Abstract
Bakgrunn
Normal celledeling koordineres av en bipolar mitotisk spindel sikrer symmetrisk segregering av kromosomer. Kreftceller, men tidvis dele inn i tre eller flere retninger. Slike multipolar mitoser har vært foreslått å generere genetisk mangfold og dermed bidra til klonal evolusjon. Imidlertid har dette begrepet blitt litt validert eksperimentelt.
hovedfunnene
kromosom segregering og DNA-innhold i dattercellene fra multipolar mitoser ble vurdert av multiphoton korset seksjonering og fluorescens in situ hybridisering i kreftceller og ikke-neoplastiske transformerte celler. DNA-fordeling som følge av multipolar celledeling ble funnet å være svært variabel, med hyppige nullisomies i datterceller. Time-lapse avbildning av H2B /GFP-merket multipolar mitoser avslørte at tiden fra oppstart av metafase til begynnelsen av anaphase ble forlenget og at metafase plater ofte byttet polaritet flere ganger før meta-anaphase overgang. Den multipolare metafase-anaphase overgang ble ledsaget av en normal reduksjon av cellulær cyklin B nivåer, men vanligvis forekommet før fullførelse av den normale separase aktivitet syklus. Centromeric AURKB og MAD2 foci ble observert ofte for å forbli på sentromerer av multipolar ana-telophase kromosomer, noe som indikerer at multipolar mitoser var i stand til å omgå spindelenheten sjekkpunkt med noen søsterkromatider rester unseparated etter anaphase. Følgelig ledelsen med fordeling av individuelle kromosomer i multipolar datter kjerner avdekket en høy frekvens av nondisjunction hendelser, noe som resulterer i en nær-binomisk tildeling av søsterkromatider til dattercellene.
Konklusjon
Muligheten av multipolar mitoser å omgå spindelenheten sjekkpunktet system vanligvis resulterer i en nær tilfeldig fordeling av kromosomer til datterceller. Spindel multipolaritet kunne dermed være en svært effektiv generator av genetisk ulike minoritets kloner i transformerte cellepopulasjoner
Citation. Gisselsson D, Håkanson U, Stoller P, Marti D, Jin Y, Rosengren AH, et al. (2008) Når Genome Spiller Dice: Omgåelse av spindelenheten Checkpoint og Near-Random Kromosom Segregering i multipolar Cancer Cell mitoser. PLoS ONE 3 (4): e1871. doi: 10,1371 /journal.pone.0001871
Redaktør: Cayetano Gonzalez, forskning biomedisin, Spania
mottatt: 22 oktober 2007; Godkjent: 22 februar 2008; Publisert: 02.04.2008
Copyright: © 2008 Gisselsson et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av den svenske Barnas Cancer Foundation, den svenske Kreftforeningen, Vetenskapsrådet, Swedish Medical Society, den sveitsiske National Science Foundation (Grant 3152A0-100431), Lund universitetssykehus gavemidlene, Gunnar Nilsson Cancer Foundation, medisinsk fakultet Universitetet i Lund, den Crafoord Foundation, Erik-Philip Sörensen Foundation, den Lundgren Foundation, og Swärd Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i gjennomføringen av studien, eller i innsamling, analyse, tolkning av data, eller i forberedelse, vurdering, eller godkjenning av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
i normale celler, mitotisk celledeling oppstår vanligvis i en bipolar mote, noe som resulterer i to datterceller med identiske atom genomer. Denne begrensede polaritet er basert på stram kontroll med sentrosomen syklusen slik at ikke mer enn to centrosomes er aktive samtidig i løpet av mitose [1], [2]. Men i kreftceller, kan en overdreven antall centrosomes gi opphav til overtallige spindel stolper som kan organisere en multipolar mitose (MM), hvor kromosomet komplement er trukket inn i tre eller flere retninger anaphase [3], [4]. Siden de første observasjonene av MM i karsinomer av Hansemann i 1890 [5] multipolar spindler og centrosomal misdannelser er rapportert i de vanligste kreftformene [6] – [8]. Noen studier har også indikert at MM kan være en sterk markør for ugunstig prognose i tumorsykdom [9] – [11]. Videre forstyrrelser i sentrosomen nummer og struktur har vært knyttet til forstyrret funksjon av flere cellesyklus signalveier, slik som inaktivering av TP53-, RB1- [12], [13], BRCA1- [14], [15], BRCA2 – [16], og CDKN1A-proteiner [17], så vel som AURKA over-uttrykket [18]. Gjennom CCNE og PLK4 har centrosomal forstyrrelser også vært knyttet til eksponering for viruskreftfremkallende, særlig høy risiko papilloma virus [19], [20].
Med tanke på omfattende tilgjengelig informasjon om de molekylære endringer forårsaker spindel multipolaritet i kreftceller, har overraskende lite eksperimentelle data er presentert på konsekvensene av spindel multipolaritet i transformerte humane celler. Tidligere studier har vært begrenset til
in vitro
modeller av ikke-neoplastiske celler fra Vole, mink, okse, og Rhesus ape der polyploidized celler kommet gjennom multipolar celledeling [21] – [24]. I disse modellene søsterkromatider vanligvis segregert gjennom MM i haploide settene, noe som resulterer i euploid kromosomtall i dattercellene. Dette euploid segregering mønsteret har dannet grunnlaget for diskusjoner om rollen til MM i humane tumorer [25]. Vi viser nå at kromosom segregering i MM i humane aneuploide forvandlet celler sjelden, om noensinne, fører til segregering i forhold forventes fra prinsippene om euploid segregering. Snarere en kombinasjon av en samlet asymmetrisk DNA distribusjon og omgåelse av spindelenheten sjekkpunkt resulterer i en nesten tilfeldig omstokking av kromosomet komplement.
Resultater
Experimental oppsett
prinsippene for den euploid segregering modellen innebærer at en mekanisme eksisterer som strengt regulerer bevegelse av en haploid sett av kromosomer til datterceller ved mitose [24]. Ekstrapolering av denne teorien til de vanligvis aneuploide Karyotyper observert i kreftceller betyr at hvert sett av homologe kromosomer segregerer som om den totale kromosomantall ville være i stand til å dele inn i forskjellige hel-tallforhold. Således vil i det minste en kopi av hvert kromosom være til stede i hver dattercelle, med unntak av kjønnskromosomer. I et celledelingen med to kopier av en viss kromosom (disomic) dele i tre retninger (Tripolar), ville dette antyde en segregering mønster gjennom hvilke to datter kromosomer segregert til en av dattercellene, mens en datter kromosom segregert til hver av andre to datterceller (
dvs.
en 2-1-1 segregering). De andre mulige disomic /Tripolar segregeringsmønstre (4-0-0, 3-1-0 og 2-2-0) ville alle resultat i minst ett nullisomic datter celle og vil derfor ikke være i samsvar med segregering i haploide settene.
for å teste om segregeringsmønstre enkelte kromosomer på menneskelige multipolar celledeldannet prinsippene for euploid segregering, brukte vi to godt studert kreftcellelinjer som mitotisk multipolaritet har blitt assosiert med kromosom ustabilitet (CIN),
dvs.
WiT49 fra en anaplastisk Wilms tumor med 7% MM [10], [26] og SW480 fra en kolorektal karsinom med 4% MM [27], [28]. For å kunne sammenligne kreftcellelinjer av ikke-neoplastiske immortaliserte celler, vi også inkludert adenovirus-transformerte humane embryo-cellelinje HEK293 med en kompleks karyotype og 1% MM [29]. I disse cellelinjene, kryss-merking av DNA og spindel poler av beta-tubulin-antistoffer viste at det store flertall av multipolar celledelinger var enten veis eller tetrapolar, mens 10% av MM hadde en høyere polaritet nummer (figur 1A-D ). I hver cellelinje, de sentromerer av to kromosomer som hadde viste liten intercellulære strukturell heterogenitet [10], [28] ble merket ved fluorescens in situ hybridisering (FISH): kromosomer 12 og 17 i WiT49, X og 18 i SW480, og tre og 4 i henholdsvis HEK293,. Dette valget ble gjort for å minimere confounding fra anaphase bridging og andre mitotiske abnormiteter i hovedsak fører til unormalt i kromosom struktur. Vi deretter screenet for fordelingen av disse kromosomene ved anaphase i bipolar mitose og MM.
Et kromosom 12 spesifikke alpha-satellitt probe (grønn) kombinert med immunfluorescens for beta tubulin (rød) og DNA-kontra av DAPI ( blå) viser tetrasomic /bipolar celledeling i metafase /tidlig anaphase (A) og sen anaphase (B) og en disomic /veis celledeling i metafase (C) og telophase (D); segregering mønsteret er 4-4 i (B) og 3-1-0 i (D). Time-lapse mikroskopi av
H2B /GFP
transfekterte HEK293 celler viser rekken av en-veis metafase konfigurasjon (E; polene betegnet ac) gjennom to påfølgende kromosom segregering hendelser til fire datter kjerner og fra en tetrapolar metafase konfigurasjon (F) gjennom en tre-veis ana-telophase tre datterkjerner vist med tredimensjonal rekonstruksjon av en confocal bilde stabel ved T = 40 min (T, tid fra første bildet).
Den euploid segregering modell kan være motbeviste
i alt 15 490, 9 000 og 36 667 mitoser ble vist i SW480, WiT49, og HEK293, henholdsvis, og ana-telophase celler ble valgt for analyse av kromosom segregering (tabell 1). For å teste nøyaktigheten av sonden systemet vi først vist morfologisk normale bipolare ana-telophases, hvor 01:01 segregering kan forventes. Alle disse celledelinger (2 323, 1 350 og 5 500 celler i WiT49, SW480 og henholdsvis HEK293,) viste et likt antall kromosomer i de to datter poler (figur 1B). Prøvetaking av multipolar anaphases ble deretter utført, inkludert disomic celler i SW480 og disomic samt tetrasomic celler i WiT49 og HEK293. Grunnen til dette valget var at i SW480 10% av cellene viste en kopiantall forskjellig fra to, men i WiT49 og HEK293 omtrent 20% av cellene var tetrasomic for de valgte kromosomer. Totalt 158, 54, og 49 analyserte multipolar anaphase celler i WiT49, SW480, og HEK293 henholdsvis ble scoret. Med få unntak de multipolar celledelinger resulterte i en ulik segregering av kromosomer hos dattercellene (Figur 1D). Oppsummering av data for disomic /Tripolar divisjoner, 2-1-1 segregering var vanligst (43%), etterfulgt av 3-1-0 (28%), 2-2-0 (23%), og 4-0- 0 (6%) segregations. Blant tetrasomic /Tripolar celledelinger, det 3-3-2 segregering var den hyppigste (22%), etterfulgt av 4-3-1 (20%), og 4-2-2 (18%), mens de andre konfigurasjoner hadde frekvenser 10%. Til slutt, for de disomic /tetrapolar konfigurasjoner, den 2-1-1-0 konfigurasjon (42%) var den vanligste, mens i de tetrasomic /tetrapolar celler i 4-2-2-0, 3-2-2-1 og 2-2-2-2 konfigurasjoner (hver på 19%) var de mest vanlige.
Således, i motsetning til vanlig bipolar mitose, MM vanligvis resultert i en ujevn kopi-antall av studerte kromosomer i datterceller. Videre har de fleste multipolar mitoser førte til en betydelig andel av celler med nullisomy i det minste en av dattercellene: 55% (78/143) av disomic /tre-veis, 31% (26/85) av tetrasomic /tre-veis, 92% ( 11/12) av disomic /tetrapolar, og 48% (10/21) av tetrasomic /tetrapolar mitoser, henholdsvis. Dette tilbakeviser hypotesen om at multipolar celle divisjoner i transformerte celle divisjoner kan modelleres etter euploid kromosom segregering mønstre funnet i ikke-transformerte celler [25].
DNA-innhold i multipolar dattercellene er svært variabel
for å kvantifisere den totale fordelingen av DNA i multipolar ana-telophases ble WiT49 valgt for videre analyse fordi denne cellelinje inneholdt den høyeste frekvensen av MM. Tidligere undersøkelser av DNA-innhold i tumorcelle mitoser er utført av Feulgen farging i en to-dimensjonal innstilling [30]. Imidlertid MM har ofte et større kromatin volum enn normalt mitoser med en diameter på opp til 100 um og en kompleks tredimensjonal struktur [31]. For å være i stand til å kvantifisere den relative DNA-innhold av datter ana-telophases under disse forholdene, søkte vi fluorescens kvantifisering av DAPI-merkede DNA ved multiphoton kryss snitting mikroskopi. Denne teknikken gir høy romlig oppløsning avbildning i et tredimensjonalt miljø på grunn av den ikke-lineære signalgenerering ved laserfokus [32]. Den lokaliserte eksitasjon reduserer out-of-fokus fluorescens og foto-bleking. Å objektiv analysen ytterligere, ble en rekke forskjellige terskler for DAPI-intensitet velges, som strekker seg fra i nærheten av støynivå. For hver terskelverdi, ble forholdet mellom mengden av fluorescens i hver region til at i den første regionen beregnet. En gjennomsnittlig relativ DNA-innhold for hver ana-telophase stang ble deretter beregnet ved å ta gjennomsnittet av resultatene for alle terskler (figur 2A-C).
rekonstruert tredimensjonalt multiphoton innlegg snittbilder av en bipolar (A) og en multipolar (B) telophase celle i WiT49 viser asymmetriske DNA-fordeling i den sistnevnte konfigurasjon. Kvantifisering av den relative mengden av kromatin (C) i bipolar (svart), tre-veis (rød) og tetrapolar (grønn) ana-telophase celler bekrefter en bred variasjon i DNA-innhold av multipolar datterceller (X-aksen viser rang rekkefølge i henhold til DNA innhold). Måling av andelen av BrdU-positive bipolar (blå) og multipolar (rød) mitotiske celler på ulike tidspunkter etter merking (D) indikerer forsinket exit fra mitose for multipolar celle divisjoner i WiT49 og HEK293 (feilfelt indikerer standardavvik). Tid lapse avbildning av H2B /GFP HEK293 celler viser en langvarig metafase-anaphase intervall, og en redusert anaphase-inter intervall i multipolar sammenlignet med bipolare celledelinger (E); enkle og doble stjernene indikerer signifikans på 0,05 og henholdsvis 0,01 nivåer (Mann-Whitney U-test). Én per minutt tid lapse imaging (F) av 12 multipolar mitoser, som svarer til en strøm av identisk fargede pilene viser hyppige polaritet transformasjoner (I = inter, PM = prometafase, M2 = bipolar meta, M3 = veis metafase, M4 = tetrapolar metafase, anafase = A, T = telophase). Kvantifisering av total intensitet i vilkårlige fluorescens enheter i forhold til centrosomal gamma tubulin fluorescens (G) viser en sterk reduksjon av separase nivåer i telophase forhold til meta i bipolar, men ikke i multipolar celledelinger (feilSøylene viser standardavvik). Diplochromosomes (H, piler) i G-banded delvis metafase sprer seg fra WiT49.
Metoden ble først testet på 20 metanolfiks morfologisk normal datter ana-telophases fra bipolare celledelinger. I disse, den relative DNA-innhold av de enkelte poler i forhold til den totale mengden av kromosomalt DNA i hver celledeling var omtrent 50%, tilsvarende godt til den forventede 01:01 segregering. Vi så evaluert datter polene i Tripolar og tetrapolar ana-telophases hhv. Her den relative DNA innholdet i datter ana-telophases viste omfattende variasjon, 18-46% av det totale innholdet cellulære DNA i Tripolar divisjoner og 16-34% i tetrapolar divisjoner. Det faktum at DNA ikke klarte å skille til stabile, tilbakevendende forholdstall videre støttet en ikke-euploid modell av kromosom segregering og indikerte en høy grad av uorden i disse celledelinger.
multipolar metafase er forlenget og gjennomgår polaritet brytere
den tilsynelatende komplekse atferd kromosomer i MM bedt oss om å undersøke tids kurs i multipolar sammenlignet med bipolare mitoser. For å vurdere den totale tiden brukt i mitose, vi først merket kromosomer i WiT49 og HEK293 celler med bromdeoksyuridin (BrdU). Etter cellesyklus-stans av serum-sult, ble BrdU innlemmet i 1 time i serumrikt medium, hvoretter cellene ble høstet hver annen time. Den mitotiske celle basseng som hadde vært i S-fasen under merkingsperioden ble deretter påvist ved anti-BrdU-antistoff. Blant de bipolare mitoser i begge cellelinjer, den merkede cellen bassenget gjort opp mesteparten av delende celler etter 4 timer, mens svært få merket mitotiske celler igjen etter 8 timer (figur 2D). Blant MM, den merkede cellepopulasjon også en topp etter 4 timer, men holdt seg deretter for å utgjøre en stor andel av delende celler, selv etter 8 timer. Dette indikerte at MMS tok vesentlig lenger enn bipolare celledelinger for å avslutte mitose.
For å validere funnene vi skapt et stabilt HEK293 transfektant uttrykker en histon-2B /grønn fluorescerende fusjonsprotein, slik at sanntids overvåking av kromosomer under celledeling (Movie S1) [33]. Vi deretter fulgte 10 bipolar og 12 multipolar celledelinger fra prometafase til den påfølgende inter og målte intervallene fra initiering av metafase til meta-anaphase overgang og fra meta-anaphase overgang til telophase-inter overgang. I bipolare divisjoner, mellomtiden fra initiering av meta til begynnelsen av anaphase var 34 min (range 23-49), mens MM det var svært variabel, men samlet betydelig utvidet (P 0,05, Mann-Whitney U-test) med en gjennomsnitt av 91 min (range 16-220 min, figur 2E). I motsetning til dette, tiden fra starten av anaphase inntil interfase var litt kortere i MM enn i bipolare mitoser (gjennomsnittlig 23 min sammenlignet med 32 min; P 0,01).
Av de 12 multipolar mitoser som ble overvåket, man ikke skiller seg i datterceller, men arrestert i veis metafase og deretter vende tilbake til å interfase (figur 2F). Av de resterende 11 celler, fire gikk enten veis eller tetrapolar mitose uten skifte i konfigurasjon. De andre syv celler viste en eller flere polaritet brytere. En celle gjennomgikk kromosom segregering i to forskjellige trinn, først gå fra veis meta til veis anaphase der en av de tre polene igjen delt, totalt produserer fire datterkjerner (figur 1E, Movie S2). De andre seks celler flyttes mellom ulike meta konfigurasjoner før du går videre til anaphase (figur 1F, filmer S3 og S4). Av de 11 cellene som ble fulgt fra prometafase gjennom telophase, gjorde tre ikke viser et klart skille anaphase polene, tilsynelatende går fra en kompleks metafase konfigurasjon direkte to telophase (Movie S5), med tiden mellom disse fasene blir 10 minutter eller mindre. På grunn av at time-lapse avbildning ble bare utført i to dimensjoner, kan det ikke utelukkes at i det minste noen av de observerte skift polaritet var på grunn av rotasjoner av mitotiske figurer i Z-nivå, selv om ingen slike rotasjoner var tydelig. Likevel, våre data viste at dynamikken i MM var tydelig forskjellig fra bipolar mitose, typisk med lengre meta varighet der polaritet brytere kan forekomme.
Sister-kromatid separasjon er usynkroniserte i multipolar mitoser
uregelmessig og rask overgang fra meta til telophase-inter MM, og fravær av klare anaphase konfigurasjoner i noen celler indikerte at søster-kromatid separasjon ikke kan oppstå i en vanlig måte. For å overvåke søsterkromatidutveksling separasjon i ytterligere detalj i MM, vi brukte centromeric sondesystem som er beskrevet ovenfor og selektert sen metafase /tidlig anafase celler for analyse hvor minst ett par av søster sentromerer i metafase /tidlig anaphase platen var atskilt fra hverandre, noe som gjenspeiles av split FISH-signaler i en dobbel-dot formasjon. I både WiT49 og HEK293, den store majoriteten (97% og 98%, respektivt; tabell 2) av cellene med en bipolar konfigurasjon i hvilken en cent hadde skilt viste atskillelse også av den andre cent (e), noe som indikerer et godt koordinert metafase -anaphase overgang i disse cellene. I multipolar celler i WiT49 og HEK293, valgt av de samme kriteriene, ble mindre enn halvparten av de analyserte celledeltilsvar koordinert. Faktisk, 59% og 55%, henholdsvis, av disse cellene oppviste separasjon av bare noen av de probet søster sentromerer mens de andre forble useparert (figur 3A). Søsterkromatidutbytting MM var dermed ofte usynkroniserte, sammenlignet med vanlige celledelinger.
FISH deteksjon (A) på kromosom 17 cent (grønn) kombinert med immunfluorescens for beta tubulin (rød) viser separasjon av søster sentromerer av en (pilen), men ikke fra den annen homolog (pilspiss). Immunfluorescens påvisning av separase (orange) og beta-tubulin (grønn) viser lokalisering av separase til spindel pålene ved metafase (B) og tidlig anaphase (C) og svak intensitet farging i den midbody ved telophase (D). Samlokalisering av separase (rød) og centrosomes (gamma tubulin i grønt) er observert på tidlig bipolar anaphase (E, øverst til venstre), mens flere andre separase foci er til stede i en tilstøtende tetrapolar tidlig anaphase celle (E, nederst til høyre). Co-merking av separase (oransje) og beta-tubulin (grønn) bekrefter dette funnet (F, tetrapolar øverst til venstre og bipolar nederst til høyre), og viser uttømming av separase i en bipolar telophase celle (G, høyre) mens flere foci forbli i en tetrapolar telophase celle (G, til venstre). Immunofluorescens for CCNB1 (grønn) og AURKA (rød) erholdt cytoplasmatisk farge i bipolar (H) og multipolar (J) metafase-celler mens ingen farging observert i bipolar (I) og multipolar (K) anafase celler; AURKA flekker på pericentrosomal regionene både metafase og anaphase. Immunfluorescens for beta-tubulin (grønn) og AURKB (rød) viser lokalisering av AURKB utelukkende til sentromerer på bipolar (L) og multipolar (M) metafase, og utelukkende til spindelen midtsone ved bipolar anaphase (N); i motsetning til dette multipolar ana-telophase celler (O, P) oppviser AURKB i midtsone så vel som på flere kromosomer, noe som indikerer svikt for å skille søsterkromatider av visse kromosomer (O, pil). Immunfluorescens for beta tubulin (grønn) og MAD2L1 (rød) viser MAD2L1 lokalisering til sentromerer på bipolar prometafase (Q); ved bipolar ana-telophase MAD2L1 foci er bare til stede i kromosomene ikke innlemmet i den mitotiske prosessen (R, pil), mens på multipolar ana-telophase, flere MAD2L1 foci er tilstede på kromosomer (S).
multipolar meta-anaphase overgang skjer ved spindelenheten sjekkpunkt glidning
for ytterligere å undersøke meta-anaphase overgang MM, vi har oppdaget den intracellulære lokalisering av ESPL1 (separase) protein i ulike stadier av celledeling . I pattedyrceller, er denne protease er nødvendig for normal søsterkromatidutveksling separasjon ved spaltning av cohesin s kleisin subenhet, men det er ikke nødvendig for andre aspekter av mitotisk progresjon som cytokinese [34]. Humant separase befinner seg hovedsakelig rundt Sentrioler før sent anaphase når det nedbrytes ved en autokatalytisk prosess utløst av sin egen aktivering av anafase-fremmende kompleks [35] – [38]. Immunfluorescens (IF) deteksjon med et antistoff mot den sentrale delen av separase (aminosyrer 1200-1300) i bipolare mitoser fra WiT49, HEK293, og kontrollcellelinjer uten mm (fibroblaster og CHP212 neuroblastom-celler) følgelig resultert i fluorescens begrenset til spindelen pålene ved metafase og tidlig anaphase (figur 3B og C). Ved bipolar metafase, var det også annen ekstra separase foci lokalisert til den mitotiske spindel og overlappende med plasseringen av kromosomer, lik fordelingen som tidligere er rapportert i gjærceller som uttrykker et separase-GFP-fusjonsprotein [39]. I bipolare telophase celler, separase hadde forsvunnet fra disse stedene, og kan bare observeres i et mindretall (1-10%) av celler som viser en svak signal på midbody (Figur 3D). Ytterligere kvantifisering av totalt cellulært separase fluorescens i 30 bipolar celledelinger fra hver cellelinje viste en betydelig reduksjon ved telophase, som forventet fra normal separase aktivering etterfulgt av autokatalytisk degradering (P 3 x 10
-5 i alle cellelinjer, t-test, figur 2G). Separase ble deretter påvist og kvantifisert i multipolar metafase og tidlig anaphase celler fra WiT49 og HEK293 (21 og 15 celler kvantifisert, henholdsvis). I likhet med bipolare divisjoner, separase ligger til centrosomes i disse divisjonene, men den ekstra-centrosomal fluorescens var mer uttalt enn ved bipolar divisjoner (Figur 3E og F). I sterk kontrast til bipolare celler, multipolar telophase cellene beholdt både centrosomal og spindel plassert separase, og den totale separase fluorescens ble ikke redusert på dette trinn sammenlignet med metafase (figurene 2G og 3G; P = 0,83 og 0,37 i WiT49 og HEK293 hhv ).
ufullstendig nedbrytning av separase i telophase celler indikerte at multipolar celledel var i stand til å omgå spindelenheten sjekkpunkt (SAC) som normalt hindrer meta-anaphase overgang før alle kinetochores er festet til motsatte spindel polene. Det har blitt rapportert at SAC i virveldyrceller ikke arrestere mitotisk prosessen permanent. Faktisk kan cellene etterhvert bli drevet gjennom mitose av en av en proteasom-avhengig nedbrytning av cyclin B (CCNB) [40]. For å vurdere om dette fenomenet kan forklare hvorfor multipolar mitoser kommet gjennom anaphase tross en ufullstendig separase syklus, ble CCNB1 og CCNB2 oppdaget av monoklonale antistoffer i bipolar og multipolar mitoser i WiT49 og HEK293. Celler ble kryss merket med aurora kinase A (AURKA) antistoffer for å enkelt identifisere delende celler. AURKA er lokalisert hovedsakelig i pericentriolar regionen og uttrykt fra tidspunktet for sentrosomen duplisering på G2 til mitotisk exit [41]. Som forventet, de aller fleste av bipolare prometafase og metafase celler var sterkt positiv for CCNB1 og CCNB2, mens bipolare anaphase cellene var negativ i begge cellelinjer (figur 2 H og jeg; P 7 × 10
-15 for pro /meta versus anaphase; Fishers eksakte test; 69-197 celler scoret i hver celle linje). Tilsvarende multipolar prometafase og metafase celler var positive, mens alle anaphase celler var negative for både CCNB1 og CCNB1 (figur 3J og K, P 2 × 10
-4; 20-55 celle scoret).
for ytterligere å teste hypotesen om at MMS kunne passere fra meta til anaphase av CCNB degradering til tross for manglende helt tilfreds SAC, aurora kinase B (AURKB) og MAD2L1 ble oppdaget av immunfluorescens i WiT49 bipolar og multipolar mitoser. Ved normal metafase, AURKB lokaliserer til sentromerer til bi-orientert feste av kinetochores er oppnådd, hvoretter den flytter til spindelen midtsone i ana- og telophase [41]. Det er ikke kjent nøyaktig hvordan denne flyttingen er regulert, men det har blitt foreslått at spenningen mellom bi-orientert søsterkromatider sequesters AURKB i indre cent, og dermed begrense tilgjengeligheten av denne kinase til sine underlag og lindrende spindelenheten sjekkpunkt [42] . MAD2L1 lokaliserer til kinetochores av kromosomer som ennå ikke har bi-orientert, og forsinkelser anaphase utbruddet ved å binde til og hemme CDC20 før alle kromosomene er justert på metafase plate; etter normal metafase-anaphase overgang, er MAD2L1 lenger kan påvises ved sentromerer [43]. Følgelig immunfluorescens for AURKB farget de centromeric regioner i alle kromosomene i bipolare og multipolar WiT49 prometafase og metafase celler (Figur 3L og M) og spindelen midtsone i de aller fleste (97%) av bipolare anaphase celler (Figur 3N). I motsetning til de fleste (76%) av multipolar ana-telophase celler utstilt AURKB foci ikke bare på midtsone men beholdt flekker på enkelte kromosomer (Figur 3o og P; P 1,1 × 10
-16 for bipolar vs. multipolar ; 189 ana-telophases scoret). I noen anaphase celler, de AURKB foci var godt synlig på kromosomer med useparerte søsterkromatider (Figur 3o). Som forventet ble MAD2L1 foci oppdages på sentromerer i bipolare og multipolar prometafase celler (Figur 3Q). I bipolare ana-telophase celler ble observert MAD2L1 foci bare i sjeldne celledel med kromosom lagging (figur 3R) og de fleste (97%) av morfologisk normal bipolare ana-telophases var MAD2L1-negative. I motsetning til de fleste (92%) av multipolar ana-telophases viste to eller flere MAD2L1 foci (figur 3S; P 2 × 10
-17 for bipolar vs. multipolar, 168 ana-telophases scoret). Dermed MMS var i stand til å degradere CCNB og avslutte mitose uten globalt tilfreds SAC, som dokumentert av oppbevaring av AURKB og MAD2L1 foci på noen ana-telophase kromosomer.
Mulighet for spindelenheten sjekkpunkt glidning er ikke begrenset til multipolar mitoser
å adressere om evnen til å omgå SAC var begrenset til multipolar celledelinger, utsettes vi normale fibroblaster og WiT49 celler til spindelen forstyrrende middel Colcemid i 18 timer, hvoretter cellene ble farget med antistoffer til AURKA og CCNB1. Etter Colcemid eksponering av fibroblaster, forholdet mellom CCNB-positive metafase-celler til CCNB-negative ana-telophase celler (M /A) forskjøvet seg dramatisk fra 1.8 (133/74) til 15,2 (214/14). I ueksponert WiT49 M /A-forholdet var 2,0 (528/258) for bipolare mitoser, mens det var 5,9 (100/17) for MM (P 2 × 10
-5 for bipolar vs. multipolar). Den lavere frekvens fra ana-telophase konfigurasjoner blant multipolar mitoser er forenlig med metafase blir forlenget i forhold til anaphase i MM. Etter Colcemid eksponering, M /A ratio økte både bipolare og multipolar WiT49 mitoser, til 50,3 (302/6) og 27,5 (110/4), henholdsvis med ingen signifikant forskjell mellom dem (P = 0,47). Dermed vil en liten del (2-6%) av mitoser i begge fibroblaster og WiT49 celler var i stand til å omgå spindelenheten sjekkpunkt uavhengig av polaritet, noe som indikerer at dette sjekkpunktet glidning mekanismen er ikke unikt for multipolar mitoser.
Checkpoint glidning fører til hyppige nondisjunction i multipolar mitose
Oppdagelsen av at multipolar mitoser avsluttet mitose uten fullstendig separase aktivering og med beholdt kromosom MAD2L1- og AURKB foci spådd at i det minste noen kromosomer i de resulterende dattercellene vil bestå av søster kromatider som forble festet på sine sentromerer. Slike diplochromosomes har blitt beskrevet som en karakteristikk av separase-slettede celler og har blitt tatt som bevis på at separase er nødvendig for søsterkromatidutveksling separering [34]. [9].
