Abstract
Cell invasjonen er en viktig mekanisme for kreft metastasering og malignitet. Matrise-metalloproteinase-9 (MMP-9) er en viktig proteolytisk enzym som er involvert i kreftcellen invasjon prosess. Høye uttrykk nivåer av MMP-9 i magekreft positivt korrelert med tumor aggressivitet og ha en betydelig negativ korrelasjon med pasientenes overlevelse ganger. Nylig mekanismer undertrykke MMP-9 av fytokjemikalier har blitt stadig mer etterforsket. Chrysin, en naturlig forekommende kjemisk i planter, er blitt rapportert å undertrykke tumormetastase. Men effekten av chrysin på MMP-9 uttrykk i magekreft har ikke blitt godt undersøkt. I denne studien har vi testet effekten av chrysin på MMP-9 uttrykk i magekreftceller, og bestemt dens underliggende mekanisme. Vi undersøkte effekten av chrysin på MMP-9 uttrykk og aktivitet via RT-PCR, zymografi, arrangøren studie, og western blotting i menneskelige magekreft AGS celler. Chrysin hemmet forbol-12-myristat 13-acetat (PMA) -indusert MMP-9-ekspresjon i en doseavhengig måte. Ved hjelp av AP-1 lokkefugl oligodeoksynukleotider, bekreftet vi at AP-en var den avgjørende Transkripsjonsfaktor for MMP-9 uttrykk. Chrysin blokkert AP-en via undertrykking av fosforylering av c-Jun og c-Fos gjennom å blokkere JNK1 /2 og ERK1 /2 veier. Videre AGS-celler forbehandlet med PMA viste markert forbedret invasivitet, som delvis ble opphevet ved chrysin og MMP-9-antistoffet. Våre resultater tyder på at chrysin kan utøve i det minste en del av sin anticancer virkning ved regulering av MMP-9-ekspresjon ved undertrykkelse av AP-1-aktivitet ved hjelp av en blokk av de JNK1 /2 og ERK1 /2 signalveier i magekreft AGS celler.
Citation: Xia Y, Lian S, Khoi PN, Yoon HJ, Joo YE, Chay KO, et al. (2015) Chrysin hemmer tumor Arrangøren-Induced MMP-9 Expression ved å blokkere AP-en via Undertrykkelse av ERK og JNK Pathways i Gastric kreftceller. PLoS ONE 10 (4): e0124007. doi: 10,1371 /journal.pone.0124007
Academic Redaktør: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, UNITED STATES
mottatt: 5 oktober 2014; Godkjent: 09.03.2015; Publisert: 15 april 2015
Copyright: © 2015 Xia et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av et forskningsstipend (0720570) fra National Cancer Center (www.ncc.re.kr), Basic Science Research Program stipend gjennom stiftelsen av den nasjonale forsknings Korea (NRF) finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (2010-0009910, www.moe.go.kr), og en medisinsk Research Center (2012-000-9442) stipend fra den koreanske Science and Engineering Foundation ( www.nrf.re.kr). Alle ovennevnte organer hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
mage~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP rangerer øyeblikket på andreplass i den globale kreftdødelighet, med anslagsvis 990.000 nye tilfeller og 738,000 kreftdødsfall som følge verdensbasis årlig, selv om forekomsten av magekreft har sunket de siste tiårene [1,2]. Distant organ eller vev metastase er et tegn på dårlig prognose hos pasienter med magekreft. Metastase er den mest fatale karakteristikken av ondartede svulster, sto for mer enn 90% av tumorrelatert dødelighet [2]. Det har vist seg at kjemoterapi og strålebehandling ikke i betydelig grad kan forlenge og forbedre livskvaliteten til pasientene i de tilfeller [3,4]. Tumorceller metastase er en meget kompleks prosess som består av proliferasjon, migrering, invasjon, og den påfølgende adhesjon og angiogenese i andre organer eller vev [3].
Siden invasjon er en av de grunnleggende egenskaper av ondartede kreftceller, kontrollerende invasjon, er et viktig terapeutisk mål. Cell-ekstracellulære matriks (ECM) interaksjoner, frakobling av intercellulær adhesjon, nedbrytning av ECM, og invasjonen av lymfe og blodårene er viktige skritt i kreft invasjon og metastasering [5]. Tumorinvasjon krever en økt ekspresjon av matriks-metalloproteinaser (MMP) [6]. MMP’er, en familie av sink-avhengige endopeptidaser som induserer kreft celle invasjon og spredning, spiller avgjørende roller i metastaser ved nedbrytning av ECM og basalmembranen [7]. Matrise-metalloproteinase-9 (MMP-9), også kjent som 92 kDa-typen IV kollagenase eller gelatinase B, er en av de viktigste MMPs, og blir kodet av MMP-9-genet hos mennesker [8]. Det har blitt rapportert at overekspresjon av MMP kan øke tumorcelle løsrivelse og metastasering, som er forbundet med kreft og fattige kliniske resultater i ulike kreftformer, inkludert magekreft [9,10].
På grunn av funksjonen til MMP- 9 i løpet av malignitet, er undertrykkelse av MMP-9 nivåer en viktig strategi for kontroll av kreft. I de senere år har stadig større oppmerksomhet blitt fokusert på å finne en MMP-9-inhibitor, spesielt fra naturlig forekommende materialer. Kim et al. oppdaget at silibinin inhiberer PMA-induserte MMP-9 uttrykk gjennom undertrykkelse av ERK-fosforylering i MCF-7 humane brystcancerceller [11]. Flere nylig, Khoi et al. rapporterte at (-) – Epigallocatechin-3-gallate blokker nikotin-indusert MMP-9 uttrykk og invasivitet ved undertrykkelse av NF-kB og AP-1 i endotelceller ECV304 celler [12]. Chrysin, 5,7-dihydroxyflavone, en type av naturlig forekommende flavonoid, har vært kjent for å hemme angiogenese og metastase [13,14]. Lin et al. viste at chrysin undertrykker IL-6-indusert angiogenese gjennom nedregulering av den løselige IL-6 reseptor /gp130 /JAK1 /STAT3 /VEGF-signaleringsreaksjonsveien [13]. Nylig er det rapportert at chrysin kan styrke caspase-avhengig apoptose regulert av TRAIL i HCT 116 cellelinje og CNE1 celler [15]. Yang et al. oppdaget at chrysin trykkes celle invasjon i en doseavhengig måte i TNBC celler. Videre chrysin reduserer metastaserelaterte molekyler vimentin, snegl og dorsk, og blokkerer Akt signalveien [16]. Men de inhiberende virkninger av chrysin på MMP-9, samt den mekanisme, er ikke blitt godt undersøkt, særlig i magekreftceller. I denne studien undersøkte vi chrysin effekter på PMA-indusert MMP-9 uttrykk i magekreft, og avslørte sin underliggende mekanisme.
Materialer og metoder
Cellekultur og dyrkningsforhold
AGS humane magecancercellelinje ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Cellene ble dyrket i RPMI-1640 supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 0,6% penicillin-streptomycin ved 37 ° C i en atmosfære inneholdende 5% CO
2. For å bestemme effekten av chrysin på PMA indusert MMP-9-ekspresjon ble cellene forbehandlet med forskjellige konsentrasjoner av chrysin og deretter behandlet med PMA. Nivået av MMP-9 budbringer RNA (mRNA) ble bestemt ved revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) -analyse. Rollen til de spesifikke signalveier i PMA-induserte MMP-9-ekspresjon ble undersøkt ved forbehandling av AGS-celler med ERK 1/2 inhibitor PD98059 (New England Biolabs, Beverly, MA), JNK-inhibitor SP600125 (Calbiochem, La Jolla , CA), p38 MAPK inhibitor SB203580 (Calbiochem, La Jolla, CA), og chrysin (Sigma Aldrich, USA) for en time før stimulering med PMA.
Celleviabilitet
Cells ( 5 x 10
3) ble inkubert i en 96-brønns plate i RPMI med 10% FBS inneholdende 0-100 mM chrysin i 24 timer, og cellerespirasjon ble bestemt ved en etablert 3- [4,5-dimetyltiazol-2- -yl] -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT, Sigma-Aldrich) assay. Etter inkuberingen, 10 ul 5 mg /ml MTT ble tilsatt til hver brønn i 96-brønners plater og inkubert ved 37 ° C i 2 timer. Formazangruppen granuler som ble oppnådd ble oppløst i 100% dimetylsulfoksyd, og absorbansen ved 570 nm ble påvist med en 96-brønns ELISA-leser (Biotek Inc., Winooski, VT, USA).
Gelatin zymografi
celler forbehandlet med eller uten Chrysin i 1 time ble behandlet med 100 nM PMA i 20 timer. Etter inkubasjon samles vi media supernatanten og utført gelatin zymografi å sjekke MMP-9 aktivitet. Deretter ble mediet blandet med et likt volum av 2P-9 activityrazolium b [62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 25% glyserol, 4% SDS og 0,01% bromfenolblått] og fylt i en 7,5% akrylamid: akrylamid (29: 1; Bio-Rad, USA) gel inneholdende 625 pg /ml gelatin (Sigma). Etter elektroforese ble gelen vasket med 2,5% Triton X-100 tre ganger (20 minutter per gang), deretter inkubert i 24 timer ved 37 ° C, i inkuberingsbuffer [50 mM Tris (pH 7,5), 100 mM NaCl, 5 mM CaCl
2, og en mikrometer ZnCl
2]. Geler ble farget med Coomassie Brilliant Blue R250 (Bio-Rad, USA) i 3 timer, og deretter skylles. Proteolytisk aktivitet ble reflektert som klare bånd mot blå bakgrunn av farget gelatin. Last kontroll for gelatin zymografi: Coomassie Brilliant Blue R-250 beis for 10% natriumdodecylsulfat polyakrylamidgel uten gelatin, for å vise lik mengde av supernatanten ble fylt på hvert kjørefelt
Revers transkripsjon-PCR
Totalt RNA ble ekstrahert fra AGS celler ved anvendelse av TRIzol reagens (Invitrogen). Ett pg av total RNA ble benyttet for første-tråd som er komplementær DNA-syntese ved anvendelse av tilfeldige primere og M-MLV-transkriptase (Promega). Den komplementære DNA ble underkastet PCR-amplifikasjon med primersett for GAPDH og MMP-9 ved hjelp av en PCR masterblanding løsning (intron, Korea). De spesifikke primere-sekvensene var som følger: GAPDH forstand, 5′-TTG TTG CCA TCA ATG ACC CC-3 «og GAPDH antisense, 5′-TGA CAA AGT GGT CGT TGA GG-3′ (836 bp); og MMP-9 forstand, 5»- AAG TGG CAC CAC CAC AAC AT 3 «og MMP-9-antisens, 5′-TTT CCC ATC AGC ATT GCC GT-3′ (497 bp); c-Jun forstand, 5»-GGA AAC GAC CTT CTA TGA CGA TGC CCTCAA-3 «, og c-Jun antisense, 5’GAA CCC CTC CTG CTC ATC TGT CAC GTT CTT-3′ (287bp); c-Fos forstand, 5»-CAG TCA GAT CAA GGG AAG CCA CAG ACA TCT-3 «og c-Fos antisense, 5′-GAA TAA GAT GGC TGC AGC CAA ATG CCG CA-3» (246bp). PCR-betingelsene var som følger:. Denaturering ved 94 ° C i 30 sekunder, annealing ved 52 ° C i 20 sekunder og forlengelse ved 72 ° C i 30 sekunder
Måling av MMP-9-promoteraktivitet
transkripsjonsregulering av MMP-9 ble undersøkt ved transient transfeksjon av en MMP-9-promoter-luciferase reporter-konstruksjonen (pGL4-MMP-9). Plasmidet pGL4-MMP-9 promoter (spenner nukleotider fra -925 til 13) ble vennlig levert av Dr. Young-Han Lee (Konkuk University, Korea). AGS celler ble sådd og dyrket inntil de nådde 70% samløpet. Deretter ble de pGL4-MMP-9-promotor plasmider transfektert inn i cellene ved hjelp av Fugene 6 (Promega, USA) i henhold til produsentens protokoll. PRL-TK ble transfektert som en intern kontroll. Celler ble inkubert i transfeksjonen medium i 12 timer og deretter behandlet med PMA i 4 timer. Effektene av chrysin for MMP-9-promoter-aktivitet ble bestemt ved forbehandling av cellene med chrysin i 1 time før tilsetning av PMA. De ko-transfeksjon studier ble utført i nærvær eller fravær av en ekspresjonsvektor som koder for den dominant negativ mutant MEK-1 (PMCL-K97M), dominant negativ mutant JNK (PMCL-TAM67), eller dominant negativ mutant p38 MAPK (PMCL-MP38 ) som ber ble gitt av Dr. NG Ahn (Universitetet i Colorado-Boulder, CO), av Dr. M.J. Birrer (NCI, Rockville, MD), og av Dr. J. Han (Scripps Research Institute, CA), henholdsvis. Cellene ble høstet med en cellekultur lysereagensen (Promega, USA), og luciferase aktiviteter ble bestemt ved bruk av et luminometer (Centro XS lb960 mikro luminometer, Berthold Technologies, USA) i henhold til produsentens protokoll.
Transient transfeksjon av AP-1 reporter
AP-1 luciferase reporter plasmid ble kjøpt fra Clontech (Palo Alto, California, USA). Når AGS cellene nådde 60-70% samløpet, ble de vasket med Opti-MEM medium og transfektert med en PGL-3 vektor som inneholder AP-en reporter ved hjelp Fugene 6 (Promega) i henhold til produsentens protokoll. Reporter-transfekterte celler ble forbehandlet med chrysin i 1 time og deretter behandlet med 100 nM PMA i 4 timer og luciferase-aktivitet ble målt ved anvendelse av et luminometer.
Transfeksjon av AP-1 lokke oligodeoksynukleotider
basert på AP-en bindingssetet ATGAGTCAT, vi designet AP-en lokkefugl phosphorothioated dobbeltrådet oligo deoksynukleotid (ODNs) som følger, 5′-CGsT CTT CTG AGT CAT GAA TTC ATG ACT CAG AAG ACsG-3 «, og tre «-GsCA GAA GAC TCA GTA CTT AAG TAC TGA GTC TTC TsGC-5». Når AGS cellene vokste til 60-70% konfluens, AP-1 og ODNs pGL4-MMP-9-promotor Plasmidene ble ko-transfektert inn i celler ved anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) i henhold til produsentens protokoll. Etter inkubering i 20 timer ble transfekterte celler behandlet med PMA i 4 timer og luciferase-aktivitet ble målt ved anvendelse av et luminometer.
Western blot-analyse
AGS-celler behandlet med PMA ble vasket i fosfat bufret saltløsning (PBS), frittliggende ved hjelp av Trypsin-EDTA-buffer og lagret ved -70 ° C inntil behov. Den cellulære protein ble ekstrahert med RIPA-buffer [1% NP-40, 0,5% natriumdeoksykolat, 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS)] og protease-inhibitorer (aprotinin, leupeptin, phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), benzamidin, trypsin inhibitor, natriumortovanadat ). Femti mikrogram proteiner ble deretter separert ved 10% SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese og overført til Hybond-P-membraner (Amersham Pharmacia Biotech). Membranene ble blokkert i en TBST oppløsning inneholdende 5% skummet melk, inkubert med et primært antistoff i en blokkerende oppløsning over natten ved 4 ° C og vasket tre ganger med 0,1% Tween-20 i Tris-bufret saltvann (TBST) ved 10 minutters intervaller . Pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) ble brukt til å detektere de immunoreaktive proteiner ved kjemiluminescens. Følgende antistoffer ble brukt: anti-fosfor-P44 /42 MAPK (ERK-1/2) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), anti-fosfor-JNK /SAPK (Cell Signaling Technology), anti-MMP- 9 (Cell Signaling Technology), anti-fosfor-c-Fos (Cell Signaling Technology), og anti-fosfor-c-Jun (Cell Signaling Technology). Den totale proteinnivåer ble analysert ved vasking av blottet membran med en strippeoppløsning bestående av 100 mM 2-merkaptoetanol, 2% SDS, og 62,5 mM Tris-HCl (pH 6,7) i 30 minutter ved 50 ° C, og membranen ble deretter re-analysert med enten anti-β-aktin (Cell Signaling Technology), anti-total ERK1 /2 (Cell Signaling Technology), anti-total JNK /SAPK (Cell Signaling Technology), anti-c-Fos (Santa Cruz Biotechnology , Inc., CA, USA) eller anti-c-Jun (Santa Cruz).
Matrigel invasjonen assay
celle~~POS=TRUNC invasjonen analysen ble utført ved hjelp av 10-brønnen chemotasis kammer (Neuro probe, Gaithersburg, Maryland, USA) med 8 um porestørrelse membran (Neuro probe) med 10% FBS inneholdende RPMI som kjemoattraktant i det nedre kammer. AGS-celler (10
5 i 280 ul) ble tilsatt til det øvre kammer med PMA i nærvær av chrysin, MMP-9-antistoffet eller ikke-spesifikk IgG, og inkubert for å invadere den Matrigel i 24 timer. For å bestemme effekten av chrysin og signalerings inhibitorer på PMA-induserte celle invasjon, AGS cellene ble pre-inkubert med chrysin, curcumin, PD98059, eller SP600125 i 1 time, og inkubert med PMA for 24-timers periode invasjon. De ikke-invaderende celler på den øvre overflate av hver membran ble fjernet fra kammeret, og de invaderende celler på den nedre overflate av hver membran ble farget med Quick-Diff flekk kit (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) . Etter to vannvaskinger ble kamrene tillatt å lufttørke. Antallet av invaderende celler ble tellet ved bruk av et fasekontrastmikroskop.
statistikker og
Data er vist som gjennomsnitt ± SD, og representerer gjennomsnittet av minst tre separate forsøk utført i tre eksemplarer. Forskjeller mellom hver to datasettene ble bestemt ved t-tester. Forskjeller beskrevet som betydelig i teksten samsvarer med
P
. 0,05
Resultater
Hemmende effekt av chrysin på PMA stimulert MMP-9 uttrykk
for å undersøke den hemmende virkningen av chrysin mot oppregulering av MMP-9, ble AGS-celler forbehandlet med chrysin inkubert med PMA, og gelatin zymografi og RT-PCR-analyse ble utført. Som vist i figur 1A, PMA-stimulerte MMP-9 ble inhibert med Chrysin på en dose-avhengig måte som vist til ved gelatin zymografi analysen. Før vårt eksperiment, enten direkte chrysin inhiberte aktiviteten av MMP-9 eller inhiberte ekspresjon av MMP-9 ble fortsatt ukjent. For å besvare dette spørsmålet, vi co-inkubert AGS-utskilt MMP-9 med chrysin i 3 timer, og gelatin zymografi ble utført for å kontrollere det endelige nivået av MMP-9 aktivitet. Som figur 1B viser, kan chrysin ikke påvirke utskilt MMP-9 aktiviteter. Så hypotese vi at inhiberingen av chrysin mot MMP-9 kan være via undertrykkelse av MMP-9 uttrykk. For å bekrefte denne hypotesen, revers transkripsjonen PCR og MMP-9 promoter analysene ble utført for å sjekke MMP-9 transkripsjonsnivåer. Som vist i figur 1C, etter å ha blitt behandlet med chrysin, redusert PMA-induserte MMP-9 mRNA på en doseavhengig måte. Videre ble MMP-9-promoteren luciferase-aktivitet inhiberes ved Chrysin på en doseavhengig måte (Fig 1 D). Og western blotting viste også hemmende effekt chrysin på MMP-9 uttrykk (Fig 1E). Konsentrasjonene av chrysin anvendt i denne studien ikke påvirke cellenes levedyktighet (fig 1F). Disse resultatene indikerer at chrysin inhiberer MMP-9 aktivitet i AGS-celler via en reduksjon av den transkripsjonelle effektivitet.
totalt 2 x 10
6-celler forbehandlet med de angitte konsentrasjoner av chrysin i 1 time, ble behandlet med 100 nM PMA i 20 timer. Etter inkubasjon ble cellekulturmedier supernatanten oppsamlet og gelatin zymografi ble utført for å analysere MMP-9 aktivitet (A). De cellekulturmedier inneholdende AGS-celler utskilte MMP-9 ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av chrysin i 37 ° C i 3 timer, deretter gelatin zymografi ble utført for å analysere de endelige MMP-9 aktiviteter (den første bane, å laste en kontroll, inneholdt celledyrkingsmedier supernatant uten inkubering med chrysin) (B). -Celler forbehandlet med de angitte konsentrasjoner av chrysin i 1 time og ble behandlet med 100 nM PMA i 4 timer. Etter inkubering, ble RT-PCR utført for å analysere MMP-9-mRNA. #
P
0,05 versus kontroll; *
P
0,05 versus bare PMA (C). Cellene ble transient transfektert med en pGL4-MMP-9-promoteren reporter-konstruksjonen. De transfekterte celler ble forbehandlet med de angitte konsentrasjoner av chrysin i 1 time, deretter ble inkubert med 100 nM i 4 timer, på hvilket punkt luciferase-aktiviteten ble bestemt ved anvendelse av et luminometer. #
P
0,05 versus kontroll; *
P
0,05 versus bare PMA (D). -Celler forbehandlet med de angitte konsentrasjoner av chrysin i 1 time og ble behandlet med 100 nM PMA i 8 timer. Etter inkubasjonen ble western bolt utført for å analysere MMP-9 proteinnivå. #
P
0,05 versus kontroll; *
P
0,05 versus bare PMA (E). Cellene ble ko-inkubert med 0-80 uM chrysin i 24 timer, og deretter deres viabilities ble testet ved hjelp av MTT-metoden. *
P
0,05 versus kontroll (uten chrysin) (F). Dataene representerer gjennomsnitt ± SD fra tredoble målinger.
Rolle AP-1 i PMA-indusert MMP-9 uttrykk
Som rapportert av tidligere litteratur, AP-1 er Det viktigste transkripsjonsfaktor i MMP-9 uttrykk [17]. I denne studien, for å bekrefte at AP-en er kritisk nødvendig i dette kurset, ansatt vi en AP-en lokkefugl phosphorothioated dobbeltrådet oligodesoksynukleotid (ODNs) og pGL3-AP-1 luciferase plasmid til co-transfeksjon inn i AGS celler. De ko-transfekterte celler ble behandlet med PMA og luciferase-aktivitet ble bestemt ved anvendelse av et luminometer. Som vist i figur 2A, ble PMA-induserte MMP-9-promotor luciferase-aktivitet inhiberes av AP-1 lokkefugl. Konsekvent, AP-1 decoy også hemmet PMA-indusert MMP-9 mRNA uttrykk (Fig 2B). Det ble vist at å banke ned AP-en komponent c-Fos og c-Jun også redusert PMA-indusert MMP-9 uttrykk (Fig 2C). Videre er curcumin, et AP-1-inhibitor, som også ble anvendt for å undersøke rollen av AP-1 i PMA-induserte MMP-9 uttrykk. Når RT-PCR-data illustrerer, curcumin hemmet PMA-induserte MMP-9-ekspresjon i en doseavhengig måte (figur 2D). De ovenfor angitte data antyder at det AP-1 er en vesentlig faktor i MMP-9 uttrykk. Etter å demonstrere den avgjørende rollen til AP-1 i de høye nivåene av MMP-9-ekspresjon, har vi antatt at mekanismen for chrysin inhibering av MMP-9-ekspresjon var gjennom undertrykkelse av AP-1-aktivitet. Deretter ble AGS celler transfektert med AP-1 luciferaserapportørplasmid plasmider forbehandles med chrysin, og deretter stimulert av PMA. Som vist i figur 2E, chrysin trykkes PMA-indusert AP-1lucifease aktivitet på en doseavhengig måte, noe som indikerte at chrysin har en evne til å redusere AP-1-aktivitet.
AP-1 attrappen oligonukleotid ble ko -transfected med en pGL4-MMP-9 promoter i AGS celler. Etter inkubering med 100 nM PMA i 4 timer, ble MMP-9-promoteren luciferaseaktivitet undersøkt ved hjelp av et luminometer (A), og MMP-9 mRNA ble undersøkt ved hjelp av RT-PCR (B). #
P
0,05 versus kontroll; *
P
0,05 versus bare PMA. C-Jun og c-Fos siRNA transfekterte AGS-celler ble inkubert med 100 nM PMA i 4 timer, og etter høsting celle MMP-9 mRNA ble undersøkt ved hjelp av RT-PCR. #
P
0,05 versus kontroll; *
P
0,05 versus bare PMA (C). AGS-celler forbehandlet med den angitte konsentrasjon av curcumin i 1 time og ble inkubert med 100 nM PMA i 4 timer. Etter inkubasjonen ble MMP-9 mRNA i cellelysatene bestemt ved RT-PCR. #
P
0,05 versus kontroll; *
P
0,05 versus bare PMA (D). De pGL3-AP-1-transfekterte celler ble forbehandlet med de angitte konsentrasjoner av chrysin i 1 time, og deretter ble inkubert med 100 nM PMA i 4 timer, og AP-1 luciferaseaktivitet ble bestemt ved anvendelse av et luminometer. #
P
0,05 versus kontroll; *
P
0,05 versus bare PMA (E). AGS-celler forbehandlet med de angitte konsentrasjoner av chrysin i 1 time ble inkubert med 100 nM PMA i 4 timer. Etter inkubasjonen ble c-Jun og c-Fos mRNA i cellelysatene bestemt ved RT-PCR (F). -Celler forbehandlet med de angitte konsentrasjoner av chrysin ble inkubert med 100 nM PMA, og cellelysater ble analysert for fosforylert c-Jun (G), fosforylert c-Fos (H), total c-Jun og total c-Fos ved western blot analyse. #
P
0,05 versus kontroll; *
P
0,05 versus bare PMA. Ovennevnte data representerer gjennomsnitt ± SD fra tredoble målinger.
Chrysin hemmer PMA-indusert MMP-9 uttrykk ved å hemme transkripsjonsfaktor AP-en via undertrykkelse av c-Jun og c-Fos fosforylering
det er vel kjent at c-Jun og c-Fos er komponenter av AP-1 veien [18]. Vi ønsket å bestemme mekanismen bak chrysin sin hemmende effekt på AP-1, og undersøkt om chrysin faktisk utøvet sin virkning på c-Jun og c-Fos. Vi målte mengden av total mRNA av både c-Jun og c-Fos ved RT-PCR. Som vist i figur 2F, hadde chrysin ikke hemmer uttrykket nivåer av c-Jun og c-Fos-mRNA. Ved siden av, for å teste om chrysin hemmer aktivering av c-Jun og c-Fos, ble Western blotting utført for å overvåke fosforylert c-Jun og c-Fos. Fig 2G og 2F viser at chrysin gjorde undertrykke PMA-induserte c-Jun og c-Fos fosforylering på en doseavhengig måte.
Chrysin hemmer c-Jun og c-Fos fosforylering ved å blokkere JNK og ERK signale pathway
Vi neste undersøkt hvordan chrysin trykt c-Jun og c-Fos fosforylering. På grunn av den viktige rolle MAPK spiller i aktiveringen av AP-1, undersøkte vi rollen av MAPK-reaksjonsveien i MMP-9 uttrykk. Som vist i figur 3A, blant MAPK-inhibitorer, PD98059 (ERK1 /2-inhibitor), SP600125 (JNK1 /2-inhibitor), og SB203580 (p38 MAPK-hemmer), bare PD98059 og SP600125 var i stand til å inhibere PMA-induserte MMP-9 uttrykk , noe som indikerte at ERK1 /2 og JNK1 /2 veier kan være avgjørende for PMA-induserte MMP-9 uttrykk. Videre med MEK-dominant negativ plasmid PMCL-K97M, JNK-dominant negativ plasmid PMCL-TAM67 og p38 MAPK-dominant negativ plasmid PMCL-MP38, bekreftet vi de kritiske roller ERK og JNK i MMP-9 uttrykk i magekreft AGS celler (figur 3b). Dessuten, som vist i figur 3C, ERK1 /2 og JNK1 /2 er kritisk kreves for AP-1-aktivering av PMA, demonstrert gjennom vårt eksperiment med MEK og JNK dominant negative plasmider. Vi neste sjekket roller JNK1 /2 og ERK1 /2 i c-Jun og c-Fos aktivering. Som vist i figur 3D, SP600125 og PD98059 trykkes PMA-induserte c-Jun og c-Fos fosforylering, henholdsvis, noe som indikerer at JNK1 /2 er kritisk oppstrøms av c-Jun, mens ERK1 /2 er kritisk oppstrøms av c-Fos. Siden vi oppdaget at JNK1 /2 og ERK1 /2 Dato viktige roller i MMP-9-ekspresjon via AP-1, hypotese vi at chrysin kan arbeide gjennom en inhibering av JNK1 /2 eller ERK1 /2 for å undertrykke MMP-9 uttrykk. For å bekrefte vår hypotese, ble western blotting utført for å bestemme effekten av chrysin på JNK1 /2 eller ERK1 /2 fosforylering. Som figur 3E og 3F show, PMA behandling førte til en bemerkelsesverdig økning i JNK1 /2 og ERK p42 /44 fosforylering; imidlertid, i nærvær av chrysin, PMA-induserte JNK1 /2 og ERK1 /2 fosforylering ble inhibert på en doseavhengig måte.
celler forbehandlet med en konsentrasjon på 50 uM PD98059 (PD), 50 uM SP600125 (SP ) eller 20 pM SB203580 (SB) i 1 time og ble inkubert med 100 nM PMA 4 timer. Etter inkubasjonen ble MMP-9 mRNA i cellelysatene bestemt ved RT-PCR. #
P
0,05 versus kontroll; *
P
0,05 versus bare PMA (A). Ekspresjonsvektorer som koder en dominant negativ mutant MEK (K97M), mutant JNK (TAM67), eller mutant p38 MAPK (MP38) var co-transfektert med pGL4-MMP-9 promoter konstruerer inn AGS celler. Etter inkubering med 100 nM PMA i 4 timer, ble luciferase-aktivitet bestemt ved anvendelse av et luminometer. Dataene representerer gjennomsnittlig ± SD fra triplikate målinger. #
P
0,05 versus kontroll; *
P
0,05 versus bare PMA (B). Expression PMCL tom vektor, som koder for en dominant negativ mutant MEK (K97M) eller mutant JNK (TAM67) ble ko-transfektert med pGL3-AP-1 luciferase bygge inn AGS celler. Etter inkubering med 100 nM PMA i 4 timer, ble luciferase-aktivitet bestemt ved anvendelse av et luminometer. Dataene representerer gjennomsnittlig ± SD fra triplikate målinger. #
P
0,05 versus kontroll; *
P
0,05 versus bare PMA (C). AGS-celler forbehandlet med 50 uM PD98059, 50 uM SP600125, og 20 uM SB203580 ble inkubert med 100 nM PMA, og cellelysater ble analysert for fosforylert c-Jun og fosforylert c-Fos ved western blot-analyse. #
P
0,05 versus kontroll; *
P
0,05 versus bare PMA (D). AGS-celler forbehandlet med angitte konsentrasjon av chrysin ble inkubert med 100 nM PMA, og cellelysater ble analysert for den fosforylerte JNK1 /2 og fosforylerte p42 /44 ved western blot-analyse. #
P
0,05 versus kontroll; *
P
. 0,05 versus bare PMA (E og F)
Effekt av chrysin på celle invasivitet
Det har vært kjent at høye nivåer av MMP -9 uttrykk er viktige for den invasive fenotype av cancerceller. For å undersøke effekten av chrysin på PMA-indusert celle invasjon, undersøkte vi celle invasjon gjennom en modifisert Boyden invasjon kammeret. AGS celler inkubert i PMA resulterte i et økt antall invaderte celler som passerte gjennom den kunstige matrigel. Imidlertid, i nærvær av chrysin eller en MMP-9-antistoffet, antallet invaderte celler ble redusert, noe som indikerer chrysin kan undertrykke PMA-induserte celle invasivitet ved å inhibere MMP-9-ekspresjon (Fig 4A og 4B). I tillegg viser figur 4C chrysin redusert PMA-induserte AGS invasjon i en doseavhengig måte. Deretter undersøkte vi effekten av signal inhibitoren på PMA-induserte AGS celle invasjon. Som vist i figur 4D, chrysin, curcumin, PD98059 og SP600125 hemmet celle invasjon indusert av PMA, noe som indikerer at chrysin sannsynligvis inhiberer PMA-induserte MMP-9 via AP-1-undertrykkelse, noe som resulterer i å blokkere JNK1 /2 og ERK1 /2 veier .
Celler ble inkubert med 50 nM PMA i nærvær eller fravær av 30 pM chrysin eller 200 ng /ml MMP-9-antistoffet i BioCoat Matrigel apparatur i 24 timer (A og B). Celler ble inkubert med 50 nM PMA i nærvær av 0-50 pM chrysin (C). Celler ble inkubert med 50 nM PMA i nærvær av 30 uM chrysin, 20 uM curcumin, og enten 30 pM PD98059 (PD) eller 30 pM SP600125 (SP) (D). Etter inkubering ble cellene invaderte undersiden av kamrene og ble tellet ved bruk av et fasekontrastmikroskop lys etter farging med en Diff-Quick Stain Kit. Dataene representerer gjennomsnittlig ± SD fra triplikate målinger. #
P
0,05 versus kontroll; *
P
. 0,05 versus bare PMA
Diskusjoner
Naturlig forekommende forbindelser med anti-kreft aktiviteter forstyrre tumor utvikling og progresjon av kreft ved å hemme ulike mekanismer, inkludert celle migrasjon, invasjon og metastasering. Chrysin, en naturlig flavonoid vidt finnes i mange planteekstrakter, honning og propolis, har chemopreventive egenskaper som anti-proliferative og pro-apoptose aktiviteter mot ulike kreftformer [19,20]. Men anti-invasjons egenskaper chrysin har ikke vært godt studert i mage kreftceller. Det er velkjent at MMP’er er kraften bak ødeleggelse av den ekstracellulære matriks, så vel som de viktigste induserer celle invasivitet. Vi undersøkte hemmende effekter av chrysin på MMP uttrykk i mage kreftceller. Chrysin hemmet MMP-9-ekspresjon (Fig 1) og andre MMP’er slik som MMP-2 og MMP-7 (data ikke vist). Den reguleringsmekanisme ved chrysin kan være avhengig av hver enkelt MMP, og i denne studien vi fokusere på MMP-9 regualtion.
PMA, forbol-12-myristat-13-acetat, en protein-kinase-aktivator, er ofte brukt som et biomedisinsk forskning verktøy i modeller for kreftutvikling. I denne studien, oppdaget vi PMA øket MMP-9 aktivitet ved oppregulering av dets ekspresjon nivå. I nærvær av chrysin, PMA-induserte MMP-9 ble redusert i en chrysin-doseavhengig måte (figur 1A).
