Abstract
RGS10 regulerer eggstokkreft cellevekst og overlevelse, og RGS10 uttrykk undertrykkes i cellemodeller av eggstokkreft chemoresistance. Imidlertid er de mekanismer som styrer RGS10 ekspresjon i eggstokkreft dårlig forstått. Her rapporterer vi RGS10 undertrykkelse i grunnskolen eggstokkreft og CAOV-3 eggstokkreft celler i forhold til immortalisert eggstokkreft overflaten epitelceller (IOSE) celler, og i A2780-AD kjemoresistent celler i forhold til foreldre A2780 celler. RGS10-1 og RGS10-2 transkripsjoner er uttrykt i eggstokkreft celler, men bare RGS10-1 er undertrykt i A2780-AD og CAOV-3 celler, og RGS10-1 arrangøren er unikt beriket i CpG dinukleotider. Farmakologisk hemming av DNA metyl-transferaser (DNMTs) økte RGS10 uttrykk, noe som tyder på potensiell regulering av DNA metylering. Bisulfite sekvensanalyse identifisert en region av RGS10-1 arrangøren med betydelig forbedret DNA metylering i kjemoresistent A2780-AD celler i forhold til foreldre A2780 celler. DNA-metylering i CAOV-3 og IOSE celler var lik A2780 celler. Mer markerte forskjeller ble observert i histone acetylering av RGS10-1 promoter. Acetylert histon H3 forbundet med RGS10-1 arrangøren var betydelig lavere i A2780-AD celler i forhold til foreldre celler, med en tilsvarende økning i histondeacetylase (HDAC) enzym forening. Tilsvarende acetylerte histone nivåer på RGS10-1 arrangøren var betydelig lavere i CAOV-3 celler i forhold til IOSE celler, og HDAC1 bindingen ble doblet i CAOV-3 celler. Til slutt viser vi at farmakologisk hemming av DNMT eller HDAC enzymer i kjemoresistent A2780-AD celler øker RGS10 uttrykk og forbedrer cisplatin toksisitet. Disse data tyder på at histon de-acetylering og DNA metylering korrelerer med RGS10 undertrykkelse og chemoresistance i eggstokkreft. Markører for tap av RGS10 uttrykk kan identifisere kreftceller med unik respons på legemiddel
Citation. Ali MW, Cacan E, Liu Y, Pierce JY, Creasman WT, Murph MM, et al. (2013) Transkripsjonell Suppression, DNA metylering og Histone Deacetylering av Regulator av G-protein Signa 10 (RGS10) Gene i eggstokkreft celler. PLoS ONE 8 (3): e60185. doi: 10,1371 /journal.pone.0060185
Academic Redaktør: James Porter, University of North Dakota, USA
mottatt: 20 november 2012; Godkjent: 22 februar 2013; Publisert: 22 mars 2013
Copyright: © 2013 Ali et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Midler til dette arbeidet ble gitt av tilskudd fra National Institutes of Health (NIH) (CA151006 til SBH og MM, CA131200 til ste), American Cancer Society (til SFG), og Marsha Rivkin Senter for Ovarian Cancer Research (til SBH). (Www.nih.gov/, www.cancer.org/, www.marsharivkin.org/) De organer hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreftceller celler~~POS=HEADCOMP utnytte flere reseptor-mediert vekst og overlevelse signalveier for å unngå normale quiescence og celledød svar. Amplifisering av disse banene er en vanlig mekanisme i progresjon av kreft. Aktivering av G-protein-koblede reseptorer av ligander lysofosfatidisk syre (LPA), endotelin, stromal avledet vekstfaktor-1 (SDF1), prostaglandiner, og trombin bidrar til utviklingen av mange kreftformer, og medikamenter som blokkerer disse reseptorene er for tiden i forskjellige stadier av kliniske studier som legemiddel [1]. Disse GPCRs initiere vekst og overlevelse signalering kaskader ved å aktivere cellulære G-proteiner. G-protein aktivitet avsluttes med regulator av G-protein signalering (RGS) proteiner som raskt deaktivere G-proteiner og kontrollere styrken og varigheten av GPCR-initierte trasé [2]. RGS proteiner som hemmer onkogene signaler formidlet av GPCR ligander er klar til å hemme kreft vekst. Faktisk har spesifikke RGS proteiner vist seg å undertrykke reseptor-stimulert vekst og overlevelse signalering i bryst, prostata, og eggstokkreft [3] – [5]
Eggstokkreft er den ledende dødsårsaken fra gynekologisk kreft. og den femte vanligste årsaken til kreftdød hos kvinner. Mindre enn 50% av eggstokkreft kreftpasienter overlever fem år etter diagnose [6]. Selv om eggstokkreft er preget av en høy svarprosent på kjemoterapi, er den høye dødeligheten skyldes i hovedsak utviklingen av resistens mot de førstelinje kjemoterapeutika [7]. De fleste pasientene som i utgangspunktet svare på kjemoterapi vil tilbakefall med kjemoresistent sykdom innen to år [8]. Forstå de molekylære og genetiske endringer som driver eggstokkreft progresjon og utvikling av ervervet chemoresistance kan føre til strategier for å forutse og forhindre forekomsten av refraktær sykdom.
Vi har vist at endogene RGS proteiner undertrykke eggstokkreft cellevekst, migrering og MAP-kinase-aktivering som respons på LPA, en viktig autokrin vekstfaktor på eggstokkreft [3], [9]. Mer nylig har vi identifisert RGS10 som en viktig regulator av celle overlevelse og chemoresistance. RGS10 transkripsjonen ekspresjon er nedregulert i flere modeller av ervervet chemoresistance i eggstokk-kreft, og RGS10 ekspresjonsnivåene forandre eggstokkreft celle følsomhet for cisplatin og taxan cytotoksisitet [10]. Disse observasjoner tyder på at undertrykkelse av RGS10 uttrykk kan bidra til eggstokkreft progresjon og utvikling av chemoresistance ved amplifisering av GPCR-formidlede vekst og overlevelse signalveier. Imidlertid er ikke klarlagt mekanismen for undertrykkelse av RGS10 uttrykk i eggstokkreft.
RGS protein uttrykk er dynamisk regulert i nevrale og hjerte-systemer [11] og i kreft progresjon [12], noe som åpner for komplekse kontroll over GPCR signalveier. Transkripsjonell og posttranslasjonelle mekanismer for kontroll av RGS uttrykk er godt definert [13] – [16], mens epigenetisk kontroll av RGS uttrykk ved kovalente modifikasjoner av DNA eller histoner har vært stort sett uutforsket. Genet Slå av DNA-metylering og histon-deacetylering er en etablert mekanisme i progresjon av mange kreftformer [17], inkludert kreft i eggstokkene [18] – [20]. Tilsetningen av metylgrupper til CpG-dinukleotider av DNA-metyl-transferase (DNMT) enzymer og fjerningen av acetylgrupper på lysinrestene i histonproteinene av histon-deacetylase (HDAC) enzymer koordinert å undertrykke transkripsjonen aktivitet [21]. DNA metylering og DNMT uttrykk økning i kreft progresjon eggstokkene [22], og histone deacetylases (HDACs) er også overexpressed i eggstokkreft vev [23]. Dette tyder på at epigenetisk regulering av RGS gener kan også bidra til deres dynamiske uttrykk i kreft progresjon.
I denne studien har vi undersøkt epigenetisk regulering av RGS10 uttrykk i eggstokkreft celler. Vi fokuserer på to modeller av RGS10 undertrykkelse – CAOV-3 eggstokkreft celler i forhold til godartede eggstokkene epitelceller, og kjemoresistent A2780-AD celler og deres kjemosensitiv foreldre celler. Vi identifiserer betydelige økninger i DNA metylering i kjemoresistent celler, og merket nedgang i histone acetylering og økning i HDAC1 forening ved RGS10 arrangøren i begge CAOV-3 og A2780-AD celler. Våre resultater tyder på at epigenetiske histonmodifikasjonene kan bidra til tap av RGS10 uttrykk i eggstokkreft celler, og at DNA metylering kan bidra til ytterligere tap av uttrykk under ervervet chemoresistance.
eksperimentelle prosedyrer
Cells og Reagenser
CAOV-3 og SKOV-3-celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC) og opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (ATCC) og McCoys 5A medium (Mediatech, Inc.), henholdsvis, supplert med 10% FBS (PAA Laboratories, Inc.). Den kjemosensitiv A2780 foreldrenes cellelinje og dets multiresistent datter motpart A2780-AD celler (avledet som beskrevet [24]) ble sjenerøst gitt av Dr. Bob Brown, Imperial College London. Disse cellene ble holdt i RPMI 1640 medium (ATCC) supplert med 10% FBS og 5 mM L-glutamin. Kjemoresistent celler ble ytterligere opprettholdt i 1,5 mikrometer cisplatin. Udødeliggjort eggstokkreft overflate epitelceller (IOSE-80, [25]) ble sjenerøst gitt av Dr. Nelly Salzburg (University of British Columbia) og vedlikeholdes i Media 199: MCDB 105 (01:01) supplert med 15% FBS. Alle celler ble dyrket i 5 mM penicillin-streptomycin ved 37 ° C med 5% karbondioksid.
5-aza-2′-deoksycytidin og cisplatin ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Antistoffer som gjenkjenner histon H3 og acetylerte histon H3 var fra Millipore (Lake Placid, New York). Antistoff som gjenkjenner histon H3 (acetyl K18) var fra Abcam (Cambridge, MA). Antistoffer som gjenkjenner RGS10 og HDAC1 ble oppnådd fra Santa Cruz (Santa Cruz, California).
Cellular Levedyktighet Analyser
1 × 10
4 A2780 eller A2780-AD-celler ble sådd i tre eksemplarer i 96-brønners plater og fikk feste seg i 24 timer før behandling med de angitte konsentrasjoner av cisplatin i 48 timer. Celleviabilitet Analysen ble utført i serumfritt medium som inneholder CellTiter-Blue® reagens (Promega Corporation) som tidligere beskrevet [10].
Kvantitativ Real-Time PCR
mRNA ble isolert ved hjelp Trizol reagens ( Invitrogen) og cDNA ble syntetisert fra 2 ug av total-RNA ved bruk av High Capacity revers transkriptase cDNA kit (Applied Biosystems /Life Technologies). Kvantitativ real-time PCR ble utført ved hjelp Hevet III kit for RT-PCR (Invitrogen) og Power SYBR Grønn reagent (Applied Biosystems). Reaksjonene ble normalisert ved bruk av husholdningsgenet GAPDH og beregninger ble utført i henhold til to
-ddCT metode. Fold endring i uttrykket ble bestemt i tre eksemplarer i tre uavhengige forsøk, og eksperimentelle replikater ble testet for signifikante forskjeller mellom grupper med paret t-test. Primere benyttet var basert på algoritmen generert sekvenser fra Primer Bank (https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/). RGS10 Forward: GAC CCA GAA GGC GTG AAA AGA, RGS10 Omvendt: GCT GGA CAG AAA GGT CAT GTA GA, RGS10 variant-en Forward: CCC GCG GCG ATG TTC AAC C, RGS10-variant-en Reverse: CTC CAG GGA TGC CGC CCA TT, RGS10-variant-2 Forward: TGC GTG GAA CTT CTC AGG TGG ACA, RGS10 variant-2 Omvendt: CCG CCC ATT TGG CTG TGC TCT, RGS2 Forward: AAG ATT GGA AGA CCC GTT TGA G, RGS2 Reverse: GCA AGA CCA TAT TTG CTG GCT, RGS5 Forward: CCC ACT CAT GCC TGG AAA GG, RGS5 Omvendt: CTT GGC TGG TTT CTC TGG CT, GAPDH Forward: GCC AAG GTC ATC CAT GAC AAC T, GAPDH Omvendt: GAG GGG CCA TCC ACA GTC TT.
for å bestemme effekten av 5-Aza-2′-deoxycytidine eksponering på RGS avskrift uttrykk, 7 × 10
5 Skov-3 celler ble sådd ut i 100 mm vevskulturplater og lov til å feste natten. Den følgende dag, Mediet ble aspirert og erstattet med 20 uM 5-aza-2′-deoksycytidin i DMSO eller DMSO bærerkontroll. Etter 3, 5, 7 og 9 dager med medikament inkubasjon ble mediet aspirert og 7 mL Trizol reagens (Invitrogen) ble tilsatt. RNA isolering, DNA-syntese, og QRT-PCR ble utført som ovenfor.
Isolering av eggstokkreft celler Fra Peritoneal Ascites
Peritoneal ascites fra eggstokkreft pasienter ved Medical University of South Carolina (MUSC ) ble oppnådd under MUSC Institutional Review Board (IRB) protokoll # 18983, som inkluderte en gjennomgang av etikk studien og spesielt godkjent studiet. Denne protokollen innbefatter anvendelse av de angitte humane prøver for undersøkelse av ekspresjon og modifikasjon av proteiner involvert i cellesignalisering og medikamentresistens i primær eggstokkreft celler. Fjerning av peritoneal ascites er en standard vare for eggstokkreft pasienter og ascites er normalt forkastet. Alle prøver som mottas ble avidentifisert før levering til laboratoriepersonell. Pasientene ble informert om muligheten til å delta i studien og muntlig samtykke ble innhentet av lege. Skriftlig samtykke ble ansett som en risiko til pasient konfidensialitet av IRB siden signere en samtykkeerklæring for tillatelse til å bruke et avidentifisert prøven ville være den eneste registrering av pasientens identitet og deltakelse, og dermed den eneste risikoen for brudd i pasientens konfidensialitet. Et opptak av prøvene er mottatt i laboratoriet ble logget bare av innsamlingsdatoen. Fjerning av peritoneal ascites er en standard vare for eggstokkreft pasienter. Ingen av pasientene identifiserende informasjon ble oppnådd av forskere i laboratoriet. Peritoneal ascites ble sentrifugert ved 1000 rpm i 10 minutter ved romtemperatur, og cellepelletene ble vasket med fosfatbufret saltvann (PBS). Røde blodlegemer ble lysert i lyseringsbuffer RBC (eBioscience, San Diego, CA) i 5 minutter ved romtemperatur. Lyseringsbuffer ble fortynnet med PBS, cellene sentrifugert som ovenfor og resuspendert i RPMI medium med 10% FBS. Cellene ble inkubert i 1 time ved 37 ° C med 5% CO2 for å tillate feste av fibroblaster og makrofager. Fristilt epitelceller ble fjernet og inkubert separat i fullstendig RPMI medium som inneholder 10% føtalt bovint serum.
Rgs10 immunoblotter
For å evaluere RGS10 uttrykk i primær ascites og IOSE celler, cellelysatene ble generert i RIPA -buffer (50 mM Tris pH 7,4, 10% glyserol, 150 mM NaCl, 1% Triton X100, 0,5% SDS, 0,5 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 5 mM Na4P2O7, 40 mM β-glycerofosfat, 50 mM NaF, 2 mM fenylmetylsulfonyl fluor og aprotinin). Etter ultralydbehandling og sentrifugering ble like mengder løselig protein kjøres på en 10-12% SDS PAGE gel, overført til nitrocellulose, og immunoblottet med RGS10 antistoff. For å evaluere RGS10 uttrykk i cellelinjer ble 10
5 celler lysert i SDS-PAGE prøvebuffer. Lysatene ble kokt i fem minutter og analysert ved hjelp av SDS-PAGE. Membraner ble inkubert med RGS10 primære antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) og HRP-konjugert kanin sekundære antistoffer (Pierce) og visualisert ved hjelp av ECL-reagenser (Pierce). Membraner ble senere strøket med GAPDH antistoffer (Life Technologies) som en lasting kontroll.
Bisulfite Sekvense
Methprimer hjemmeside [26] (https://www.urogene.org/methprimer/index1 .html) ble brukt til å analysere CpG innhold av RGS arrangører og å designe primere rettet mot forskjellige regioner i RGS10-1 promoter. Fire forskjellige primerpar ble utformet, RGS10-BS1, RGS10-BS2, RGS10-BS3 og RGS10-BS4: RGS10-BS1forward: AAG AAA ATG GGG GTT AAT GAT ATT T, RGS10-BS1reverse: TAC CTC TAA CAA AAC CTT CAA ACT C , RGS10-BS1 forsterkning region: -121.303.236 til -121.303.086. RGS10-BS2forward: TGT TTT TAA AGT Tags AGA AGT GTT T, RGS10-BS2reverse: CAC AAA CTA AAA AAC CTA AAC CTC, RGS10-BS2 forsterkning region: -121.303.076 til -121.302.726. RGS10-BS3forward: GAG GAG GTA AAG GTT ATA GGT TGG, RGS10-BS3reverse: AAA TAC ACT AAC CCA AAA AAA ACC CC, RGS10-BS3 forsterkning region: -121.302.800 til -121.302.514. RGS10-BS4forward: GTT TGG TTA GGA GGA GG, RGS10-BS4reverse: CTC CAA TCT AAA AAA TAC CAC, RGS10-BS4 forsterkning regionen. -121.302.327 Til -121.301.988
Genomisk DNA ble høstet fra celler og bisulfittkatalysert omregnes EZ DNA Metylering-Direct Kit (Zymo Forskning Corp). ZymoTaq ™ DNA-polymerase (Zymo Forskning Corp.) ble anvendt for å amplifisere forskjellige regioner i RGS10 promoter av bisulfitt-behandlede genomisk DNA og PCR-produktene ble analysert med 2,5% DNA-agarose-geler og renset ved anvendelse av PureLink Kort Gel Extraction og PCR Purification kombinasjonssett (Invitrogen ). De rensede produkter ble ligert i plasmider ved hjelp StrataClone PCR Kloning Kit (Agilent Technologies) som ble deretter forvandlet til kompetente bakterier. 20 individuelle kolonier ble isolert fra karbenicillin LB-agarskåler og utvidet. QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen Sample Analyse Technologies) ble brukt til å rense plasmidene fra hver koloni, som så ble sendt for sekvensering ved hjelp av T7 og /eller T3 promoter sekvenseringsprimere på UGA Genomics Facility. Clone sekvenser ble utsatt for skjermer for kvalitet og fullstendig konvertering, og justert til genomisk RGS10 promoter DNA ved hjelp BIQ Analyzer programvare [27].
Chromatin Immunpresipitasjon (chip) Analyse
Celler ble sådd ut i en tetthet på 2,5 x 10
6 i 15 cm-vevskulturplater og tverrbundet med 1% formaldehyd i 8 minutter ved romtemperatur. Tverrbindingsreaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 0,125 M glycin i fem minutter ved romtemperatur. Cellekjerner ble isolert og konsentrert ved lysering i fersk SDS lyseringsbuffer (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8,0, dH
2o) pluss proteaseinhibitorer i 25 minutter på is etterfulgt av flash-frysing i flytende nitrogen. Kjerner ble ultralydbehandlet ved hjelp av en Bioruptor vannbad sonikator i 30 sek «On», 30 sek «Off» 3X å generere et gjennomsnitt på 500 bp av tilskåret DNA. DNA skjær ble bekreftet ved å underkaste lysatene til 1% agarose-gel-elektroforese og visualisering av SYBR sikker farging. Sonikerte lysater ble deretter forbehandlet med laks-sperm /agarosekuler (Upstate) og 5% av den totale lysat ble lagret som inngang for normalisering. Halvparten av den gjenværende lysatet ble immunopresipitert med 5 ug av den angitte antistoff over natten ved 4 ° C og den andre halvparten ble immunpresipitert med kontrollantistoff. Etter ytterligere to timers immunopresipitering med 60 mL av laks-sperm belagte agaroseperler, ble alle prøver vasket med hver av de følgende buffere: lav saltbuffer (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, dH2O), høy saltbuffer (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8,0, 500 mM NaCl, dH2O), LiCl (0,25 M LiCl, 1% NP40, 1% DOC, 1 mM EDTA, 10 mM Tris pH 8,0, dH2O), og 1xTE. DNA ble eluert med SDS-elueringsbuffer (1% SDS, 0,1 M NaHCO3, dH2O). Etter eluering ble kryssbindinger snudd over natten med 5 M NaCl ved 65 ° C og immunopresipitert DNA ble isolert ved hjelp av fenol: kloroform: isopropanol mix (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Isolert DNA ble kvantifisert ved sanntid PCR på en ABI prism 7900 (Applied Biosystems, Foster City, CA) ved anvendelse av de følgende primere og prober for RGS10: forover, 5′-GGA ACC GCG AGT CCT CAC-3 «, reversere, 5» -CCC GGA GCT CTA GGT CCC-3 «og sonde, 5′-TGG CTA GGA GGA GGG CGG CG-3′; og for GAPDH: sende, 5»-AAT GAA TGG GCA GCC GTT A-3 «, revers, 5′-TAG CGC CCT TCC ACC TGA CT-3′ og sonde, 5»-CCT GCC GGT GAC TAA CCC TGC GCT CCT -3 «. Verdier generert fra Real time PCR reaksjoner ble beregnet basert på standardkurver generert, ble kjørt i tre eksemplarer reaksjoner, og ble analysert ved hjelp av SDS 2,0 programmet.
Resultater
undertrykkelse av Rgs10 uttrykk i eggstokkreft celler
Våre tidligere data viste nedregulering av RGS10 transkripsjoner i eggstokkreft cellelinjer med ervervet chemoresistance [10]. For å avgjøre om RGS10 er også nedregulert i grunnskolen eggstokkreft celler, immunoblottet vi lysatene fra godartet, udødeliggjort IOSE celle og fra seks hoved ovarialcancer celleprøver isolert fra pasient ascites (Figur 1a). RGS10 protein uttrykk var markert lavere i celler fra hver pasient, noe som tyder på at RGS10 uttrykk er undertrykt i klinisk eggstokkreft. Siden pasientprøver er heterogene og ikke-fornybare, er begrenset deres bruk i å definere mekanismer av undertrykkelse. For å etablere en fornybar, homogen cellemodell av tapet av RGS10 ekspresjon i eggstokk-kreft, sammenlignet vi RGS10 ekspresjon i IOSE cellene og serøs ovarialcancer cellelinje CAOV-3 (figur 1 B, C). RGS10 transkripsjon og protein var betydelig lavere i CAOV-3 celler sammenlignet med IOSE kontrollceller.
A. Eggstokkreft celler ble isolert fra pasient maligne ascites og RGS10 uttrykk nivåer ble sammenlignet med IOSE celler via western blotting. B.-C. RGS10 transkripsjon (B) og protein (C) ekspresjonsnivåer ble sammenlignet i CAOV-3 eggstokk-kreft-cellelinjer og IOSE benigne eggstokkene epitelceller ved hjelp QRT-PCR og western-blotting. D. Cisplatin dose responskurver ble bestemt med CellTiter-Blue levedyktighet analyser i A2780 og A2780-AD celler. E.-F. RGS10 transkripsjon (E) og protein (F) nivåene ble sammenlignet i kjemoresistent A2780-AD-celler i forhold til deres foreldre kjemosensitiv cellelinje A2780. **: P 0,01, ***: p. 0,0001
Vår forrige observasjon at RGS10 er undertrykt i kjemoresistent celler ble gjort i publiserte avskrift uttrykk datasett fra kjemosensitiv og kjemoresistent eggstokkreft celle parene [ ,,,0],10]. For denne studien, fikk vi A2780 eggstokkreft celler og deres multiresistent derivat A2780-AD. A2780-AD celler ble avledet fra foreldre A2780 celler via kronisk eksponering for lave doser cellegift, og dermed representerer en modell for ervervet chemoresistance [28], [29]. Vi bekreftet tap av følsomhet for cisplatin-indusert cytotoksisitet i A2780-AD celler, og viste at RGS10 transkripsjon og protein uttrykk er redusert i A2780-AD celler i forhold til foreldre A2780 celler (figur 1 D-F). Til sammen er RGS10 transkripsjon og protein uttrykk redusert i grunnskolen eggstokkreft celler og CAOV-tre kreftcellelinje i forhold til udødeliggjort på eggstokkene epitelceller, og i A2780 celler i forhold til foreldre celler. Vi fokuserte følgende studier på disse to sammenligninger.
Rgs10 Arrangører
Den menneskelige RGS10 genet ligger på den negative strand av kromosom 10 og inneholder to transkripsjonsstartsider, som gir opphav til to distinkte karakterutskrifter og genprodukter (figur 2A, B). Variantene har unike første eksoner, og dele fire vanlige eksoner. Jo lenger transkripsjon RGS10-1 gir opphav til et 21 kDa-protein RGS10a inneholdende 181 aminosyrer. Den korteste transkript varianten RGS10-2 gir opphav til et 19,5 kDa protein RGS10b består av 167 aminosyrer. Bare en enkelt RGS10 immunreaktivt bånd er detekterbar i ovarie-celler, og er i overensstemmelse med den forutsagte molekylvekt på RGS10a (figur 1). For å finne ut om begge transkripsjoner kan påvises og tilsvarende undertrykt i eggstokkreft, utførte vi QRT-PCR ved hjelp variant-spesifikke primere. Både lange og korte transkripsjoner ble påvist i alle cellelinjer ved QRT-PCR, men RGS10-2 ble uttrykt på langt lavere nivåer enn RGS10-1. RGS10-1 transkripsjon uttrykk i CAOV-3 eggstokkreft celler er ca 20% av uttrykket nivå sett i IOSE celler, kan sammenlignes med fold reduksjon observert for total RGS10 transkripsjon. Men, jo kortere avskrift, RGS10-2, er ikke signifikant forskjellig mellom de to cellelinjer (figur 2C). Videre ble RGS10-1 transkripsjonen ekspresjon nedregulert i kjemoresistent A2780-AD-derivat cellelinje, mens RGS10-2 nivåene ble øket (figur 2D). Disse resultatene tyder på at undertrykkelse av RGS10 avskrift i CAOV-3 og A2780-AD eggstokkreft celler er unik for RGS10-1, og antyder at mekanismen kan være rettet mot den unike promoter regionen.
A. Den RGS10 genet (geneID: 6001) ligger på den negative strand av kromosom 10 (NCBI tiltredelse: NC_000010.10) i posisjon -121.302.222 til -121.259.339. To transkripsjon varianter RGS10-1 (tiltredelse: NM_001005339) og RGS10-2 (tiltredelse: NM_002925) har blitt rapportert for RGS10 basert på alternative startsider som gir distinkte første eksoner. B. Den resulterende protein isoformene RGS10a (tiltredelse: NP_001005339) og RGS10b (tiltredelse: NP_002916) varierer etter bare de første 18 eller tre aminosyrer. Den konservert RGS domenet er understreket. C.-D. Uttrykket av total RGS10 transkripsjon (RGStot), ble RGS10-1, og RGS10-2 bestemt i IOSE og CAOV-3 celler (C) og i foreldre A2780 celler og kjemoresistent A2780-AD celler (D). **: P 0,01, ***: p. 0,0001
Dna metylering av Rgs10 Arrangører I eggstokkreft celler
Arrangører som inneholder G-C rike «CpG øyer» typisk har lave nivåer av metylering i normalt vev, men blir hypermethylated under kreft progresjon [30], [31], noe som tyder på at gener med CpG øyer i sine arrangører er potensielle mål for transkripsjonen lyddemping av promoter DNA metylering i kreftceller. Analyse av en region 1 kilobase oppstrøms transkripsjonsstartsider og 0,5 kilobase nedstrøms av startsidene til de RGS10-1 og RGS10-2 transkripsjoner avslører en slående forskjell i CG innhold og antall CpG dinukleotider mellom de to RGS10 promotorregioner ( Figur 3A). Promoterregionen av RGS10-1 inneholder 60-80% CG-innhold og omfatter omtrent 120 CpG-dinukleotider, mens den RGS10-2 promoteren inneholder mindre enn 30. I sammenligning analyse av RGS2 promoteren har CpG innhold lignende RGS10-1, mens arrangøren av RGS5 inneholder få CpG dinukleotider.
A. Promoterregionene av RGS10-1, RGS10-2, RGS2, og RGS5 ble analysert for CpG innhold ved hjelp av nettsiden Methprimer. For hver promoter, en region av genomisk DNA 1000 basepar 5 «for transkripsjonsstartsetet, og 500 basepar 3» i startsetet ble evaluert med hensyn på prosent GC-innhold og individuelle CpG-dinukleotider. Nukleotid posisjon vises langs x-aksen og GC innhold tegnes på y-aksen; CpG øyer er indikert med skyggelegging. Hver CpG dinucleotide er angitt med en hash mark under nucleotide nummerering, og transkripsjonsstart nettstedet er angitt med en pil. Forsterkning regioner for fire bisulfitt sekvense primerpar er indikert med vannrette streker (BS10-1, BS10-2, BS10-3, BS10-4). B. SKOV-3-celler ble behandlet med bærer eller den DNMT inhibitoren 5-Aza i ni dager, og transkripsjonsnivåer av de angitte RGS og GAPDH kontroller ble målt 3, 5, 7 og 9 dager med behandling. Den RGS transkripsjon ble normalisert til GAPDH, og tegnes i forhold til uttrykk i kjøretøy behandlet kontroller ved hvert tidspunkt.
Den høye konsentrasjonen av CpG dinukleotider i RGS10-1 arrangøren antyder at RGS10 genet er et potensielt mål for regulering av DNMT enzymer og kan undertrykkes i eggstokkreft progresjon med utvidet DNA metylering. For å teste denne spådommen, bestemt vi effekten av å hemme DNA metylering på RGS10 uttrykk. Den DNMT inhibitor 5-Aza 2’deoxycytidine (5-Aza) blokkerer tilsetning av metylgruppene til CpG-dinukleotider i nylig syntetisert DNA av prolifererende celler [32]. Således effekten av 5-Aza på DNA-metylering og genekspresjon er åpenbar etter flere runder med celledeling. Celler ble behandlet med bærer eller 5-Aza for en total på ni dager, og effekten på transkripsjonsnivåer av RGS10-1, RGS2 og RGS5 ble bestemt hver to dager. I samsvar med CpG island spådommer, betyr RGS5 uttrykk ikke forandre seg med 5-Aza behandling, mens RGS10-1 og RGS2 transkripsjonsnivåer er omtrent åtte ganger høyere hos 5-Aza behandlede celler i forhold til kjøretøy behandlede celler (Figur 3B). Dette resultatet tyder på at DNMT enzymer sannsynligvis bidra til undertrykkelse av RGS10-1 transkripsjonsnivåer.
Bisulfite sekvensering av Rgs10-1 Arrangører
Vi videre spådd at hyppigheten av metylering i RGS10-1 arrangører ville være høyere i eggstokkreft celler med lavere RGS10-1 uttrykk nivåer. Denaturert og un-denaturert cytosinrester er lett gjenkjennelig med behandling med sulfitt, som konverterer unmethylated, men ikke metylert, cytosin baser til uracil. Vi urfremført bisulfite sekvensering for å sammenligne frekvensen av DNA metylering ved RGS10-1 arrangører mellom foreldre A2780 og A2780-AD kjemoresistent celler. Bisulfite behandlet genomisk DNA ble forsterket ved hjelp av fire overlappende primerpar designet for å fullt ut dekke et område fra 1000 basepar oppstrøms 200 basepar nedstrøms RGS10-1 transcriptional starte nettstedet. Isolerte kloner av bisulfitt behandlet genomisk DNA ble sekvensert og innrettet til genomisk DNA ved bruk av BIQ Analyzer programvare for å bestemme den metylering status for hver CpG området i RGS10-1 promoteren i minst 10 kloner. Resultatene oppnådd med primerpar BS10-2 resultater er vist i figur 4, og de oppnådde resultater ved bruk av BS10-1, BS10-3, og BS10-4 er vist i Figur S1.
RGS10 promoter genomisk DNA ble justert med enkelte sekvenser av klonede PCR-produkter fra primerpar BS10-2 amplifikasjon av bisulfitt behandlet genomisk DNA fra de angitte cellelinjer. Sekvenser ble utsatt for kvalitetskontroll analyse og justert ved hjelp BIQ Analyzer programvare. I denne konvensjonelle «lollipop» representasjon, er hver CpG stedet i regionen (-121 303 076 → -121,302,726) vises med en sirkel; fylte sirklene er denaturert, ubesatte sirkler er unmethylated. Lollipop representasjoner av metylering status for hver CpG nettsted i RGS10-1 Promoterregionene forsterket av BS10-1, BS10-3, og BS10-4 primer sett er tilgjengelig i saksdokumenter.
Bruke bisulfitt sekvense data, bestemt vi hyppigheten av metylering av CpG nettsteder over hele RGS10-1 arrangøren i A2780 og A2780-AD celler (figur 5, Tabell S1). Hyppigheten av metylering ved CpG nettsteder over hele RGS10-1 arrangøren var lav; flertallet av CpG nettstedene var helt unmethylated eller ble metylert i 10-20% av kloner. Et unntak var dinucleotide i posisjon -121 030 162, som var høyt metylert i begge cellelinjer. Over hele promoter, frekvensen av metylering var noe høyere i A2780-AD celler enn i foreldre A2780 celler (figur 5A, innfelt). Denne forskjellen var mer uttalt i flere tilstøtende CpG steder i regionen -121.303.155 → -121,303,007 (indikert med stiplede horisontale linjen, figur 5A). Den generelle hyppigheten av metylering over denne regionen ble fordoblet i kjemoresistent cellene i forhold til foreldre celler (figur 5A, innfelt). Disse data antyder at lokal forbedret DNA metylering i et område omtrent 800 basepar oppstrøms for transkripsjonsstartsetet korrelerer med tap av RGS10 ekspresjon i ervervet chemoresistance. Vi neste utført samme analyse på RGS10-1 arrangører i IOSE og CAOV-3 celler. Metylering priser over hele RGS10-1 arrangøren og i regionen er identifisert ovenfor var lik i IOSE og CAOV-3 celler (figur 5B).
