Abstract
Oseltamivirfosfat er en mye brukt anti-influensa sialidase hemmer. Sialylering, styrt av sialyltransferaser og sialidases, er sterkt implisert i onkogenese og progresjon av brystkreft. I denne studien evaluerte vi den biologiske oppførsel av hjørnetann brystsvulstceller på oseltamivirfosfat behandling (en sialidase hemmer)
in vitro Hotell og
in vivo
. Våre
in vitro
Resultatene viste at oseltamivir fosfat svekker sialidase aktivitet fører til økt sialysering i CMA07 og CMT-U27 canine melkekreftceller. Overraskende, oseltamivirfosfat stimulert, CMT-U27 celle migrering og invasjon kapasitet
in vitro
, på en doseavhengig måte. CMT-U27 svulster xenograft av oseltamivir fosfat-behandlede naken mus viste økt sialysering, nemlig α2,6 terminalstruktur og SLE (x) uttrykk. Bemerkelsesverdig, ble en trend mot økt lungemetastaser observert i Oseltamivirfosfat behandlet nakne mus. Til sammen våre funn viste at oseltamivir svekker canine mammary kreft celle sialidase aktivitet, endre sialylering mønster av hjørnetann brystsvulster, og fører overraskende, for å
in vitro Hotell og
in vivo
økt melke tumor aggressivitet
Citation. de Oliveira JT, Santos AL, Gomes C, Barros R, Ribeiro C, Mendes N et al. (2015) Anti-Influensa neuraminidase inhibitor Oseltamivirfosfat induserer Canine melke Cancer Cell Aggressivitet. PLoS ONE 10 (4): e0121590. doi: 10,1371 /journal.pone.0121590
Academic Editor: David Wai Chan, The University of Hong Kong, Hongkong
mottatt: 12 september 2014; Godkjent: 13 februar 2015; Publisert: 07.04.2015
Copyright: © 2015 de Oliveira et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den portugisiske byrået «Fundação para en Ciencia ea Tecnologia, Programa Operacional Ciencia e Inovação 2010 (POCI 2010) gjør Quadro Comunitario de Apoio III «og prosjektstøtte no. PTDC /CVT /117610/2010. RB (SFRH /BPD /68276/2010) og CG (SFRH /BPD /96510/2013) anerkjenner den portugisiske Foundation for Science and Technology. Institute of Molecular Pathology og immunologi er en Associate Laboratory av den portugisiske Ministry of Science, Technology and Higher Education og er delvis støttet av den portugisiske Foundation for Science and Technology
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Kreft er fortsatt en stor sosial og økonomisk byrde i den vestlige verden. Faktisk, til tross alle anstrengelser for å redusere slik lidelse, antall pasienter har økt eksponentielt de siste årene. Brystkreft er i særdeleshet den vanligste kreftformen hos kvinner, og den hyppigste årsaken til kreft-relaterte dødsfall, hovedsakelig på grunn av utviklingen av fjernmetastaser [1].
De som er involvert i etableringen av kreft kolonier i mekanismer fjerntliggende organer er langt fra å være forstått, så er de faktiske årsaker som fører til metastase-relaterte dødsfall. Dermed identifisere og undersøke for tiden klinisk brukte legemidler som kan ha betydning for tumorprogresjon er obligatorisk [2]. For eksempel ved å forstyrre med mange celle trasé som er felles eller lignende mellom patogener og verter, stoffer som rapamycin og niclosamide (som opprinnelig ble brukt som soppdrepende og antihelminitiske narkotika henholdsvis) har vist seg å være lovende legemidler mot kreft [3, 4] .
Oseltamivirfosfat er en anti-influensa stoff som har blitt mye brukt som forebyggende behandling siden den tiden av H1N1 pandemier [5]. Det administreres som prodruget oseltamivirfosfat, som omdannes ved hjelp av karboksylesterase enzymer inn i den aktive oseltamivirkarboksylat. Oseltamivirfosfat er en sialinsyre analog som samvirker med og blokkerer de aktive områder av sialidase enzymer fra influensavirus, det binder seg til virusenzymer blokkere deres evne til å spalte sialsyreresiduer på overflaten av den infiserte celle som resulterer i en manglende evne å frigjøre avkom viruspartikler [6].
Noen forslag har tidligere blitt gjort om potensielt relevante farmakologiske effekten av denne og andre hemmere av virus sialidases brukes i klinikkene, i menneskelige endogene sialidases [7]. Mens lave nanomolare konsentrasjoner av oseltamivirkarboksylat er tilstrekkelig til å blokkere aktiviteten av virale sialidases, dette stoffet viste nesten ingen merkbar inhibering av menneskelige sialidases [7, 8]. Likevel ble motstridende resultater når oseltamivirfosfat ble testet i kreftceller ved hjelp av både
in vitro Hotell og
in vivo
modeller [9, 10]. Faktisk noen observasjoner påpekt en mulig hemmende effekt av oseltamivir fosfat på endogene sialidases av rotter og mus [11-14]. I den senere tid ble det foreslått at oseltamivirfosfat hadde evnen til å reversere den epiteliale til mesenchymal (EMT) overgangsprosessen og øke medikamentsensitivitet av kjemoresistent humane kreftceller [10].
sialylert glykaner er epidemiologisk forbundet med dårligere prognose i forskjellige typer kreft, inkludert brystkreft [15]. Sialinsyrer er sure monosakkarider som vanligvis finnes i den terminale posisjonen av karbohydratkjeder som er tilstede i glykoproteiner og glykolipider [16]. Gjennom komplekse interaksjoner med selektiner og siglecs blant andre molekyler, sialinsyrer er fysiologisk til stede i forskjellige typer av celle-celle interaksjoner. Sialinsyrer øke styrken av ladningstetthet på hele glykankjeden, på grunn av tilstedeværelsen av deres karboksylsyregruppen, knytte på endringer i glykaner «adhesjonsegenskaper [17]. Sialinsyrer overføres fra en donor substratet til en glykan struktur til stede på et gitt glykokonjugat av sialyltransferaser [18, 19]. På den annen side er deres fjerning fra sukkerkjedene katalysert av sialidases. Aktiviteten av disse enzymene er antatt å påvirke konformasjonen til glykoproteiner, og dermed bidra til enten øket gjenkjennelse eller maskering av biologisk relevante steder i molekyler og celler [20].
Økningen av sialylert Lewis-type blodtype antigener slik som sialyl Lewis X (SLE (x)) og små avkortede glykaner som sialyl Tn (STN) er blant de mest vanlige sukker forandringer i kreftceller [21-24]. Flere funksjonelle analyser hvori sialyserte glykaner er vist å spille en rolle i økt migrering og invasjon både
in vitro
og
in vivo
er funnet i litteraturen [19, 24]. På den annen side, tukling med sialylering
in vitro
har også vist seg t iblant reduserer invasiv kapasiteten av kreftceller [25]. Som et resultat, har modulering av sialyserte glykaner blitt argumentert som en antatt mål for neo-adjuvant behandling i kreft [26]. Men på grunn av det store omfanget og kompleksiteten av sialyltransferaser og alle andre glycosyltransferases involvert i sialylering prosessen, er det velkjent vanskeligheter med å snu sialinsyrer til klinisk relevante terapeutiske mål [27, 28]. Men selv om det er mer enn 20 kjente forskjellige sialyltransferaser, er det bare fire er identifisert og karakterisert hos pattedyr sialidases [20]. Interessant, alle fire kjente pattedyr sialidases er homologe til de av virus inneholdende, i noen tilfeller, rester som er identiske med de som finnes i det aktive enzymatiske området [29].
Det er således et stort behov for å studere neoplastiske kontekster i som oseltamivirfosfat kunne hemmer kompetitivt pattedyr sialidases [30]. Ulike utfall er sannsynlig å oppstå og kan avhenge av målet for hemming nåtid og rekke berørte glycoconjugates [20]. I dette arbeidet har vi studert effekten av sialidase hemming som en modulator av sialysering relaterte mekanismer for invasjonen i bryst celle svulster ved hjelp av både
in vitro Hotell og
in vivo
tilnærminger.
Materiale og metode
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og kulturforhold
for å kunne vurdere eventuelle forskjeller av oseltamivir fosfat behandling i godartede og ondartede cellelinjer ble to brystcellelinjer brukt i denne studien: en adenom-avledet cellelinje (CMA07-etablert ved vårt laboratorium fra et spontant forekommende canine kompleks adenom utskåret fra et seks år gammel kvinne hund for kurative formål med eiere samtykke [31]), og en karsinom-avledet cellelinje (CMT-U27 – svært metastatisk canine karsinom cellelinje, vennlig levert av professor Eva Héllmen, fra Sverige [32]). De to cellelinjer ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 inkubator (Thermo Scientific) og holdt i RPMI 1640 medium med Glutamax og 25 mM Hepes (Gibco Life Technologies) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco Life Technologies) og 1% penicillin streptomycin (P /S) (Gibco Life Technologies).
sialidase aktivitetsanalyse
Høyere forventes sialysering nivåer i ondartede celler sammenlignet med godartet kolleger. Dette er like sannsynlig å være avhengig av aktiviteten både sialyltranferases og på sialidase [17]. For å evaluere effekten av oseltamivirfosfat på aktiviteten av sialidases, en
in vitro
assay ved å bruke en modifisert sialinsyre (4-metyl-umbelliferyl-Nacetylneuraminic syre-4-Muñana), ble utført ved hjelp CMA07 og CMT- U27 canine brysttumorceller. Sialidase-aktivitet ble bestemt ved å skaffe den metabolske omdannelse av sialinsyre analog, 4-Muñana, inn i det fluorescerende forbindelse metyl-umbelliferon (blå farge), ved behandling med forskjellige doser av oseltamivirfosfat. Celler ble dyrket i 12 mm sirkulære glass til konfluens og deretter inkubert i 24 timer med medium inneholdende forskjellige oseltamivirfosfat konsentrasjoner (0,305 uM, 3,05 uM, 30,5 uM og 305 uM oseltamivirfosfat oppløst i PBS), og den kjøretøy av medikamentet (PBS ) ble anvendt som kontroll. Etter 24 timers behandling, ble hver 12 mm sirkulære glass plasseres på et lysbilde, og inkuberes i en 2 um 4-Muñana (2 «- (4-Methylumbelliferyl) -α-DN-acetylneuraminsyre) (Sigma, St. Louis, USA) oppløsningen . Objektglassene ble straks observert med epi-fluorescerende mikroskopi under UV-lys (eksitasjonsbølgelengde på 360 nm og emisjonsbølgelengden ved 440 nm), som er tidligere beskrevet [33]. Slides ble analysert og bildene ble tatt med en Carl Zeiss fluorescerende mikroskop (Carl Zeiss Mikroskopi).
Cell morfologi analyse
CMA07 og CMT-U27 celler ble sådd ut i en tetthet på 1×10
4 celler per brønn i 6-brønns plater, in triplo. Tre forskjellige oseltamivirfosfat konsentrasjoner ble undersøkt: 0,305 pM, 3,05 pM og 30,5 pM, og PBS ble anvendt som kontroll. Analyse av celle konfluens og morfologi ble utført ved anvendelse av et invertert mikroskop kontrast i løpet av en periode på 7 dager. Bildene ble tatt på dag 0 og 7 i henhold til 200x forstørrelse
Celleproliferering analysen
CMA07 og CMT-U27-celler ble dyrket i 24-brønners plater i tre eksemplarer for hver tilstand. 0,305 mikrometer, 3.05 uM, 30,5 uM og 305 uM oseltamivirfosfat og PBS ble anvendt som kontroll. Celler ble talt hver eneste dag i 7 dager i et Neubauer kammer i et 1: 2 fortynning av cellene i 0,4% trypanblått og celletall ble gjort ved hjelp av volumomregningsfaktor for en mm3, som er 1×10
4. Denne analysen ble gjentatt 3 ganger og vekstkurver ble sporet.
Cell vekstanalyse
Cellevekst ble bestemt i CMA07 og CMT-U27 cellelinjer ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig kit CellTiter 96 vandige løsning reagent (Promega Corporation), og utført i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble cellene sådd ut i 96-brønners plater i triplikat (Orange Scientific), ved en densitet på 5×10
3-celler per brønn. Etter cellebinding, ble oseltamivirfosfat tilsatt ved 0,305 uM, 3,05 uM, 30,5 uM og 305 uM sluttkonsentrasjon, og PBS ble anvendt som kontroll. Cellenes stoffskifte ble målt ved å legge MTS tetrazolium reagent og absorbans ble registrert ved 490 nm. Målinger ble utført ved 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24 og 48 timer. En ytterligere kontrollmåling ble utført ved tids-punkt 0h, i en kultur brønn uten celler. Eksperimentene ble utført to ganger.
TUNEL assay
CMA07 og CMT-U27 cellelinjer ble dyrket i 6-brønns plater og deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner av oseltamivirfosfat (0,305 uM, 3,05 uM, 30,5 uM og 305 uM, og PBS ble anvendt som kontroll). Etter 24 timers behandling, kulturmedium og tripsinized celler ble oppsamlet og sentrifugert i 10 minutter ved 2000 rpm. Cellene ble vasket i PBS og fiksert i kald metanol i 20 minutter. Etter fiksering ble cellene ressuspended i 1 ml PBS for cytospin prosedyre. Kort fortalt ble 100 mL av cellesuspensjon sentrifugert i en cytospin3 sentrifuge hjelp polilysine belagt lysbilder. Slides ble deretter brukt for
in situ
celledød deteksjon ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig kit (
In situ
celledød deteksjon kit, fluorescein fra Roche) basert på merking DNA-dobbelttrådbrudd (TUNEL teknologi) , i henhold til produsentens instruksjoner. Objektglassene ble observert under et fluorescens mikroskop ved anvendelse av en 488nm eksitasjonsbølgelengden og prosentandelen av døde celler ble beregnet ved å registrere positive TUNEL-celler i forhold til total celler ved hjelp av ImageJ programvare. Denne analysen ble utført to ganger.
sårhelende
sårhelende analysen ble utført ved hjelp av en godartet (CMA07) og en svært metastatisk (CMT-U27) canine brysttumorcellelinje i en time-lapse mikroskop. Kort sagt ble 20×10
4-celler sådd ut på en 24-brønners dyrkingsplate og etter å ha nådd høy konfluens en kunstig «sår» ble laget med en pipettespiss. Kulturmediet ble erstattet med de forskjellige oseltamivirfosfat konsentrasjoner: 0,305 pM, 3,05 pM og 30,5 pM oseltamivirfosfat og PBS som kontroll. Sår image oppkjøpet ble gjort med 5 minutters mellomrom i 48 timer, ved hjelp av programmet Axio Vision versjonen 4.8.2. og konvertert i video. Behandling av celler med 305 pM oseltamivirfosfat ble ikke utført på grunn av sin tidligere vist cytotoksisitet. Denne analysen ble utført to ganger.
Matrigel Invasion Assay
A matrigel invasjon analyse ble utført for å evaluere den invasive kapasitet av CMT-U27-celler, er en god modell for å studere celle invasjon [34]. Matrigel innsatsene ble re-hydratisert med RPMI 1640 i 1 time ved 37 ° C i en fuktet 5% CO2-inkubator (Thermo Scientific). Mediebetingelsene var de samme i de øvre og de nedre brønnene (RPMI 1640 medium supplementert med 10% FBS og 1% penicillin og streptimicin).
Når innsatsen rehydratisering, 1×10
5 celler ble sådd på Matrigel-belagte kamre i nærvær av forskjellige oseltamivirfosfat konsentrasjoner (0,305 uM, 3,05 uM, 30,5 uM oseltamivirfosfat) og PBS som kontroll, og opprettholdt i kultur i ytterligere 6 timer (tidligere optimalisert tidspunkt for invasjon analyser ved anvendelse av denne cellelinjen ). Stoffet ble anvendt i toppen brønnene. Etter inkubering, ble innholdet i hver innsatsen fjernet og vasket to ganger med PBS for å fjerne ikke-invaderende celler. Invasive celler ble fiksert med kald metanol i 20 minutter, ble inserts overført til lysbilder (Industrial kvalitet) og montert med Vectashield montering medium med DAPI (Vector Laboratories). Invaderende celler ble registrert ved telling av antall celler som er tilstede i innsatsen. Disse eksperimentene ble utført 3 ganger.
Fluorescerende cytochemistry
Cellene ble dyrket på dekkglass, og kulturmediet ble supplert med 0,305 pM, 3,05 pM og 30,5 pM oseltamivirfosfat og PBS som kontroll, til 24 timer. Cellene ble deretter vasket med PBS og fiksert med kald metanol i 20 minutter. Etter fiksering ble cellene rehydreres med PBS og blokkert med 10% BSA i 20 minutter. Plant lektiner SNA (Biotinylated hyllebær bark lektin, B-1305, Vector Laboratories), MAL I (Biotinylated Maackia amurensis lektin I, B-1315, Vector Laboratories), og MAL II (Biotinylated Maackia amurensis lektin II, B-1265, Vector Laboratories ) ble fortynnet 1: 300 i 5% BSA i PBS og inkubert på objektglass i 1 time ved romtemperatur. Objektglassene ble deretter vasket tre ganger med PBS og inkubert i 1 time med streptavidin-FITC. Etter to vaskinger med PBS, ble objektglass inkubert i 10 minutter med DAPI (Sigma-Aldrich) i PBS, og objektglass ble montert i Vectashield monteringsmedium (Vector Laboratories) for fluorescens-analyse. Slides ble analysert og bildene ble tatt i en Carl Zeiss fluorescerende mikroskop (Carl Zeiss Mikroskopi).
Western Blot analyse
Celler fra CMA07 og CMT-U27 cellelinjer ble dyrket til konfluens i seks godt -plater og forskjellige konsentrasjoner av oseltamivirfosfat ble tilsatt til mediet (0,305 pM, 3,05 pM og 30,5 pM oseltamivirfosfat). Etter 24 timers inkubering ble cellene vasket tre ganger med PBS og lysert ved hjelp av RIPA-lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% natrium desoxicolate; 0,1% SDS ) inneholdende komp protease inhibitor cocktail (Roche), 1 mM PMSF (fenylmetylsulfonylfluorid), og 1 mM Na
3VO
4 (natriumortovanadat). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av biocinchoninic syremetoden fra Pierce BCA Protein Assay Kit (Pierce /Thermo Scientific), i henhold til produsentens instruksjoner.
De totale proteinekstrakter ble løst i 10% SDS-PAGE, overført til en nitrocellulosemembran (Amersham Biosciences /GE Healthcare og biovitenskap) og inkubert med ulike biotinylatedlectins: MAL I (B-1315, Vector Laboratories), MAL II (B-1265, Vector Laboratories) og SNA (B-1305, Vector Laboratories) fortynnet 1 : 500 i 5% BSA (Sigma-Aldrich) i PBS med 0,05% Tween-20 (Sigma-Aldrich, USA). Etter vasking med PBS 0,05% Tween-20, ble membranene inkubert med avidin-biotin-peroksidasekompleks kit (Vectastain ABC kit, Vector Laboratories Standard) i 1 time ved romtemperatur. For SLE (x) og STN-analyse, ble membranene inkubert med monoklonale antistoffer fra mus, KM93 (Millipore) fortynnet 1: 500 og TKH2 (forsiktig tilbys av Dr. H. Clausen fra Danmark), fulgt av inkubering med et HRP-konjugert anti-mus sekundært antistoff i 1 time. Analysen ble utført ved hjelp av kjemiluminescens ECL Western blotting deteksjonsreagensen og filmer (begge fra GE Healthcare). Western blot for aktin fortynnet 1: 4000 (Santa Cruz Biotechnology) ble anvendt som kontroll lasting
2D-elektroforese
Forskjeller i de enkelte proteiner er vanskelig å visualisere ved hjelp av standard Western Blot analyse.. Prøver å overvinne dette, har vi utført en 2D gels analyse som bedre diskriminerer protein glycoforms i proteinekstrakter. Proteinprøver fra CMA07 og CMT-U27-celler behandlet med 3,05 uM av oseltamivor og PBS-behandlede kontrollceller ble utfelt (ProteoExtract, Calbiochem) og resuspendert i rehydratisering buffer (7 M urea, 2M Thiourea, 4% volum /volum) CHAPS (og 0,0002 % bromfenol blå) med 0,2% av amfolytt og kvantifisert (2D Quant Kit fra GE Healthcare). Passiv rehydrering av strimlene ble utført over natten med 200 ug av det totale proteiner ved anvendelse IPG strimler av pH 3-10 NL (ReadyStrip; 0,5 x 3 x70 mm, Bio-Rad, Hercules) ved romtemperatur. Isoelektrisk fokusering ble utført på Protean IEF celle (Bio-Rad) med en initial spenning på 250 V i 15 minutter, og deretter ved å påtrykke en spenning gradient opp til 4000V med begrensende strøm på 50 uA pr strimmel og temperaturen settes til 20 ° C. Den første dimensjonen ble avsluttet ved 14-20 KVH.
Etter isoelektrisk fokusering proteinene ble redusert og alkylert ved inkubasjon med 2% DL-ditiotreitol (DTT) etterfulgt av 2,5% Iodacetamid i en ekvilibreringsbuffer (6M Urea, 2% SDS, 0,002% bromfenolblått, 75 mm Tris pH 8,8, 29,3% glycerol) i 10 minutter hver under forsiktig omrøring. Strimlene ble deretter pakket i en 1% lavtgele (1% agarose i rennende buffer-25 mM Tris, 192 mM glysin, og 0,1% (vekt /volum) SDS, pH 8,3; Bio-Rad) på toppen av en 10% akrylamid gel (akrylamid /bisakrylamid 37,5: 1, 2,6% fra Bio-Rad). Andre dimensjon elektroforese ble utført i en Mini-Protean tetra cellesystem (Bio-Rad) ved hjelp av 1xTris /Glycine /SDS-buffer ved konstant spenning på 125 V. Western blot-analyse ved hjelp av SNA lectin ble utført som beskrevet i det foregående avsnitt.
dyreforsøk
dyreforsøk ble utført i samsvar med de europeiske retningslinjene for omsorg og bruk av forsøksdyr, direktiv 2010/63 /EU og nasjonal regulering publisert i 2013 (Decreto-Lei n. ° 113/2013 de 7 de Agosto). N: NIH (S) II-nu /nu nakne mus ble plassert, oppfôret og opprettholdt på Ipatimup Animal House, i et patogen-fritt miljø under kontrollerte forhold av lys og fuktighet. Følgende Humane endepunkter ble etablert: noen signaler om ubehag, lidelse eller smerte, vekttap større enn 20-25% av kroppsmassen, anoreksi og døende tilstand, relatert eller ikke til den eksperimentelle prosedyren
Experimental. mus grupper og medikamentell behandling
Kvinne NIH (S) II-nu /nu nakne mus, i alderen 4-6 uker, ble orthotopically inokulert med 1 x 106 levedyktige CMT-U27 canine brystkreft celler i melkefettpute ved anvendelse av en 25 gauge nål. En total på 8 mus ble inokulert. Når knuter nådde et volum på ca. 500mm3, mus (n = 8) ble randomisert og oppdelt i kontrollgruppen (n = 4) og behandlingsgruppen (n = 4) .Den mottok dyrene intraperitonealt (IP) dailly enten 100 ul PBS ( kontrollgruppe) eller 100 mg /kg Oseltamivirfosfat (Tamiflu Roche) kjøpt fra apoteket, fortynnet i PBS (behandlingsgruppen) til dødstidspunktet. Tumorstørrelse ble målt ved hjelp av målepunktene, og tumorvolum (mm3) ble beregnet ved bredde x lengde x høyde. Å observere metastization, ble primære svulster i alle mus fjernes kirurgisk når en gjennomsnittlig volum på ~ 1000-1500mm3 ble nådd. Mus ble bedøvd ved IP-administrering av 100 pl av en blanding inneholdende 50 mg /kg Ketamin (IMALGENE 1000) og 1 mg /kg av medetomidin hydroklorid (Medetor) og tumoren ble skåret ut. Vi brukte 2,5 mg /kg av atipamezol (Revertor) per mus for å motvirke effekten av anestesi. Mus ble behandlet med en oral oppløsning av 10 mg /kg av tramadol chloridrate (Tramal) hver 8h for 24-48h for å forebygge smerte. Dyrene ble fulgt opp etter kirurgisk fjerning av primærtumor for invasjon og /eller metastization tegn.
Alle mus ble avlivet i henhold til de etablerte Humane endepunkter og obdusert. Vev ble fiksert i 10% bufret formalin, behandlet og innstøpt i parafin. Tre mikrometer seksjoner ble kuttet og farget med hematoksylin eosin (HE) for videre histopatologiske og immunhistokjemisk analyse. Histopatologisk evaluering av primære tumorer og metastaser respektive samt betennelse vurdering (telling av antallet av inflammatoriske infiltrater til stede i hele xenograft) ble utført uavhengig ved hjelp av to patologer.
histokjemi med lektiner og immunhistokjemi
uttrykket av sialyserte strukturer i CMT-U27 xenograft av mus behandlet med oseltamivir og kontroller ble utført ved hjelp av plante lektiner SNA, MAL i og MAL II.
Lysbilder ble deparaffinized og utvannet etterfulgt av antigen utvinning med kokende 0005% Extran 8 minutter. Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert med 10% H2O2 i metanol-løsning i 10 minutter, og objektglass ble blokkert med 10% BSA i PBS (pH 7,4) i 30 minutter.
Deretter ble tumorsnitt inkubert i 2 timer ved romtemperatur med det biotinylerte SNA, MAL i og II MAL (Vector Laboratories.), fortynnet til 1: 250, 1: 250 og 1: 150 henholdsvis 5% BSA i PBS. Objektglassene ble deretter vasket i PBS, inkubert med avidin-biotin-peroksidasekompleks (ABC) i 30 minutter og utviklet med diaminobenzidin tetrahydroxychloride substrat, DAB (SIGMA FAST). For immunhistokjemi ble snittene inkubert over natten ved værelsetemperatur med de primære antistoffer anti-Ki67-monoklonalt antistoff (MIB1 klone, Dako), anti-caspase-3 (5A1E klone, Cell Signalling), og anti-SLE (x) (KM93, Millipore ) på 1:50, 1: 100 og 1: 200 henholdsvis 5% BSA i PBS. Objektglassene ble deretter vasket i PBS, inkubert med Novolink Max Polymer Detection System (1250 testikler), Novocastra, (Newcastle, UK) i 30 minutter ved romtemperatur og utviklet anvende DAB av det samme settet i 5 minutter.
Glassene ble deretter kontra med hematoxylin, dehydrert, og montert med Histomount (National Diagnostics). Negative kontroller, uten lektiner eller antistoffer, ble inkludert. Alle fargede seksjoner ble undersøkt med lysmikroskopi og gjennomgått av tre observatører (de Oliveira J .; Ribeiro, C .; og Gartner, F.).
Statistisk analyse
Når det er hensiktsmessig, resultatene er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. Statistisk analyse ble utført ved anvendelse One Way ANOVA (analyse av varians) test. For MTS, celleproliferasjon og celle-vekstmålinger multiple sammenligninger ble anvendt Dunnett-metoden. Student t-test ble utført for å evaluere den til sårheling analyseresultatene. Multiple sammenligninger Tukey test ble benyttet for å studere celle matrigel invasjon assay og multiple sammenligninger Bonferroni-test ble anvendt for Tunel analyse analyse. GraphPad Prism 5.02 versjonen ble brukt til å utføre disse statistisk analyse.
Imunohistochemical bilder av Ki-67 og caspase-3 uttrykk ble analysert ved hjelp av verktøy de ImmunoRatio online analyse, under høy effekt forstørrelse i hvert område [35] . Tumor saker ble delt inn i 3 kategorier etter Ki67 poengsum: mindre enn 10% Ki67 positive celler (lave), 10 til 50% Ki67 positive celler (moderat) og mer enn 50% Ki67 positive celler (høy). For å evaluere caspase 3 og SLE
x uttrykk, ble svulster gruppert etter hvor stor prosentandel av immunreaktive celler i hele lesjon, inn i 3 klasser: 0% (negativ); mindre enn 5% (sjelden celler), eller 6-10% (lav). Når det gjelder SNA og MAA jeg uttrykk, en semi-kvantitativ analyse i hvilken prøvene ble bedømt i henhold til prosentandelen av positive celler. Svulster ble gruppert i: mindre enn 25% (lav); 25 til 50% (moderat) og mer enn 50% (høy). Da foreningen hypoteser ble testet ved hjelp av Chi-kvadrat test for diskrete variabler. SPSS (versjon 22.0) ble brukt for statistisk analyse.
Resultater
Influence of oseltamivirfosfat opptak av CMA07 og CMT-U27 celler på endogen sialidase aktivitet
in vitro
Oseltamivirfosfat behandling svekket sialidase aktivitet (neuraminsyre hydrolyse), som vist ved en reduksjon av metyl-umbelliferon fluorescens i begge cellelinjer (Fig 1). I tillegg vil en reduksjon av sialidase aktivitet ble stadig mer tydelig i høyere oseltamivirfosfat konsentrasjoner.
CMA07 og CMT-U27-celler ble behandlet i 24 timer med forskjellige konsentrasjoner av oseltamivirfosfat (0,305 uM, 3,05 uM, 30,5 uM og 305 uM) eller PBS som kontroll, og inkubert med et 2 uM 4-Munana løsning. Lysbilder ble umiddelbart observert under en epi-fluorescerende mikroskop med UV-lys. Begge cellelinjer viste redusert sialidase-aktivitet, påvist ved den fluorescerende metyl-umbelliferon, som resulterer fra metabolsk omdannelse av 4-Muñana.
Effekt av oseltamivirfosfat behandling i CMA07 og CMT-U27-celler morfologi, levedyktighet og programmert celledød
for å evaluere effekten av ulike doser av oseltamivirfosfat på celle morfologi, levedyktighet og programmert celledød,
in vitro
analysene nedenfor ble utført.
Små endringer i cellen morfologi ble observert i CMA07 celler behandlet med oseltamivir fosfat. Ingen store endringer i CMT-U27 celle morfologi ble observert (S1 figur).
Statistisk analyse viste ingen signifikante forskjeller i vekst på både CMA07 (
p
= 0,6209) og CMT-U27 (
p
= 0,9929) cellelinjer, ved behandling med oseltamivir fosfat (2A). For ytterligere å evaluere effekten av behandling på oseltamivir CMA07 og CMT-U27 celleviabilitet, MTS-kolorimetrisk analyse, som bestemmer cellulær metabolsk aktivitet, ble utført i 48 timer. Den metabolske aktivitet av CMA07 og CMT-U27 cellelinjer ble signifikant redusert med 305 mikrometer oseltamivirfosfat behandling (
p
= 0,005 og p 0,0001 henholdsvis) ved hjelp av én måte ANOVA testiklene (variansanalyse). I kontrast, ingen statistisk signifikante endringer ble observert med 0,305 mikrometer (p = 0,9781), 3,05 mikrometer (
p
= 0,7436) og 30,5 mikrometer (
p
= 0,9623) av Oseltamivirfosfat behandlinger når sammenlignet med kontrollceller (figur 2B). Til slutt, for å vurdere effekten av oseltamivirfosfat på CMA07 og CMT-U27 programmert celledød, og gitt at 305 uM oseltamivirfosfat behandling svekket celle metabolsk aktivitet, ble en programmert celledød målingen utført med TUNEL-analysen. Tjuefire timers oseltamivirfosfat behandling, spesielt på 305 mikrometer, betydelig økt CMA07 (
p
= 0,0010) og CMT-U27 (
p =
0,0002) DNA fragmentering, noe som tyder på fremming av programmert celle død, sammenlignet med lavere konsentrasjoner oseltamivirgruppene, eller med PBS (figur 2C øvre og nedre paneler).
celle~~POS=TRUNC vekst~~POS=HEADCOMP vurderes med Trypan blått (A) eller med MTS-analyse (B) og programmert celledød (C ) ble evaluert i CMA07 og CMT-U27-celler etter behandling med oseltamivirfosfat (0,305 uM, 3,05 uM, 30,5 uM og 305 uM) eller PBS som kontroll. (A) celler ble dyrket i nærvær av forskjellige konsentrasjoner oseltamivirfosfat, og cellevekst ble overvåket i 7 dager ved telling av antallet levedyktige celler daglig. Ingen signifikante forskjeller i vekstrater behandlede celler ble bekreftet når sammenlignet med ikke-behandlede celler, bortsett fra en redusert vekst i CMA-celler etter 4 dager med 305 pM oseltamivirfosfat behandling. (B) celler ble dyrket i nærvær av de forskjellige oseltamivirfosfat konsentrasjoner, og celle metabolsk aktivitet ble ytterligere overvåket ved hjelp av en MTS-analyse, i et tidsforløp måte i 48 timer. CMA07 og CMT-U27-celler som ble behandlet med 305 uM oseltamivirfosfat viste en signifikant reduksjon i deres metabolske aktivitet (***
p
0,001), men ingen endringer ble verifisert med de lavere konsentrasjoner. (C) CMA07 og CMT-U27 ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Oseltamivirs i 24 timer. Celler behandlet med 305 mikrometer oseltamivirfosfat viste også statistisk signifikant økning i programmert celledød (***
p
0,001) etter 24 timer med oseltamivir fosfat behandling, men ingen endringer ble verifisert med lavere konsentrasjoner (grafer
