og S345 ) nivåer i OV2008 celler. B: Forbehandling av celler med OV2008 roscovotine (12 h) attenuert SB225002 (750 nM, 24 h) -indusert M fase akkumulering og redusert påfølgende apoptose. * P. 0,05 (sammenlignet med SB225002 alene)
Tilberedning av Wild Type P53 i P53-null OVCA Cell svekkede SB225002-indusert Mitotisk Catastrophe
For å finne ut om p53 er involvert i SB225002-indusert mitotisk katastrofe, ble p53-null eggstokkreft cellelinje SKOV3 behandles med SB225002. SB225002 induserte en konsentrasjonsavhengig mitotiske celle-akkumulering og apoptose i SKOV3-celler (figur 6A E: Adenviral villtype p53-infeksjon (MOI = 10; adenoviral LacZ for å utjevne total MOI i hver forsøksgruppe) av SKOV3 attenuert SB225002 (750 nM; DMSO som kontroll) -indusert mitose og påfølgende apoptose. p53 innhold og PARP cleavage ble vurdert til 24 h (Western blot). Cellesyklusutvikling ble bestemt ved flow-cytometri. Verdier er gjennomsnitt ± SEM. * P≤0.05 (i forhold til DMSO-kontroll).
# P≤0.05 (sammenlignet med SB225002-behandlede celler).
SB225002-indusert apoptose og Katastrofale Mitosis var ikke gjennom Blokkering CXCR2 Receptor Signa
Siden SB225002 er en spesifikk ikke-peptid-antagonist for CXCR2, så undersøkte vi hvorvidt virkningen av SB225002 er mediert gjennom CXCR2. Først må vi forhåndsbehandlet OV2008 og C13 * celler med forskjellige konsentrasjoner av IL-8 i 2 timer før dyrking av dem med SB225002 (750 nM) i ytterligere 24 timer. Uventet, forbehandling med IL-8 eller GRO-en ikke klarte å inhibere SB225002-indusert mitose eller apoptose (Fig. S1A), som indikerer at SB225002-indusert mitose og apoptose ikke kan være mediert gjennom CXCR2. I tillegg forbehandling av cellene med CXCR2 nøytraliserende antistoff og en annen antagonist for CXCR1 /CXCR2-G31P [33] ikke hadde noen effekt på basal eller SB225002-indusert apoptose og mitose i OV2008 og C13 * (fig. S1B og S1C). Videre er en annen spesifikk hemmer av CXCR2, SB265610 ikke hadde noen effekt på basal og SB225002-indusert apoptose og mitotisk stopp (fig S2A & Co.. B & C) og p53-aktivering og Chk1 inhibering i OV2008 (Fig S2D.). Sammen utgjør disse funnene støtter oppfatningen om at SB225002 induserer apoptose og mitotisk katastrofe i OVCA cellene uavhengig av CXCR2.
Diskusjoner
I denne studien har vi vist at SB225002, et ikke-peptid CXCR2 antagonist, er effektiv i å indusere apoptose ved sjekkpunkt interphases og mitose i begge CDDP-sensitive og -resistente OVCA cellelinjer med ulik p53 status. Behandling av kreft celler med SB225002 resulterte i p53-mediert klassisk apoptose men også utløst mitotisk katastrofe i p53 villtype og manglende OVCA celler. SB225002 indusert mitotisk katastrofe ved å fremme unormale mitosetråder endre kromosom segregering i arrestert mitotiske celler, og forårsaket unormal celledeling og dannelse av flere kjerner. Disse endringene ble opphevet ved roscovotine, noe som tyder på at cyklin B /CDK1 hadde blitt aktivert ved nedregulering av sjekkpunktet kinase Chk1. Virkningene av SB225002 ble ikke modulert ved forbehandling med CXCR2 ligander eller sin nøytraliserende antistoff, eller etterlignet av andre CXCR2 antagonist SB265610 eller G31P. Vår studie gir den første demonstrasjonen som SB225002 indusert celledød ikke bare gjennom vanlig apoptose men også mitotisk katastrofe via en CXCR2 uavhengig.
Vår studie viste at både p53 villtype og manglende OVCA cellene reagerer på SB225002 i induksjon av apoptose, om enn ved forskjellige mekanismer. P53 enten kan utløse apoptose via aktivering av indre (mitokondriell) og ytre (død-reseptor) apoptotiske reaksjonsvei gjennom genomisk [33], [34] og ikke-genomiske [27], [28] mekanismer.
