Abstract
Bakgrunn
Hensikten med denne studien var å evaluere aktiviteten av selektive inhibitorer av Nuclear Export (SINE) forbindelser som hemmer funksjonen av kjernefysiske eksport protein exportin 1 (XPO1 /CRM1) mot canine tumorcellelinjer og utføre en fase i klinisk utprøving av KPT-335 hos hunder med spontan kreft for å gi en foreløpig vurdering av biologisk aktivitet og toleranse.
Metoder og funn
canine tumorcellelinjer avledet fra non-Hodgkin lymfom (NHL), mastcelletumor, melanom og osteosarkom viste vekst-inhibering og apoptose i respons til nanomolare konsentrasjoner av sinus forbindelser; NHL celler var spesielt følsomme med IC
50 konsentrasjoner i området 2-42 nM. En fase I klinisk studie av KPT-335 ble utført i 17 hunder med NHL (naiv eller residiverende), mast celle svulst eller osteosarkom. Den maksimale tolererte dose var 1,75 mg /kg gitt oralt to ganger /uke (mandag /torsdag) selv om biologisk aktivitet ble observert ved 1 mg /kg. Klinisk nytte (CB) inkludert partiell respons på behandling (PR, n = 2) og stabil sykdom (SD, n = 7) ble observert i 9/14 hunder med NHL med en median tid til progresjon (TTP) for respondere på 66 dager (varierer 35-256 dager). En dose utvidelse studie ble utført i 6 hunder med NHL gitt 1,5 mg /kg KPT-335 mandag /onsdag /fredag; CB ble observert i 4/6 hunder med en median TTP for respondere på 83 dager (range 35-354 dager). Toksisitet var hovedsakelig gastrointestinal bestående av anoreksi, vekttap, oppkast og diaré, og var håndterlig med støttende behandling, dose modulasjon og administrasjon av lav dose prednison; levertoksisitet, anoreksi og vekttap var den dosebegrensende toksisitet.
Konklusjoner
Denne studien gir bevis for at romanen muntlig biotilgjengelig XPO1 inhibitor KPT-335 er trygt og viser aktivitet i en relevant, spontan stor dyremodell av kreft. Data fra denne studien gir viktig ny informasjon som legger grunnlaget for evaluering av sinus forbindelser i human kreft
Citation. London CA, Bernabe LF, Barnard S, Kisseberth WC, Borgatti A, Henson M, et al. (2014) Preklinisk Evaluering av Novel, muntlig Biotilgjengelig selektiv hemmer av Nuclear Export (SINE) KPT-335 i Spontan Canine Cancer: Resultater fra en fase I studie. PLoS ONE 9 (2): e87585. doi: 10,1371 /journal.pone.0087585
Redaktør: Kristy L. Richards, University of North Carolina i Chapel Hill, USA
mottatt: 10. juni, 2013, Godkjent: 28 desember 2013; Publisert: 04.02.2014
Copyright: © 2014 London et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. De bevilgende myndighet (Karyopharm Therapeutics) bistått i studiedesign og redigert manuskriptet etter sin forberedelse. Karyopharm Therapeutics hadde ingen rolle i datainnsamling, dataanalyse eller selve utarbeidelsen av selve manuskriptet
Konkurrerende interesser. Jeg har lest journalen politikk og har følgende konflikter. J S-M, DM, MK og SS er alle ansatte i Karyopharm Therapeutics. Den kliniske studien arbeidet ble finansiert av Karyopharm therapeutics. CAL har mottatt honorarer fra Karyopharm Therapeutics. Dette endrer ikke vår tilslutning til alle de PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Utveksling av proteiner mellom kjernen og cytoplasma er et tett regulert prosess som involverer flere proteiner ansvarlig for skyt last inn og ut av kjernen. Det er syv kjente nukleære eksportere proteiner (exportin 1-7) som bærer makromolekyler fra kjernen til cytoplasma [1], [2], [3]. Exportin 1 (XPO1, også kalt kromosom Region Vedlikehold protein 1 [CRM1]) er et medlem av karyopherin β familie av transport reseptorer som binder en svært mangfoldig sett av ca 220 target proteiner gjennom en hydrofob leucine-rik kjernefysisk eksport signal (NES) til stede i laste [4]. Interaksjon av NES-rettet protein last med den lille GTPase molekyl Ran fører til cytoplasma transport via en kjernefysisk pore kompleks [5]. XPO1 er den eneste atom eksportør av flere store tumor suppressor og vekstregulerende proteiner (TSP-ene og GPR, inkludert p53, p75, Rb, p21, p27, STAT3, FOXO og IKB blant andre) [6], [7]. Ekspresjon av XPO1 er kjent for å være oppregulert i et utvalg av både hematologisk ondartede sykdommer og faste tumorer, og dette korrelerer med en dårlig prognose [1], [2], [3], noe som indikerer at endringer i atom-cytoplasmisk handel som resulterer i avvikende lokalisering av viktige proteiner kan bidra til tumorgenese og potensielt resistens overfor terapi.
Flere lavmolekylære inhibitorer av XPO1 har blitt utviklet og testet mot en rekke neoplastiske celler, primært
in vitro
. Disse inkluderer Leptomycin B, ratjadone, anguinomycin, goniothalamin, blant andre, som binder seg kovalent til et reaktivt cysteinresiduum (Cys528) som befinner seg i den NES-bindende spor av XPO1 [1], [2], [3]. Denne bindingen funksjonelt inaktiverer XPO1 på en irreversibel måte, og er rettet mot proteinet for proteasomet degradering [8], noe som resulterer i gjenopprettelse av TSP og GRP cellulær lokalisering og funksjon. For eksempel fører Leptomycin B atom oppbevaring av BCR-ABL1 fusjonsprotein og induserer apoptose når det gis samtidig med imatinib til CML celler
in vitro product: [9]. Mens Leptomycin B viser aktivitet mot flere kreftcellelinjer
in vitro Kjøpe og mus xenograft tumormodeller, induserer det betydelig systemisk toksisitet hos både dyr og mennesker som førte til seponering av klinisk utvikling [10]. Mer nylig analoger av Leptomycin B har blitt utviklet som viser større potens
in vitro Hotell og
in vivo
med en betydelig redusert toksisitetsprofil hos mus [11]. Men disse midlene krever intravenøs levering, noe som begrenser hyppigheten av Drug Administration.
Nylig, roman, narkotika-lignende, oralt biotilgjengelig, liten molekyl selektiv hemmer av Nuclear Export (SINE) forbindelser som spesifikt og irreversibelt bindes til XPO1 på reaktivt sete Cys 528 rester har blitt utviklet [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18]. Disse er langsomt reversible med en t
1/2 av ca. 24 timer, og lede til funksjonelle inaktivering av XPO1 protein. Sinus forbindelser har blitt vist å indusere apoptose og blokkere proliferasjon i flere kreftcellelinjer, inkludert de som er avledet fra tykktarm [6], bukspyttkjertel [12], og brystkarsinomer [16], så vel som kronisk lymfatisk leukemi (CLL) [15], skåner normale celler [19]. Andre studier har vist potent anti kreft aktivitet og god toleranse av SINE
in vivo
ved hjelp av musen human xenograft (subkutant, orthotopic, eller leukemograft) modeller av bukspyttkjertelkreft [12], nyrekreft [20], CLL [15 ], mantle celle lymfom (MCL) [18], multippelt myelom [8] og akutt myelogen leukemi (AML) [17]. Disse dataene støtter forestillingen om at sinus forbindelser vil ha biologisk aktivitet hos mennesker med kreft.
Spontan canine kreft vise mange kliniske og molekylær likheter til kreft hos mennesker og som sådan, tjene som en attraktiv modell for prekliniske studier som evaluerer biologisk aktivitet og toksisitet av nye anti-kreftbehandling. Slike studier har blitt brukt til å bekrefte aktiviteten av multi-rettet reseptor tyrosin kinase inhibitorer (toceranib) [21], [22], nye kjemoterapeutiske midler (GS-9219) [23], og forskjellige andre lavmolekylære inhibitorer (ibrutinib, STA -1474) [24], [25]. Derfor hensikten med dette arbeidet var å undersøke effekten av sinus forbindelser i hunde spontane kreft. Nærmere bestemt, deres aktivitet ble først vurdert
in vitro
mot hjørnetumorcellelinjer med en spesifikk vekt på hematopoietiske tumorer, hvoretter en fase I-studie av de nye SINE KPT-335 ble utført på hunder med metastatisk osteosarkom, mast celle tumor og non-Hodgkin lymfom (NHL). Disse studiene la grunnlaget for den nåværende fase I evalueringen av SINE sammensatte KPT-330 hos mennesker med kreft og for et potensielt hovedstudien av KPT-335 for hunder med nylig diagnostisert eller residiverende NHL.
Materialer og Metoder
Primær tumorprøver og cellekultur
kryopreserveres kreftceller hentet fra sterile lymfeknutebiopsiprøver fra hunder med diffuse store B-celle lymfom (DLBCL) ble dyrket med 100 ng /ml megaCD40L (Enzo life Science, Plymouth Meeting, PA) som tidligere beskrevet [26], [27]. Den humane T-celleleukemicellelinje, Jurkat, var fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og dyrket i RPMI 1640 medium (Gibco /BRL, Grand Island, NY) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS; Atlas Biologicals, Fort Collins, CO), 2-merkaptoetanol (Gibco /BRL), HEPES, L-glutamin, natriumpyruvat (Mediatech Inc, Manassas, VA), ikke-essensielle aminosyrer (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) og Primocin (Invivogen, San Diego, California). Hunden DLBCL cellelinje CLBL1 hentet fra Dr. Barbara Rütgen (Universitetet i Wien, Østerrike) [28], [29] og menneske DLBCL cellelinjer OCI-Ly3 [30], [31] og OCI-Ly10 [32] hentet fra Dr. Anne Novak (Mayo Clinic Cancer Center, Rochester, Minnesota) ble dyrket i fullstendig Iscove modifiserte Dulbeccos medium (IMDM) som inneholder 20% FBS, L-glutamin, og Primocin. Alle celler ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære. Følgende tilleggstann tumorcellelinjer ble brukt for å evaluere responsen på sinus forbindelser: C2, mastcelletumor linje levert av Dr. George Caughey, UCSF, San Francisco, CA [33]; OSA16, osteosarkomcellelinje, levert av Dr. Jaime Modiano, UM, Minneapolis, MN [34]; og 323610-3, malignt melanom-cellelinje, levert av Dr. Michael Kent, UCD, Davis, CA [35]. Alle cellelinjer ble dyrket i komplett RPMI-medium som inneholder 10% FBS, antibiotika /sopp, HEPES, natrium pyruvat, ikke-essensielle aminosyrer og Glutamax (medie tilskudd fra Gibco).
Livskraftig og sprednings Analyser
Celleviabilitet for lymfoide linjer ble bestemt ved MTS (3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium) ved benyttelse CellTiter 96 ® AQ
ueous En løsning Cell Proliferation Assay Kit (Promega, Madison, WI). I korthet, for lymfoide cellelinjer, 5 x 10
4 celler (eller 1 x 10
5 primær DLBCL celler) ble dyrket i 100 pl komplett medium i 96-brønners plater i nærvær av sinus-forbindelser. Etter 72 timer ble 20 ul av MTS-løsning tilsatt til hver brønn og cellene ble inkubert i ytterligere 4 timer før måling av absorbansen ved 490 nm ved anvendelse av en Wallac Victor 1420 Multilabel Counter (Perkin Eimer, Waltham, MA). IC
50 av SINE ble beregnet ved bruk av Prism 6 programvare (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA).
For de ikke-lymfoide cellelinjer, 96 brønners plater ble sådd i tre eksemplarer i 90 mL med 2500 celler /brønn OSA16, 5000 celler /brønn av C2, og 2500 celler /brønn av 323610-3. Seeded Platene ble dyrket over natten og deretter behandlet den neste dag med 10 ul av KPT-214 i C10 media i konsentrasjoner på 0,0001, 0,01, 0,1, 1,0 og 10 uM. Platene ble samlet inn på 92 timer, sentrifugert ved 1300 rpm, og supernatanten ble fjernet ved å snu platene på absorberende papir. Platene ble deretter forseglet og plassert umiddelbart ved -80 ° C i minimum 12 timer. Platene ble deretter tint og CyQUANT ®Cell Proliferation Assay (Life Technologies) ble utført etter produsentens protokoll. I korte trekk ble 200 ul av den fortynnede arbeids CyQUANT løsning tilsatt til hver brønn og beskyttet mot lys. Fluorescens ble målt ved anvendelse av en SpectraMax M2 mikroplateleser ved 480 nm eksitasjon og 520 nm emisjon. Resultatene ble representert som prosent av kontroll, eller plottet for å beregne IC
50-verdier på 92 timer.
Apoptose-analysen
Jurkat-celler og primære canine DLBCL celler ble dyrket i 24 timer i nærvær av 100 nM KPT-335 eller dimetylsulfoksid (DMSO). Cellene ble farget med Annexin V (eBiosciences, San Diego, CA) i henhold til produsentens anvisninger. Flowcytometri ble utført ved hjelp av en BD LSRII flowcytometer (BD Immunocytometry Systems, San Jose, CA) og resultatene ble analysert ved hjelp FlowJo programvare (Tre Star, Ashland, Oregon).
Immunoblotting
cryopreserved primære canine DLBCL og CLBL1 celler ble lysert i RIPA-buffer inneholdende 150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7,4, 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS), 1,0% Triton X-100, 1,0% natriumdeoksykolat, 5 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol, og en proteinase inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Uoppløselig materiale ble fjernet ved sentrifugering, og proteinkonsentrasjonen av cellelysatene ble bestemt ved anvendelse av BioRad protein analyse kit (BioRad, Hercules, CA). Proteiner (100 pg) ble separert ved SDS-polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) og overført til nitrocellulosemembraner (BioRad, Hercules, CA). Antistoff-farging ble utført ved hjelp av SNAP i.d. system (EMD Millipore, Billerica, MA) i henhold til produsentens instruksjoner. Kort, membran ble blokkert med 50% LI-COR blokkeringsbuffer (LI-COR, Lincoln, NE) og farget med kanin anti-XPO1 antistoff (1:66 fortynning, Santa Cruz, Santa Cruz, California) og mus anti-aktin antistoff (1:1666 fortynning, Sigma-Aldrich), etterfulgt av sekundær esel-anti-kanin antistoff konjugert til IRDye800 og anti-mus-antistoff konjugert til IRDye680 (1:3,333 fortynning LI-COR). Deteksjon ble utført ved hjelp av Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR).
KPT-335 Formulering
KPT-335 ble framstilt som gelatin kapslene i styrker fra 2,5 mg til 20 mg aktive farmasøytiske bestanddel (API). Det API ble våtmalt med Lutrol F68 NF (BASF) og vann i en Microfluidics mikro-fluidisator, kombinert med Plasdone K29 /30 (ISP Technologies), og frysetørket. Lyofilisert pulver inneholdt 70-75% API. Kapslene ble individuelt hånd fylt med lyofilisert pulver til den ønskede doseringsstyrke. Alle stoffene var av egnede karakterer for bruk i legemidler.
analyse hos friske hunder
KPT-335 ble administrert som en enkeltdose i kapselformulering til 6 beagle hannhunder på ca 1,5 mg /kg etter et måltid. Serieblodprøver ble tatt fra hver hund før dosering, og ved 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 18, 24 og 48 timer etter dosering, og som er lagt inn i rør innehold K
2EDTA. Blodprøvene ble lagret på våt is inntil bearbeides til plasma ved sentrifugering ved 3500 rpm i 10 minutter ved 5 ° C. Plasmaprøver ble lagret i ved -80 ° C inntil analyse ved Agilux Laboratories (Worcester, MA). Plasmaprøver ble analysert med henblikk på det opphavelige medikament-konsentrasjon ved bruk av prøvepreparering av proteinutfelling og deretter analyse ved LC-MS /MS ved å bruke propranolol som indre standard. Metoden ble kvalifisert for bruk (et enkelt parti å vurdere metode ytelse: presisjon og nøyaktighet, linearitet av fortynning, og matrise spesifisitet) før oppstart av prøveanalyse. Akseptkriterier for kalibreringsstandarder og kvalitetskontroll prøvene var innenfor ± 30% nominell konsentrasjon. Individuelle dyr farmakokinetiske parameterverdier ble avledet av den farmakokinetiske analysen program Phoenix WinNonlin versjon 6.3 (Pharsight Corporation), ved hjelp av ikke-kompartment modell 200 med uniform vekting. De farmakokinetiske enkeltdose parametere som vurderes er: C
max (maksimalkonsentrasjon observert); T
max (tid observerte maksimal konsentrasjon); AUC
0 → ∞ (areal under konsentrasjonskurven fra tid null ekstrapolert til uendelig); AUC
0 → siste (areal under konsentrasjon-tidskurven fra tid null til tid for siste målbare konsentrasjonen); og t
1/2 (terminal halveringstid). Beskrivende statistiske data (gjennomsnitt, standardavvik og standardfeil for gjennomsnittet) ble beregnet fra unrounded tallene i en Excel (Microsoft) regneark. Konsentrasjon resultater, midler, og beregnede parametre ble rapportert til 3 store tall.
Clinical Trial Kvalifikasjon
Denne kliniske studien ble godkjent av Ohio State University (OSU) Veterinary Medical Center (VMC) Klinisk forskning Advisory Committee og OSU IACUC; IACUC godkjenning ble også oppnådd ved University of Minnesota og Texas A M University. Skriftlig informert samtykke fra eieren av hver hund ble hentet før studiestart. KPT-335 ble gitt til hunder med metastatisk osteosarkom, mast celle svulst eller NHL som hadde mislyktes konvensjonell terapi eller som var der ingen behandlingsalternativer, eller som konvensjonell terapi ikke var ønsket av eieren. For å være kvalifisert for studiet, hver hund må ha blitt definitivt diagnostisert via cytologi eller histopatologi og hadde møtt alle inklusjonskriteriene, og ingen av eksklusjonskriteriene. Andre kriterier som følger med: 1 år gammel ved studiestart; tilstrekkelig organfunksjon; minst 2 uker siden kjemoterapi eller stråling med fullstendig gjenoppretting fra de akutte toksisitet av disse behandlingene (3 uker for et kirurgisk inngrep); minst en uke etter tidligere behandling med en hvilken som helst annen utprøvings medikament; og ingen tegn på hjernemetastaser eller noen alvorlig systemisk lidelse uforenlig med studiet ved skjønn av etterforskeren.
Studiedesign
Denne studien var en fase I dose eskalerende, åpen vurdering av sikkerhet og biologisk aktivitet av KPT-335 i kundeeide hunder med spontane maligniteter. Vurdering av kliniske toksisitet og tumorrespons ble utført ved hvert besøk. Hundene ble evaluert for hematologisk og biokjemiske toksisitet hver 7. dag med rutine bloodwork. Den innledende dose på 1 mg /kg oralt to ganger per uke (mandag /torsdag eller tirsdag /fredag) var basert på tidligere data fra normale laboratorie hunder (data ikke vist) og doseøkning ble satt til trinn på 0,25 mg /kg i kohorter av 3 inntil dosebegrensende toksisitet (DLT) ble identifisert. Den DLT ble ansett å være noen grad 3 eller 4 hematologisk eller ikke-hematologisk toksisitet basert på de etablerte VCOG-CTCAE kriterier [36]. I tillegg noen kronisk ikke-grad 3 eller 4 toksisitet vurderes å betydelig forringe livskvaliteten (dvs., slapphet, manglende appetitt) var kvalifisert som DLTs. Sykdomsprogresjon eller tegn og symptomer definitivt relatert til sykdommen ble ikke ansett bivirkninger (AES). Den maksimale tolererte dosen (MTD) ble ansett for å være en dose under den ved hvilken DLT oppstått.
Toksisitet Vurdering
Hver pasient gjennomgikk en baseline komplett historie, fysisk undersøkelse, og pre-dose laboratorium vurdering som inkluderte en fullstendig blodtelling (CBC), serum biokjemi profil, koagulasjonsparametere (PT /TOS) og urinanalyse. Pasientene ble vurdert for bivirkninger på dager 7, 14, 21, og 28, og hver 2. uke etterpå og da alle laboratorie Vurderingene ble gjentatt. Bestemmelser om minimale hematologiske krav for å fortsette dosering ble inkludert i protokollen: hematokrit 25%, nøytrofile 1500 /L, blodplater 100000 /L. I tillegg ble levertransaminaser som kreves for å være. 4X øvre normalgrense med en normal total bilirubin og serumkreatinin å fortsette KPT-335 terapi
samtidig medisinering
For å behandle narkotikarelatert gastrointestinale bivirkningene, støttebehandling ble gitt som nødvendig for å hunder som deltok i denne studien. Dette typisk besto av famotidin, omeprazol, metronidazol, loperamid, metoklopramid, ondansetron, og /eller maropitant. Antihistaminer ble administrert til hunder med mast celle svulster, da disse tumorene er kjent for å frigi histamin. Andre støttebehandling gis til hunder besto av prednison og ikke-steroide anti-inflammatoriske medisiner for å behandle tumor-assosiert betennelse, manglende appetitt, og for smertekontroll.
Tumor Response Assessment
Kreft Vurderingene ble utført før studiestart, og dagene 7, 14, 21 og 28. for hunder som fortsatte utover 4 uker, ble responsmålinger utføres hver 2 uker etterpå, eller ved mistanke om svulst progresjon. Svarene ble vurdert av utprøver i henhold til forhåndsdefinerte protokoll kriterier. Responsen hos hunder med assessable sykdom ble utført ved klinisk undersøkelse, ultralyd, eller thorax røntgen. Mange lesjoner var ikke mottagelig for kvantitativ røntgenfotografering, men ble fulgt enten ved serie klinisk undersøkelse (overfladiske lesjoner; opplagte lymfeknuter) eller ved ultralyd (mage lymfeknuter). Thorax lesjoner ble vurdert av thorax røntgen.
Responsen hos hunder med målbar sykdom ble dømt av utprøver på grunnlag av Response evalueringskriterier for Perifer Nodal lymfom i hunder (v1.0) [37]. En fullstendig respons (CR) ble definert som forsvinning av alle sykdommer på to målingene er atskilt med en minimumsperiode på 3 uker. En delvis respons (PR) ble definert som mer enn 30% reduksjon i summen av den lengste diameteren av mållesjoner dokumentert ved to vurderinger atskilt med minst 3 uker. En økning av 20% i størrelsen av alle målbare tumorområder som målt ved summen av lengste diameteren til mållesjoner tatt som referanse den minste summen siden behandlingsstart, eller utseendet av enhver ny lesjon (er) vil kvalifisere som progressiv sykdom (PD). Stabil sykdom (SD) ble definert av fravær av kriteriene for enten en reaksjon eller progresjon; som skal behandles SD, må hunder har vist noen tegn på PD på 28 dagers vurdering. Hunder som ikke hadde noen tegn til tumorprogresjon og som ikke hadde opplevd noen uakseptabel toksisitet var kvalifisert for utvidet behandlingssykluser. Doseøkning fra to ganger per uke administrasjon til tre ganger per uke administrasjon i den enkelte hunden ble tillatt dersom hunden ble tolerer terapi.
Livskvalitet Assessment
Et verktøy for å vurdere livskvalitet i hunder med cancer i løpet av behandlingen er tidligere blitt publisert [38]. Dette ble brukt til å vurdere eier oppfattet endringer i hunder som gjennomgår KPT-335 behandling både under doseeskalerings og dose ekspansjons studier. En samlet livskvalitet (livskvalitet) Poengsummen ble laget basert på svar på spørsmål om livskvalitet. Poengene fra hvert spørsmål ble oppsummert som resulterer i en generell livskvalitet poengsum som kan variere fra 23 til 115. Trender i livskvalitet (livskvalitet) i løpet av studien ble undersøkt ved hjelp av lineære blandede modeller som inneholder faste effektene av tid og en autoregressiv korrelasjon struktur for tilfeldige feil. Wald tester ble brukt for å teste for en betydelig endring i livskvalitet med frihetsgrader beregnet på grunnlag av Kenward-Roger metoden [39]. Målinger oppnådd etter 90 dager var ikke inkludert i analysen for doseeskaleringsstudie og målinger etter 70 dager ikke ble inkludert i analysen av dose ekspansjons data på grunn av noen datapunkter etter disse tidspunktene.
Resultater
aktivitet av sinus forbindelser mot Canine tumorceller
in vitro
Vi har evaluert første effekten av KPT-185, som er en av de mest potente sinus forbindelser, men med begrenset oral biotilgjengelighet og derfor bare egnet for
in vitro
studier på Jurkat (human T-celle leukemi) celler og 6 primære canine DLBCL prøver (5 forskjellige svulster med ett par av samme tumor). KPT-185 effektivt hemmet levedyktighet av Jurkat og hjørnetann DLBCL celler (figur 1A og Tabell 1). IC
50 av KPT-185 mot Jurkat (n = 3) og den primære canine DLBCL prøver (n = 6) var 8,7 ± 0,7 nM og 13,3 ± 6,2 nM, respektivt. KPT185-trans-isomer (som har ca. 100 ganger mindre XPO1 inhibisjonsaktivitet som cis-isomer) viste mye lavere toksisitet når det ble testet ved hjelp av Jurkat-celler og en av primær canine DLBCL prøver (IC
50 var 1000 nM i begge tumorceller). Deretter vurderte vi effekten av KPT-335, en klinisk kandidatforbindelse med god oral eksponering brukes i denne kliniske studien på hund og menneske DLBCL celler. KPT-335 hemmet levedyktigheten av OCI-Ly3, OCI-Ly10, og CLBL1 på IC
50 på 2,1 ± 1,3 nM, 41,8 ± 21,0 nM, og 8,5 ± 4,1 nM, respektivt (figur 1B og tabell 1). Vi viste også KPT-335 indusert apoptose i CLBL1 elementer og hjørnetann DLBCL celler ved hjelp av flowcytometri. Behandling av celler med KPT-335 i 24 timer økt apoptotiske celler (Annexin V
+ celler) sammenlignet med spotte behandlede celler (figur 1C). Til slutt fikk vi bekreftet uttrykk for XPO1, som ble oppdaget av den estimerte størrelsen XPO1 (~123 kDa), i hundeceller ved hjelp av CLBL1 cellelinje, menneske DLBCL cellelinjer, og hjørnetann primære DLBCL celler (figur 1D). Tatt sammen, både menneskelig og hjørnetann DLBCL uttrykke XPO1 og sinus forbindelser viser potent aktivitet mot disse kreftcellene, noe som tyder på en potensiell terapeutisk fordel for menneskelige og hjørnetann pasienter med DLBCL.
(A) Jurkatceller og primær canine DLBCL celler (prøve nr 1-5, # 5 ble uavhengig testet to ganger) ble dyrket i 96-brønners plater i 72 timer med log serielle fortynninger av KPT-185, og cellenes levedyktighet ble analysert ved bruk av MTS-analysen. Hvert eksperiment ble utført i duplikate brønner og forsøk ble gjentatt tre ganger (B) Menneske og canine DLBCL celler ble dyrket i en 96-brønners plate i 72 timer med 3-ganger seriefortynninger (0-1000 Nm) av KPT-335 og analysert hjelp av MTS analysen. Hvert eksperiment ble utført i duplikate brønner og forsøk ble gjentatt tre ganger. (C) CLBL1 celler og primære canine DLBCL celler (prøve 1 #) ble behandlet med 100 nM KPT-335 i 24 timer og analysert for apoptose ved hjelp av flow cytometri. Eksperimenter ble utført tre ganger, uavhengig av hverandre, og de gjennomsnittlige resultater er vist. (D) Uttrykk for XPO1 i menneskelige og hjørnetann DLBCL cellelinjer. Protein lysatene fremstilt fra OCI-Ly3, OCI-Ly10, og CLBL1 ble separert ved SDS-PAGE og underkastet immunblotting for XPO1; β-actin fungerte som kontroll.
For å gi en foreløpig vurdering av potensialet aktiviteten til SINE XPO1 antagonister mot ekstra hjørnetann kreft, C2 mastcelletumor linje, OSA16 osteosarkomcellelinje og 323610-3 melanomcellelinje ble anvendt. For disse studiene en tidligere analog, KPT-214, var tilgjengelig for in vitro-eksperimenter (figur 2). IC
50 av KPT-214 mot C2, OSA16 og 323 610 var 490 nM, 89 nM og 70 nM. I sammendrag, SINE utviser biologiske aktiviteten
in vitro
mot et bredt utvalg av canine tumorcellelinjer, med lymfoide linjer å være den mest følsomme i det meget lave nanomolare området. Disse dataene støttet påfølgende
in vivo
evaluering av SINE hos hunder med spontane kreft, med særlig vekt på hunder NHL.
Canine tumorcellelinjer C2 (mastceller), OSA16 (osteosarkom) og 323610-3 ble dyrket i 96-brønners plater i triplikat med serielle fortynninger av KPT-214 i 92 timer, hvoretter platene ble samlet, media fjernet, og platene ble fryst ved -80 ° C. Analyse med hensyn til virkning på celleformering ble deretter utført ved anvendelse av CyQUANT assay i henhold til produsentens spesifikasjoner. Forsøkene ble gjentatt tre ganger; IC
50 for hver cellelinje vises.
farmakokinetikk KPT-335 i friske hunder
For å vurdere farmakokinetikken til KPT-335, seks friske beaglehunder var administrert en enkelt dose av medikament ved 1,5 mg /kg etter å ha blitt tilført et måltid. Blodprøver ble tatt i løpet av en 48 timers periode og analysert med hensyn på plasma KPT-335-konsentrasjoner. Resultatene er vist i tabell 2. Den midlere T
max var omtrent 4 timer med en C
maks på omtrent 250 ng /ml og en gjennomsnittlig AUC på 1800 ng /ml.
doseøkning Study
Pasient demografi.
Pasient demografi og krefttyper er oppført i Tabell 3. til sammen 17 hunder ble innmeldt i doseøkning delen av studien. Median alder var 7,5 år og median vekt var 35 kg. Flertallet av hunder hadde registrert NHL (n = 14), og de (n = 12) også hadde fått tidligere behandlinger, inkludert kirurgi, kjemoterapi og /eller prednison. Prednison ble gitt til 10 hunder i løpet av KPT-335 behandling på 0,5 mg /kg hver gang per dag eller annenhver dag; i 8/10 tilfeller, hundene gikk inn i studien etter å ha opplevd sykdomsutvikling i møte med prednison terapi og dermed legemidlet ble ikke avviklet. De gjenværende to hundene ble plassert på prednison etter de første 28 dagene av behandling for å løse manglende appetitt /anoreksi assosiert med behandling. Disse hundene fikk prednison på 0,5 mg /kg annenhver dag for varigheten av behandlingen med KPT-335.
Kliniske toksisitet og maksimal tolerert dose.
For alle hunder registrert i doseøkning del av studien, de primære kliniske toksisitet besto av hovedsakelig grad 1 og 2 gastrointestinale bivirkninger, inkludert anoreksi, oppkast og diaré, samt slapphet (oppsummert i tabell 4 og 5). MTD ble etablert som 1,75 mg /kg gitt to ganger per uke (mandag /torsdag). Alle tre hundene i 2 mg /kg kohort opplevd DLT inkludert grad 3 anoreksi (n = 2), grad 3 oppkast (n = 1), grad 3 diaré (n = 1), klasse 3 ALAT (n = 2), grad 3 ASAT (n = 1), og grad 3 ALP høyde (n = 1). Derfor var bivirkningsprofilen til KPT-335 var i hovedsak begrenset til mage-tarmkanalen og klinisk relevant levertoksisitet ble observert hovedsakelig ved doser over MTD.
Bilder
I 4 tilfeller, hunder som var på narkotika i over fire uker hadde en endring i diett fra to ganger per uke til tre ganger per uke (mandag /onsdag /fredag) som stoffet ble godt tolerert og hundene var opplever stabil sykdom. Dette skjedde i en hund mottok 1 mg /kg, to hunder som fikk 1,25 mg /kg, og en hund mottok 1,5 mg /kg. De forble på denne økte doseringsintervall diett for varigheten av behandlingen (median 68,5 dager) uten noen økning i klinisk toksisitet. I 4 tilfeller dosejustering ble gjort for hunder som opplevde bivirkninger. To av disse skjedde i hunder som fikk stoffet på 2 mg /kg og erfarne grad 3 bivirkninger; i begge tilfeller, ble dosen redusert til 1,5 mg /kg to ganger per uke. I de to andre tilfellene, ble en hund redusert fra 1,75 mg /kg til 1,5 mg /kg og deretter 1,25 mg /kg på grunn av vedvarende problemer med anoreksi, og den andre hunden ble redusert fra 1,5 mg /kg til 1,25 mg /kg, også på grunn av anoreksi. Denne siste pasienten forble på terapi for 246 dager.
respons på behandling.
Median TTP for alle hunder var 35 dager (range 14-246 dager). Totalt 7 hunder opplevd PD i de første 4 ukene av behandlingen.
