Abstract
Formålet med studien er å identifisere N-sukkerprofilerings endringer knyttet til magekreft og utforske effekten av kjerne fucosylation på biologisk atferd av menneskelige mage kreftceller. Totalt 244 emner, inkludert magekreft, magesår og friske kontrollgruppen ble rekruttert. N-glykan profilering fra serum og total proteiner i mage vev ble analysert ved DNA-sekvens-assistert fluorophore assistert kapillær elektroforese. Den overflod av total kjerne-fucosylated rester og ekspresjonen av enzymer involvert i kjerne-fucosylation ble analysert med lektin blot, kvantitativ revers transkripsjon-polymerase kjedereaksjon, western blot, immunhistokjemisk farging og lectin-histokjemisk farging. De rekombinante plasmider av BNP-fucose transporter og α-1,6-fucosyltransferase (Fut8) ble konstruert og transfektert inn mage kreft cellelinjer BGC-823 og SGC-7901. CCK-8 og sårheling-analyse ble brukt for å vurdere den funksjonelle virkningen av kjerne-fucosylation modulasjon på celleproliferasjon og migrasjon. Karakteristisk serum N-glykan profiler ble funnet i magekreft. Sammenlignet med den friske kontrollgruppen, en trianntenary struktur overflod, topp 9 (NA3Fb), ble økt betydelig i magekreft, mens det totale overflod av kjerne-fucosylated rester (sumfuc) ble redusert. Kjerne-fucosylated strukturer, peak6 (NA2F) og peak7 (NA2FB) ble avdøde i mage tumorvev sammenlignet med det i tilstøtende ikke-tumorvev. Konsekvent, culinaris linse agglutinin (LCA) -binding proteiner ble redusert betydelig i sera av magekreft, og proteinnivå Fut8 ble betydelig redusert i mage tumorvev sammenlignet med i tilstøtende ikke-tumorvev. Oppregulering av BNP-Tr og Fut8 kunne hemme spredning, men hadde ingen signifikant innvirkning på migrasjon av BGC-823 og SGC-7901 celler. Kjerne-fucosylation er nedregulert i magekreft. Oppregulering av kjerne-fucosylation kunne hemme spredning av den menneskelige mage kreftceller
Citation. Zhao Y-P, Xu X-Y, Fang M, Wang H, Du Q, Yi C-H, et al. (2014) Redusert Kjerne-Fucosylation Bidrar til malignitet i magekreft. PLoS ONE 9 (4): e94536. doi: 10,1371 /journal.pone.0094536
Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA
mottatt: 19 august 2013; Godkjent: 17 mars 2014; Publisert: 14 april 2014
Copyright: © 2014 Zhao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet av National Natural Science Foundation of China (No. 81201697, 81101639 og nr 81271925); Science and Technology Commission av Shanghai kommune (No. 10ZR1439100 og nr 11JC1416400) .De finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser.: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
den magekreft (GC) er den fjerde vanligste kreftformen og den nest vanligste årsaken til kreft dødsfall på verdensbasis [1]. – [3], spesielt utbredt i mange asiatiske land, særlig Kina [4]. Protein glykosylering er en av de mest vanlige posttranslational modifiseringer av proteiner [5]. Glykaner kan kobles til proteiner, enten via en amidgruppe (N-bundet glykosylering) eller en hydroksylgruppe (O-bundet glykosylering), som forekommer ved forskjellige biosyntetiske reaksjonsveier og potensielt ha uavhengige funksjoner [6]. N-bundet glykosylering spiller grunnleggende rolle i mange biologiske prosesser som celleadhesjon, cellemigrering, og signaltransduksjon [7]. Unormal ekspresjon av N-bundne glykoproteiner har blitt observert i forskjellige sykdommer [8] – [10]. Ved grundig karakterisering av N-koblede glykoproteiner og sykdomsassosierte glykolyseringsmetoder endringer, har flere metoder blitt utviklet. I vår forrige undersøkelse, har vi identifisert noen N-sukker markører i heptatocellular karsinom (HCC) og tykktarmskreft ved hjelp av en kapillær basert elektroforese kalles DNA sequencer-assistert fluorophore assistert kapillær elektroforese (DSA-FACE) [11]. I tillegg har det blitt rapportert at α-1, 6-fucosyltransferase (Fut8) aktivitet og ekspresjon økes i flere humane kreftformer, noe som antyder en rolle for dette enzym i tumorutvikling og progresjon, for eksempel HCC [12], kolorektal kreft [ ,,,0],13], nonsmall celle lungekreft [14] og eggstokkreft serøs adenokarsinom [15]. Endret kjerne-fucosylation er en av de viktigste unormale glycosylert modifikasjon identifisert i maligniteter. Fut8 katalyserer overføring av fucose fra guanosin difosfat (BNP) -fucose til den innerste GlcNAc av hybrid og komplekse N-bundne oligosakkarider via en α-1,6-båndet, noe som resulterer i kjerne-fucosylated glykoproteiner [16] – [17] og å endre biologisk funksjon av resulterende glykoproteiner [18]. Selv om mange studier har rapportert sammenhengen mellom endret kjerne-fucosylation og andre aggressive svulster, til vår kunnskap, påvirkning av kjerne fucosylation på magekreft er ukjent. I denne studien analyserte vi N-glykan profilering med DSA-FACE i begge serumprøver fra magekreft, magesår, friske kontrollpersoner og vev proteiner fra svulster og tilstøtende ikke-svulster. Deretter utvide funksjonell forskning på de identifiserte spesifikke glycosylations.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Studien protokollen ble godkjent av kinesiske Ethics Committee for Human Resources i Second Military Medical University. Alle deltakerne i studien forutsatt skriftlig informert samtykke.
Study befolkningen
I alt 105 pasienter med magekreft (n = 80) og magesår (n = 25) ble tatt mellom desember 2007 og oktober 2010 på Changzheng Hospital of Second Military Medical University (Shanghai, Kina). Alle saker med magekreft innrullert ble histopathologically bekreftet av 2 patologer og tilfeller med magesår rekruttert ble bekreftet av gastroscope. Pasienter med magekreft som fikk preoperativ kjemoterapi, og som hadde andre sykdommer, inkludert infeksjoner ble ekskludert fra studien. Serumprøver ble tatt før kirurgiske reseksjoner. For en kontrollgruppe, ble 139 alder matchet, friske frivillige meldt fra en pool av kreftfrie personer som besøkte samme sykehus for en vanlig fysisk undersøkelse og som frivillig til å delta i forskning i samme periode. Vi definerte en frisk person som en som ble ansett som fri for sykdommer (inkludert ingen historie av kreft) ved helsekontroll. De følgende kliniske karakteristika for forsøkspersonene ble oppnådd på tidspunktet for hele blodprøvetaking. En oppsummering av data fra disse fagene er gitt i tabell 1. progresjon av alle pasienter med magekreft ble klassifisert i henhold til Union for International Cancer Control (UICC) TNM staging kriterier for magekreft, 13 pasienter (16,25%) hadde scenen jeg, 24 pasienter (30,00%) hadde stadium II, 30 pasienter (37,5%) hadde stadium III og 13 pasienter (16,25%) hadde stadium IV. Gjennomsnittsalderen for alle pasienter var 54,35 ± 6,69 inkludert 60 hanner og 20 hunner. Serum ble oppsamlet ved anvendelse av en standard protokoll fra fullblod, behandlet ved sentrifugering ved 10.000 g i 20 minutter, og lagret ved -80 ° C.
N-Glycan profilering fra serumproteiner
Serum protein N-glykan analyser ble utført som tidligere beskrevet [11]. Kort sagt ble de N-glykaner som er tilstede på proteiner i 2 ul av serum frigjøres med peptid N-glykosidase-F (PNGaseF) (New England Biolabs, Boston, Mass), og deretter merket med 8-aminonaphtalene-1, 3, 6- trisulphonic syre (APTS) (Invitrogen, Carlsbad, California) .Sialic syre ble fjernet med Arthrobacter ureafaciens sialidase (Roche Bioscience, Palo Alto, California), og de behandlede prøvene ble analysert med DSA-FACE teknologi ved hjelp av en kapillær elektroforese basert ABI3500 Genetisk Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, California). De 9 mest intense toppene som ble oppdaget i alle prøvene (sammen, disse toppene sto for 90% av total serum N-glykaner) ble analysert ved hjelp GeneMapper programvare (Applied Biosystems). Hver struktur av N-glykan ble beskrevet numerisk ved å normalisere sin høyde til summen av høydene av alle toppene.
Vevsprøver
Alle vev ble brukt i samsvar med Institutional Review Board forskrift Second Military Medical University. Vevsprøver ble oppnådd from10 av 80 pasienter med magekreft. Vevsprøver inkludert 2 skiver, en svulst vev og en tilstøtende ikke-svulstvev. Sammenkoblede vevsprøver (ca. 0,5 x 0,5 x 0,5 cm
3, dupliseres for hver prøve) er valgt enten ble umiddelbart frosset ved -80 ° C for RNA og protein ekstraksjon eller fiksert i 10% bufret formalin i opptil 24 timer og deretter bearbeides til en parafin innebygd blokk og lagret ved romtemperatur i histokjemisk farging.
N-Glycan profilering fra vev proteiner og strukturanalyse ved hjelp av exoglycosidase fordøyelse
proteiner ble ekstrahert fra omtrent 25 mg frosne vevsprøver . Vevsprøvene ble suspendert og pestled i lyseringsbuffer som inneholder protease hemmere cocktail (Roche Diagnostics, Meylan, Frankrike). Ulyserte deler ble fjernet ved sentrifugering (12 000 g i 10 minutter ved 4 ° C) to ganger. Konsentrasjonen av solubiliserte proteiner ble bestemt ved anvendelse av BCA-kit (Pierce Bioteknologi /Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL), og proteinprøvene ble lagret ved -80 ° C inntil bruk. Totalt 40 pg vevsproteiner ble anvendt for å etablere N-glykan profiler ved hjelp av vanlige N-Glycan profilering metode den samme som den som utføres i serum som er beskrevet ovenfor. For å identifisere kjerne-α-1, 6-fucosylated N-glykan strukturer, et passende antall av APTS-merkede N-glykaner ble spaltet med både Arthrobacter ureafaciens sialidase og bovin nyre α-1, 6-fucosidase (Prozyme, San Leandro, CA , USA). DSA-FACE teknologien ble brukt til å analysere fordøyelsen produkter og GeneMapper programmet ble brukt til å analysere høyden på toppene.
RNA ekstraksjon og kvantitativ real-time PCR
Totalt RNA ble ekstrahert fra frossen vev og celler, ved hjelp av total RNA ekstraksjon kit i henhold til produsentens instruksjoner (Axygen Biosciences, Hangzhou, Kina). Renheten og Konsentrasjonen av RNA ble bestemt ved spektrofotometrisk (Eppendorf, Hamburg, Tyskland), og deretter lagret ved -80 ° C inntil bruk. CDNA ble syntetisert ved anvendelse ReverTra Ace-α-RT-PCR kit (Toyobo Co., Osaka, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. Primere ble utformet ved bruk av Primer Express-programmet (Applied Biosystems, sekvensene er vist i tabell S1). Kvantitativ real-time PCR ble utført ved hjelp av SYBR® Grønn Real-time PCR Master Mix kit (Toyobo Co, Osaka, Japan) og ble analysert på Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR system (ABI, Foster City, CA, USA) . Alle analyser ble utført i tre eksemplarer uavhengig av hverandre. PCR sykling besto av denaturering ved 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 40 sykluser ved 95 ° C i 15 sekunder og ved 59 ° C eller 55 ° C i 15 sekunder, og deteksjon i 45 sekunder ved 72 ° C. Den relative mengde av Fut8 eller guanosin-difosfat (GDP) -fucose transporter (GDP-Tr) transkripter i hver prøve var normalisert til husholdningsgenet β-actin og glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ved å subtrahere syklusen. Nivåene av genekspresjon ble bestemt ved bruk av Delta-Delta Ct-metoden. Absolutte transkripsjon uttrykk verdier utover 40 sykluser ble vurdert under detekterbare nivåer. Smelte-kurver ble undersøkt for hver reaksjon for å garantere at et enkelt produkt ble amplifisert.
Western blot og Lektin blot
Proteiner ble ekstrahert fra frosne vev med den fremgangsmåte som er beskrevet ovenfor, og en total på 50 ug proteiner ble separert ved elektroforese i 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel (SDS-PAGE). Gelene ble farget med Coomassie-blå G250 eller proteinene i gelen ble overført til en nitrocellulosemembran () for påvisning av Fut8 eller prosentandelen av kjerne-fucosylated proteiner. For serumprøver, ble totalt 85 saker fra magekreft (n = 80), magesår (n = 25) og friske kontrollgruppen (n = 30) som brukes for SDS-PAGE og lektin-blot. Membranene ble blokkert over natten ved 4 ° C med 5% fettfri melk-protein eller 5% bovint serumalbumin i tris-bufret saltoppløsning [140 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (TBS)] og deretter inkubert i 2 timer ved romtemperatur med 1:100 fortynnet anti-humant Fut8 antistoff (15C6, anti-human Fut8, Fujirebio Corp., Japan) eller 5 ug /ml biotinylert linse culinaris agglutinin A (LCA) (Vector Laboratories, Burlingame, California) i TBS inneholdende 0.05% Tween-20 (TBST buffer), og deretter inkubert med en 1:10,000 fortynning av fluorescens-merket sekundære antistoffer (LI-COR biovitenskap, Lincoln, NE) eller IRDye 800CW-streptavidin (LI-COR biovitenskap) i 1 time ved romtemperatur . Membranene ble utviklet med Odyssey IR Imaging System. Anti-beta-aktin (1:2000) ble anvendt for intern referanse antistoff for western-blot. Renset albumin ble anvendt som negativ kontroll for lectin blot og totalt protein farget med Coomassie-blått ble anvendt for å beregne prosentdelen av kjerne fucosylated protein.
Immunhistokjemisk (IHC) farging og lectin-histokjemisk farging
De faste vevsprøver innebygd i parafin ble skåret i 4-mm-syke skiver for immunhistokjemisk farging for Fut8 og lektin-histokjemisk farging for LCA. Etter gjennomgått deparaffinization, rehydrering, endogen peroksidase blokkering, og antigen gjenfinning (10 mM Tris /1 mM EDTA, pH 9,0, autoklav behandlet), ble prøvene inkubert med et monoklonalt antistoff mot humant Fut8 (1:100) eller biotinylert LCA (1 :500) over natten ved 4 ° C, og deretter med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff eller Fluorescein-merket streptavidin ved 37 ° C i 30 minutter. Kjerner ble kontra med hematoksylin eller Draq5. Negativ kontroll var sammensatt av likt behandlet histologiske snitt med mus IgG å erstatte musen Fut8.
Cellelinjer og kultur
Den menneskelige mage kreft cellelinjer, BGC-823 og SGC-7901, ble kjøpt fra Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences og dyrket ved 37 ° C under 5% CO
2 i RPMI 1640 medium og DMEM medium (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California), henholdsvis med 10% FBS, 1% glutamin, og 1% antibiotika løsning.
Bygging av BNP-Tr og Fut8 rekombinante plasmider og transfeksjon av magekreftceller
pEGFP-N1-BNP-Tr og pEGFP-N1 -Fut8, plasmidvektoren som koder for humant BNP-Tr eller Fut8, ble dannet ved å sette inn GDP-Tr eller Fut8 cDNA inn i en pEGFP-N1-vektoren (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA), som inneholder en CMV-promoter og SV40 tidlig promoter, så vel som neomycin /kanamycin-resistensgenet av Tn5. Vektoren ryggraden inneholder også et SV40-replikasjon i pattedyrceller. Den multiple kloningssete (MCS) er ved siden av den umiddelbare tidlig formidler av CMV. Det humane GDP-Tr eller Fut8 genet ble klonet fra mRNA ekstrahert med TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, USA) fra humant levervev ved å utføre RT-PCR ved anvendelse av primerne (tabell S2) i hvilken det Xho I eller Kpn I restriksjonsseter ble inkludert, fordøyelse med Xho eller Kpn i og ligere inn i pEGFP-N1. Den pEGFP-N1-BNP-Tr eller den pEGFP-N1-Fut8 ble transfektert inn i Escherichia coli DH5a for amplifisering og DNA-sekvensering ble benyttet for å sikre gjengivelse. Plasmid DNA ble laget ved hjelp av Qiagen DNA mini kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens anvisninger. Plasmider ble transfektert inn i den menneskelige mage kreft cellelinjer, BGC-823 og SGC-7901 på 80% samløpet og 5 × 10
5 celler per brønn i en seks-brønns plate med Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, USA ) i henhold til produsentens instruksjoner. De transfekterte celler som uttrykte målet genet ble bekreftet av kvantitativ RT-PCR.
Celleproliferering analysen
celleproliferasjon ble utført med Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojin, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. Cellevekst ble målt hver 24. time i løpet av 5 dager, og for hvert tidspunkt ble utført i duplikat. Absorbansen ble målt for hver brønn ved en bølgelengde på 450 nm.
sårtilheling analysen
For sårtilheling analysen, den menneskelige mage kreft cellelinjer, BGC-823 og SGC-7901 ( 1 x 10
5 celler /35 x 11 mm skåler) ble sådd ut og inkubert i 24 timer ved 37 ° C og deretter transfektert med rekombinante plasmider. Etter oppnå samløpet, ble cellelaget i hver plate riper med en plast pipette. Migrasjon av cellene ved kanten av scratch ble analysert på 0, 24 og 48 timer, ble bildene tatt og analysert av Leica fluorescens mikroskop og matchet bildeanalyse programvare (Comet Assay IV Bildeanalyse system, PI, UK).
Rutine Tumor Detection Maker
kliniske og biokjemiske data fra pasientene er oppsummert i tabell 1. Rutine biokjemiske tester ble målt ved bruk av standard fremgangsmåter og reagenser passet (Hitachi 7600 Analyzer (Hitachi, Tokyo, Japan) . Tumor markør nivåer, inkludert karbohydrat antigen 19-9 (CA19-9), carcinomaoppfinnelse-embryonale antigen (CEA), Cytokeratin 19 (CK19), CA125 og CA724, ble bestemt på et Roche E170 modulær med matchet reagenser.
Statistisk analyse
Alle kvantitative variabler ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik mindre annet er oppgitt. kvantitative variabler ble sammenlignet med Student t-tester, analyser av varians (ANOVA), eller parametriske tester. Pearson koeffisientene korrelasjon (Spearman koeffisientene til korrelasjon ble beregnet for ordinal kategoriske variabler) og tilhørende sannsynligheter (
p
) ble anvendt for å evaluere korrelasjon mellom parametrene. Alle rapporterte
p
verdiene 2-tailed, og
p
verdier 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Statistiske analyser ble utført med SPSS 16.0 for Windows statistisk programvare (SPSS Inc.).
Resultater
Ulike serum N-Glycan profilerings mønstre i magekreft, magesår og friske kontroller
Ved hjelp av DSA-FACE, undersøkte vi de N-sukker profiler i desialylert sera fra pasienter med magekreft (n = 80), magesår (n = 25), og alder matchet friske individer (n = 139). Vi kvantifisert og statistisk sammenlignet disse toppene blant 3 forskjellige grupper. Minst 9 N-glykan strukturer (topper) ble identifisert i alle prøvene (figur 1A). Den strukturelle analyse av disse N-glykaner ble publisert tidligere av Callewaert [11]. Den gjennomsnittlige relative overflod av disse N-glykan strukturer ble beskrevet i tabell 2. overflod av strukturer i toppene 2, 3, 5, 6, 7, 8 og 9 avdekket statistisk signifikante forskjeller mellom de magekreft, magesår, og frisk kontroll grupper, noe som indikerer at forskjellige N-glykan mønstre først i forskjellige patofysiologiske tilstander. Sammenlignet med den friske kontrollgruppen, peak5 (bigalacto dobbeltantenneformede glykan, NA2) og peak9 (forgrening α-1,3-fucosylated triantennary glykan, NA3Fb) ble forhøyet (P 0,001) (figur 1B); mens kjerne- fucosylated topper, for eksempel peak2 (agalacto kjerne-α-1,6-fucosylated halverer dobbeltantenneformede glykan, NGA2FB), peak3 (single agalacto kjerne-α-1,6-fucosylated dobbeltantenneformede sukker, NG1A2F), peak6 (bigalacto kjerne -α-1,6-fucosylated dobbeltantenneformede sukker, NA2F) og peak7 (bigalacto kjerne-α-1,6-fucosylated halverer dobbeltantenneformede glykan, ble NA2FB) gikk ned i magekreft gruppen (P 0,001). Tilsvarende overflod av kjerne-fucosylated struktur glykaner oppkalt sumfuc (indikerer total kjerne-fucosylated strukturer, inkludert topp 1, 2, 3, 4, 6 og 7) ble redusert betraktelig i magekreft (P 0,001) (figur 1C ). Den magekreft gruppen ble videre klassifisert i 4 undergrupper i henhold til TNM Staging av UICC for magekreft. Strukturen overflod og sumfuc ikke endres vesentlig blant de 4 forskjellige undergrupper; Men sumfuc ble redusert gradvis med progresjon stadier av magekreft (tabell 3).
(A) De tre paneler (fra topp til bunn) er typiske serum N-glykan profiler fra friske kontroll, magesår og mage kreft. Ni hovedtopper kan identifiseres. Strukturene til N-sukkertopper er vist nedenfor diagrammet. Nivåer i toppene 5 og 9 er forhøyet (opp piler), og nivåer i toppene 2, 3, 4, 6, 7 og 8 er redusert (ned piler) i magekreft sammenlignet med friske og sykdomskontroll. Toppene 1, 2, 3, 4, 6 og 7 er kjernefrie fucosylated glykaner. (B) Verdien av peak9 (forgrening α-1,3-fucosylated triantennary N-glykan, NA3FB) er forhøyet sekvensielt fra friske kontroll, magesår til magekreft (P 0,001), Feilfelt representerer 95% konfidensintervall (95 % KI) for hjelp. (C) Verdien av sumfuc reduseres i magekreft (P 0,001). Sumfuc indikerer den totale mengde av kjerne-fucosylated struktur glykaner (toppene 1, 2, 3, 4, 6 og 7). Feilfelt representerer 95% KI for hjelp.
Sammenheng mellom N-glykaner og rutine tumor markører
Til dags dato, CEA er fortsatt brukes mye for screening og overvåking av magekreft. Vi analyserte sammenhenger mellom individuelle N-glykan markør med CA19-9, CEA, CK19, CA125 og CA724. The Pearson korrelasjonsanalyse viste at CEA var assosiert positivt med peak1 (r = 0,19; P 0,01), og peak9 (r = 0,28; P 0,01), mens negativt med peak6 (r = -0,18; P 0,01) og peak8 (r = -0,23; P 0,01) (tabell 4)
Sammenligning av sumfuc mellom magekreft og andre fordøyelsessystemet kreft
Tidligere har vi studert N-Glycan profilering. av leverkreft (HCC) [19] og endetarmskreft (CRC) [20]. Overflod av sumfuc viste statistisk signifikante forskjeller mellom magekreft (41,32 ± 6,39), HCC (50,99 ± 8,39), CRC (45.33 ± 5.96) og friske kontrollgruppen (47.67 ± 5.08) grupper (P 0.001, tabell 5), noe som indikerer at annet nivå av kjerne fucosylation dukket opp i kreft med ulike vev opprinnelse. Blant de 4 grupper, nivået på kjerne fucosylation i HCC var det høyeste, mens fucosylation nivået i magekreft var lavest, og var enda lavere enn i friske kontrollgruppen.
N-Glycan profilering mønstre i mage tumor og ikke-tumorvev
N-sukker profiler ble undersøkt i desialylert protein fra magekreft og ikke-tumorvev. De tre mest tallrike bigalacto dobbeltantenneformede glykaner viste i serum, peak5 (NA2), peak6 (NA2F) og preak7 (NA2FB) ble også identifisert i vev proteiner (Figur 2A). Peak6 og Peak7 ble bekreftet å være kjerne-fucosylated strukturer dervied fra peak5 etter behandlet med kjerne-α-1, 6-fucosidase fordøyelse (figur 2A). Høyden på disse tre topper ble analysert ved hjelp av GeneMapper programvare. Forholdet mellom peak6 til peak5 var lavere i tumorvev enn det i tilstøtende ikke-tumorvev (0,83 ± 0,18 vs 1,05 ± 0,42, figur 2B), så vel som forholdet mellom peak7 til peak5 (0,13 ± 0,06 vs 0,16 ± 0,04, Figur 2C). Men det var ingen statistisk signifikante forskjeller (P 0,05). Mellom tumor og ikke-tumorvev
(A) De fem paneler (fra øverst til nederst) er desialylert N-sukker profiler fra serum som referanse, desialylert N-sukker profiler fra tumorvev, desialylert N-sukker profiler fra tumorvev behandlet med α-1,6-fucosidase fordøyelsen, desialylert N-sukker profiler fra tilstøtende ikke-tumorvev, og desialylert N-sukker profiler fra tilstøtende ikke- tumorvev ble behandlet med α-1,6-fucosidase fordøyelse. Pilen linjer indikerer endringer av N-glykan topper som ble behandlet med α-1,6-fucosidase fordøyelse. Peak6 og peak7 fjerne forover etter α-1,6-fucosidase fordøyelse, som reveale at peak5, 6 og 7 har de samme strukturene som i serumet, og peak6 og peak7 er α-1,6-fucosylated N-glykaner. (B) Verdien av peak6 /peak5 er redusert i tumorvev, men forskjellen er ikke statistisk signifikant. Feilfelt representerer 95% KI for midler. (C) Verdien av peak7 /peak5 er også redusert i tumorvev, men forskjellen er ikke statistisk signifikant.
Redusert nivåer av samlet kjerne fucosylation identifisert i både sera og vev fra magekreft
Siden LCA kan spesifikt gjenkjenne glykoproteiner med α-1,6-fucosylated bundet N-acetyl-D-glukosamin-asparagin (GlcNAc-Asp) i trimannosyl kjernen, undersøkte vi de totale kjerne fucosylated proteiner fra sera og vev i magekreft ved hjelp av LCA for å validere funn i DSA-FACE. I serum, nivået av LCA-bindende kjerne fucose rester var lavere i magekreft enn i magesår og friske kontroller (figur 3A). Total kjerne fucose overflod også tendert til å være lavere i mage svulster i forhold til at i sammenkoblede tilstøtende vev (Figur 3B). For å avgjøre om endring av samlet kjerne fucosylation i mage svulstvev er relevant for endring av glykosylering biosyntesebanen ble kvantitativ RT-PCR benyttes for å analysere overflod av pattedyr Fut8 og BNP-Tr i mage svulster og tilstøtende vev. Resultatene viste at ble observert noen signifikant forskjell på Fut8 og BNP-Tr mRNA uttrykk mellom svulster og tilgrensende vev (Figur 3C og 3D). Den relative overflod av Fut8 protein ble illustrert ved hjelp av western blot (rå data som ble vist i figur S1). Den Fut8 i tilstøtende vev var signifikant høyere enn i tumorvev (P 0,05) (figur 3E). Immunohistokjemi avslørte at Fut8 var sterkt positivt uttrykt ved luminal grensene av ikke-tumor gastriske celler (figur 4B), men det svakt positivt uttrykt i tumorceller (figur 4A). Ekspresjonen av LCA bindende kjerne-fucosylated glykoproteiner var høyere i ikke-tumorceller enn gastrisk at det i tumorceller (figur 4C, 4D). Så ble nivået av samlet kjerne fucosylation identifisert redusert i både sera og vev fra magekreft.
(A) Lectin blot av serumproteiner ble undersøkt med LCA. Den horisontale aksen representerer de eksperimentelle grupper: frisk kontroll (n = 30), magesår (n = 25), og mage kreft (GC) (n = 30); den vertikale aksen angir forholdet mellom fucosylated proteiner til totale proteiner. Nivået av fucosylated proteiner i magekreft er den lavest blant 3 grupper (P 0,001). (B) Lectin blotter fra vev proteiner ble analysert med LCA. Den horisontale aksen representerer de eksperimentelle grupper: tumorvev (n = 10) og tilstøtende vev (n = 10). Den vertikale aksen angir forholdet mellom fucosylated proteiner til totale proteiner. Kjerne-fucosylated nivå var lavere i magetumor, men forskjellen viste ingen statistisk signifikans (P 0,05). (C) og (D) Relativ budbringer-RNA (mRNA) ekspresjonsnivåer av Fut8 eller GDP-Tr i vev ble målt med kvantitativ RT-PCR. Den horisontale aksen representerer de eksperimentelle grupper: tumorvev (n = 10) og tilstøtende vev (n = 10). Den vertikale aksen viser den relative uttrykk nivåer av Fut8 eller BNP-Tr. Forskjellen mellom gruppene var ikke statistisk signifikant (P 0,05). (E) Den relative overflod av Fut8 protein ble illustrert ved hjelp av western blot. Den horisontale aksen representerer de eksperimentelle grupper: tumorvev (n = 9) og tilstøtende vev (n = 9). Den vertikale aksen angir de relative nivåer av Fut8 protein. Den relative overflod av Fut8 protein i tilstøtende vev var signifikant høyere enn i tumorvev (P 0,05).
(A) Immunohistokjemisk farging med Fut8 i tumorceller (200 x), ekspresjon av Fut8 er svakt positiv. (B) Immunohistokjemisk farging med Fut8 i ikke-tumorceller gastriske (200 x), er et uttrykk for Fut8 sterkt positiv. (C) lektin-histokjemisk farging med LCA i tumorceller, bar 75 mikrometer, er uttrykk for LCA-bindende kjerne-fucosylated proteiner svakt positiv. (D) lektin-histokjemisk farging med LCA i ikke-tumor mage celler, bar 75 mikrometer, er uttrykk for kjerne-fucosylated proteiner sterkt positiv.
Effekt av Fut8 og BNP-Tr på spredning og migrasjon i menneskelige mage kreft cellelinjer
Den menneskelige mage kreft cellelinjer, BGC-823 og SGC-7901 ble brukt in vitro studie. Siden BGC-823 uttrykt lavere BNP-Tr mens SGC-7901 uttrykte lavere Fut8 i vår pilot forskning, ble pEGFP-N1-BNP-Tr transfektert inn i BGC-823 for overekspresjon BNP-Tr og pEGFP-N1- Fut8 var transfektert inn SGC-7901 for overekspresjon Fut8. Rekombinante uttrykk ble lykkes oppnådd vist av reporter gen GFP uttrykk (figur S2). For å undersøke mulige involvering av BNP-Tr og Fut8 i tumor spredning og migrasjon, ble BGC-823 og SGC-7901 celler undersøkt etter transfeksjon ved hjelp av CCK-8 og sårtilheling migrasjon analysen hhv. Resultatene viste at oppregulering av GDP-Tr redusert BGC-823 proliferasjon på 2-5 dager etter transfeksjon og oppregulering av Fut8 redusert SGC-7901 spredning på 2 dager etter transfeksjon (figur 5A og 5B). Disse resultatene indikerte at høy ekspresjon av BNP-Tr og Fut8 kunne undertrykke proliferasjonen av humane magecancerceller. Sårheling analysen viste at BNP-Tr og Fut8 har noen vesentlig betydning for migrasjon i BGC-823 og SGC-7901 på 48 timer etter behandling (figur 5C og 5D).
(A) og (B) spredning av BGC-823 celler og SGC-7901 celler etter transfeksjon med pEGFP-N1-BNP-Tr og pEGFP-N1-Fut8 henholdsvis ble analysert ved Cell Counting Kit-8 (CCK-8) analyser. Representative resultater fra fire uavhengige eksperimenter er vist. * P 0,05 sammenlignet med kontrollgruppen. (C) og (D) sårheling migrering analyse av BGC-823-celler etter transfeksjon med pEGFP-N1-BNP-Tr samt SGC-7901-celler etter transfeksjon med pEGFP-N1-Fut8. Gapet avstand (um) i migrasjons assay kan kvantitativt bedømt ved bruk av programvare. Representative resultater fra 3 uavhengige eksperimenter er vist. P . 0,05 sammenlignet med kontrollgruppen
Diskusjoner
glykosylering er en av de vanligste posttranslasjonelle modifikasjoner dukket opp i ca 70% av alle kjente proteiner. Endringer i glykosylering spille en rolle i et variert sett av biologiske fenomener slik som tumorcellemetastase, intracellulær kommunikasjon og inflammasjon [21] – [23]. Flere og flere studier viser at endringer i glykosylering og nivåene av glycosyltransferases aktiviteter avledet fra malign transformasjon er relevante for menneskelige maligniteter [24] – [25].
