Abstract
Bakgrunn
utskilt protein syrlig og rik på cystein (SPARC), et kalsiumbindende matricellular glykoprotein, er implisert i progresjon av mange kreftformer. I denne studien undersøkte vi uttrykket og funksjon av SPARC i eggstokkreft.
Metoder
cDNA microarray analyse ble utført for å sammenligne genuttrykk profiler av meget inngripende og de lave invasive subkloner avledet fra den SKOV3 human ovarian cancer cellelinje. Immunhistokjemi (IHC) farging ble utført for å undersøke SPARC uttrykk i totalt 140 vevsprøver på eggstokkene. I funksjonelle analyser, ble effekten av SPARC knockdown på den biologiske oppførsel av eggstokkreft celler undersøkt. Mekanismene for SPARC i eggstokkreft spredning, apoptose og invasjon ble også undersøkt.
Resultater
SPARC ble overuttrykt i meget inngripende kloning sammenlignet med lav invasiv kloning. Høy SPARC uttrykket var forbundet med høy scene, lav differensiering, lymfeknutemetastase og dårlig prognose for eggstokkreft. Knockdown av SPARC uttrykk undertrykte betydelig eggstokkreft celleproliferasjon, indusert celle apoptose og hemmet celle invasjon og metastasering.
Konklusjon
SPARC er overuttrykt i meget inngripende kloning og eggstokkreft vev og spiller en viktig rolle i eggstokkreft vekst, apoptose og metastase
Citation. Chen J, Wang M, Xi B, Xue J, han D, Zhang J et al. (2012) SPARC er en viktig regulator av spredning, apoptose og invasjonen i Human eggstokkreft. PLoS ONE 7 (8): e42413. doi: 10,1371 /journal.pone.0042413
Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 21 mars 2012; Godkjent: 05.07.2012; Publisert: 03.08.2012
Copyright: © Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av et stipend-i-aid for vitenskapelig forskning (2012TS088) fra Shandong University. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den nest vanligste gynekologisk kreft, og en av de viktigste årsakene til kreft dødsfall hos kvinner [1]. Høy andel av eggstokkreft pasienter blir diagnostisert på et avansert stadium. Selv om betydelige fremskritt har blitt gjort i eggstokkreft forskning, er overlevelsen til insidensratio fortsatt dårlig og generell kur rate er fortsatt svært lav [2]. Tumorresidiv og metastasering er ansett som de viktigste årsakene til det dårlige kliniske resultatet og kreftdødsfall [3]. Derfor vil studere mekanismen av tumorinvasjon og metastase gi ytterligere innsikt i utvikling og progresjon av kreft i eggstokkene.
SPARC- (utsondret protein sure og rikt på cystein), også betegnet osteonectin, BM-40, og 43 K protein, er et kalsiumbindende matricellular glykoprotein, hvis funksjon er å modulere celle-matriks-interaksjoner og cellefunksjon uten å delta i den strukturelle stillas av den ekstracellulære matriks [4]. Selv om det er økende bevis for en viktig rolle for SPARC i en rekke kreftformer, er det ingen samlende modell, noe som forklarer alle fasetter av sin funksjon og bidrag til utvikling og progresjon av kreft [5]. SPARC- blir uttrykt forskjellig i tumorer og det omkringliggende stroma i forskjellige cancere i forhold til normalt vev. For eksempel, har høyere nivåer av SPARC- ekspresjon er rapportert i brystkreft [6], [7], hepatocellulært karsinom [8], [9], prostatakreft [10], kolorektal kreft [11], [12], og ovarie kreft [13], [14]. Imidlertid har en motsatt sammenheng også blitt påvist, noe som tyder på at SPARC- kan være i stand til å inhibere tumorigenese eller tumorprogresjon i brystkreft [15], [16], hepatocellulært karsinom [17], prostatakreft [18], kolorektal kreft [19] , [20], og eggstokk-kreft [21]. Derfor funksjonen av SPARC i kreft fortjener nærmere undersøkelse.
I denne studien, utførte vi cDNA microarray analyse for å undersøke differensial genuttrykk profil av meget inngripende kloning S1 og den lave invasive kloning S21, som begge som var avledet fra den SKOV3 human ovarian cancer cellelinje. Vi har funnet at mange gener ble uttrykt forskjellig i disse to typer subkloner. Spesielt SPARC- ble funnet å være betydelig overuttrykt i meget inngripende subklon S1 sammenlignet med den i den lave invasiv subklon S21. For å klargjøre forholdet mellom SPARC og kreft progresjon eggstokkene, ble uttrykk for SPARC i menneskelige eggstokkene vevsprøver målt ved immunhistokjemi (IHC). I funksjon analyse av lentivirus-mediert RNA-interferens, redusert vi ekspresjonen av SPARC- i meget inngripende subklon S1 og HO8910PM for å bestemme effekten av SPARC- på ovarial cancer celleproliferasjon, apoptose, invasjon og metastase.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
SKOV3, NIH3T3 og HO8910PM (en svært metastatisk eggstokkreft cellelinje [22]) cellelinjer ble hentet fra Shanghai Institute for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. Den sterkt invasive subklon (S1) og den lave invasiv subklon (S21) ble avledet fra den SKOV3 human ovarian cancer-cellelinje [23]. Celler ble dyrket i RPMI-1640 for SKOV3 eller DMEM for NIH3T3 og HO8910PM supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika (Gibco BRL, Rockville, MD).
Microarray Analyse
Total RNA ble ekstrahert fra den meget inngripende subklon (S1) og den lave invasiv subklon (S21) ved anvendelse av RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA). RNA kvalitet ble bestemt ved spektrofotometri og denaturerende gelelektroforese. RNA ble forsterket og merkes med Agilent Hurtig Amp merking kit og hybridisert til Agilent hele genomet oligo microarray. Lysbilder ble skannet med Agilent DNA microarray scanner. Data ble behandlet ved hjelp av Agilent Feature Extraction programvare (versjon 10.5.1.1) og analysert ved hjelp av Agilent GeneSpring GX-programvaren (versjon 11.0). Forsøkene ble utført i tre eksemplarer.
vevsprøver
Vevsprøver ble oppnådd med skriftlig informert samtykke fra 80 kvinner med ovarialcancer (med 29 serøs cystadenocarcinoma, 25 mucinous cystadenocarcinoma og 26 endometrioid karsinom ), fra 35 kvinner med benign ovarial tumor, og fra 25 normal kontroll eggstokk vev ved Institutt for gynekologi og obstetrikk, Shandong Provincial Hospital mellom 2005 og 2007. Alle eggstokkreft pasientene ble klinisk iscenesatt i henhold til FIGO staging system [med 38 lave scene tumorer (FIGO stadium I og II) og 42 høye scene tumorer (FIGO trinn III og IV)]. Ingen av eggstokkreft pasientene fikk preoperativ strålebehandling eller cellegift. Studien ble godkjent av Institutional Medical Ethics Committee of Shandong University.
Immunohistochemistry (IHC)
Ifølge standard streptavidin-biotin-peroksidase kompliserte prosedyrer, ble IHC utføres på formalinfiksert, parafin -embedded seksjoner (5 um tykt) og celleglass fiksert i 4% paraformaldehyd. I korthet, etter avvoksing, rehydrering, og antigen gjenfinning, ble seksjonene inkubert med anti-humant SPARC- antistoff (AF941, R 0,05
Immunohistochemistry (IHC) Analyse
En semikvantitativ poengsystem basert på intensiteten i farging og distribusjon av positive celler ble brukt til å evaluere SPARC uttrykk [24]. Intensiteten av SPARC- positiv farging varierte fra 0 til 3 (negativ = 0, svak = 1, middels = 2, eller sterk = 3) og prosentandelen av positivt fargede celler ble scoret som 0 (0%), 1 (1 til 25 %), 2 (26 til 50%), 3 (51 til 75%), og 4 (76 til 100%). Summen av intensiteten og prosentvise resultatet ble brukt som den endelige farging score (0 til 7). Summen-indekser (-), (+), (++), og (+++) indikerte endelige farging score på 0, 1-3, 4-5, og 6-7, henholdsvis. For statistisk analyse, sum-indekser (-) og (+) ble definert som lav SPARC uttrykk, mens sum-indekser (++) og (+++) ble definert som høy SPARC uttrykk. Hver seksjon ble uavhengig scoret av to patologer. Hvis en inkonsekvens oppsto, ble en tredje patolog konsultert for å oppnå enighet.
Peptide blokkeringsanalyse
For å teste spesifisitet av anti-SPARC, antistoffet ble inkubert over natten ved 4 ° C med rekombinant human SPARC- (941-SP, R den negative kontrollsekvensen var 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 «. De sterkt invasive subklon celler (S1 og HO8910PM) ble dyrket i seks-brønners vevkulturplater og infisert med lentivirus ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 100 ° C i 24 timer. Deretter ble mediet erstattet med friskt komplett medium. Etter 4 dager ble cellene observert etter fluorescens mikroskopi for å bekrefte at mer enn 80% av cellene ble GFP-positive.
celleproliferasjon Analyser
Celleproliferering ble bestemt av ved hjelp av MTT-analyse og forankring uavhengig myk agar-kolonidannelse analysen. For MTT-analysen ble 20 pl MTT (5 mg /ml i PBS) tilsatt direkte inn i hver brønn av 96-brønns plate og inkubert ved 37 ° C i 4 timer. Deretter media ble fjernet, og 200 ul DMSO ble tilsatt for å oppløse formazankrystaller. Den optiske tetthet ved 570 nm ble avlest med en mikroplateleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
For bløt agar-kolonidannelsesbestemmelsen, 500 ul 2 x DMEM supplert med 20% FBS ble blandet med 500 ul 1,2 % Sea pesten agar og stivnet i hver brønn i en 24-brønners plate for å danne basis agar lag. For topp agar lag 25 ul celler (5 × 10
3 /ml) ble blandet med 500 mL 2 × DMEM og 500 mL 0,7% Havet Plague agar og lagt på toppen av basen agar lag. Etter å ha dyrket i 14 dager, ble kolonidannelse overvåket etter mikroskopi. En klynge av ti celler eller mer ble definert som en koloni.
Annexin V-PI Analyser for apoptose
Celler ble oppsamlet og vasket to ganger med PBS, suspendert i 200 ul bindingsbuffer og 10 ul Annexin V-FITC i 20 minutter i mørke, og deretter ble 300 ul bindingsbuffer og 5 ul propidiumjodid (PI) ble tilsatt til hver prøve. Den apoptotiske celler ble bestemt ved anvendelse av et strømningscytometer (Becton Dickinson) med Cellquest (Becton Dickinson) programvare.
Analyse av Cell Cycle Distribution
Cellene ble høstet, vasket med iskald PBS, og farget med 50 ug /ml PI og 250 ug /ml RNase i 30 minutter. Prosentandelen av celler i hver fase av cellesyklusen ble bestemt med en datamaskin programmert ModFit LT2.0 DNA-analyse (Becton Dickinson) ved anvendelse av et strømningscytometer.
celle invasjon-analysen og migrasjon Assay
invasjon assay ble utført som beskrevet tidligere [25]. Hver Transwell (BD Biosciences, Bedford, Massachusetts) ble belagt med 50 ul 1:03 fortynning av Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA). Celler (0,2 × 10
6) ble resuspendert i 200 mL serumfritt medium og sådd i det øvre kammeret. Kondisjonert media fra NIH3T3-cellekulturen ble filtrert og tilsatt til det nedre kammer som et kjemotaktisk faktor. Etter 12 timer, ikke-invaderende celler som var tilbake på den øvre overflate ble fjernet, og cellene på den nedre overflate ble fiksert, farget med hematoksylin og eosin (H E) og observert under et mikroskop. Gjennomsnittsverdiene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SE. Dette dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Shandong University og var i samsvar med alle gjeldende lover og forskrifter.
(A) SPARC protein uttrykk i lentivirus-infiserte celler målt ved Western blot. (B) SPARC mRNA uttrykk i lentivirus-infiserte celler målt ved q-RT-PCR. (C) SPARC- protein ekspresjon i lentivirus-infiserte celler som målt ved hjelp av IHC-farging (forstørrelse x 200). * P. 0,05 versus kontroll
flowcytometrisystemer Analysis
Celler på log fase ble samlet og justert til en tetthet på 1~5 × 10
6 /ml med PBS , og deretter farget med 20 ul fluoresceinisotiocyanat (FITC) -konjugert monoklonale antistoffer i 30 minutter ved 25 ° C. Alle antistoffer inklusive anti-integrin β1, anti-integrin β3 og anti-E-cadherin ble innkjøpt fra BD Biosciences Pharmingen (San Jose, CA, USA). Til slutt ble de fargede celler analysert ved hjelp av et strømningscytometer. Dataanalyse ble utført ved hjelp av programmet WinMDI. Testen ble utført i quadruplicates.
MMP Activity Assay av Zymografi
matriksmetalloproteinaser aktivitetsanalyse ble utført i 10% SDS-PAGE-gel inneholdende 0,1 mg /ml gelatin. 20 ug protein prøve ble fylt i hver kolonne av SDS-PAGE-gel. Etter elektroforese ble gelen vasket to ganger med 2,5% Triton X-100 i 1 time ved romtemperatur for å fjerne SDS og inkubert ved 37 ° C i løpet av natten i reaksjonsbuffer (50 mmo1 /L Tris-HCl pH 7,4, 8,775 g NaCl og 1.ll g CaCl
2). Etter farging med Coomassie brilliant blå, MMP aktivitet ble identifisert som klare soner mot blå bakgrunn.
Statistical Analysis
IHC data ble analysert ved hjelp av chi-kvadrat test. Resultatene av celle og molekylærbiologiske data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SE. For sammenligning av midler mellom to grupper, ble en to-halet t-test anvendt og for sammenligning av midler blant de tre gruppene, ble enveis ANOVA anvendt. Survival kurve ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og log-rank test. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS programvare versjon 13.0. P-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Forskjellig uttrykte gener i meget inngripende kloning S1 og lav Invasive kloning S21
For å oppdage nye biomarkører for invasiv. eggstokkreft, utførte vi mikroarray-analyse for å identifisere den differensial genekspresjon profil av den meget inngripende subklon S1 og lav invasiv subklon S21. Disse to subkloner ble avledet fra foreldre SKOV3 menneskelig eggstokkreft cellelinje og hatt lignende genetiske bakgrunn; derfor er de egnet for komparativ analyse. Microarray data ble analysert ved bruk av tildelte cut-off uttrykk forhold på 1,5 ganger endring og
P
-verdier ≤0.05. Analysene identifisert 1,596 differensielt uttrykte gener (Tabell S1 og Figur 1a). Blant disse genene, SPARC var markert oppregulert i meget inngripende kloning sammenlignet med lav invasiv kloning (13,8 ganger,
P
= 0,023). Real-time q-RT-PCR, Western blot og IHC resultater bekreftet overekspresjon av SPARC i meget inngripende kloning (figur 1BCD).
(A) Celleproliferering som undersøkes av MTT-analyse. (B) forankringsuavhengig vekst målt ved bløt agar-kolonidannelse assay. (C) cellesyklus-fordelinger som målt ved flow-cytometri. (D) Cell apoptose målt ved hjelp av Annexin V-PI analyser. (E) Celle migrering og invasjon analyse ved bruk av Boyden kammere. * P. 0,05 versus kontroll
Uttrykk for SPARC i menneskeEggstokk Vev
Ved hjelp av både to anti-SPARC antistoff i normale eggstokkreft vev, SPARC uttrykk ble lav og hovedsakelig fokusert rundt vasculatures i stroma (figur 2A og 2F), og i benigne ovarietumorer, SPARC- ekspresjon var også lav og hovedsakelig fokusert ikke bare i stroma men også i tumorcellen cytoplasma (figur 2B og 2G), og til slutt i de fleste ovariekarsinomer, immunoreaktiviteten var høy, og høye SPARC- ekspresjon ble funnet ikke bare i stroma, men også i cytoplasma av eggstokkreft celler (figur 2CDE og 2HIJ). Dessuten ble høy SPARC- uttrykk forbundet med lav differensiering, høy scene og positiv lymfeknute status av ovariekarsinomer (tabell 2 og 3). Resultatene av peptid-blokkerende eksperimenter demonstrerte spesifisiteten av det primære antistoff (figur 3ABCDE). For å evaluere den prognostiske verdien av SPARC i eggstokkreft, utførte vi overlevelsesanalyse ved hjelp av Kaplan-Meier analyse. Resultatet viste at pasienter med høyt SPARC uttrykk hadde en mye dårligere prognose enn de med lav SPARC uttrykk (log rank,
p
= 0,004; figur 3F).
(A) Fotografi av xenografter dissekert fra nakne mus etter 3 måneder subkutan vaksinasjon (n = 5). (B) knockdown av SPARC hemmet tumorvekst in vivo. (C) SPARC- ekspresjon i tumoren som dannes av SPARC- shRNA infiserte celler som målt ved hjelp av IHC-farging (forstørrelse x 200). (D) SPARC- ekspresjon i tumoren som dannes av styre shRNA infiserte celler som målt ved hjelp av IHC-farging (forstørrelse x 200). (E) Fotografi av lungemetastaser under et mikroskop etter 3 måneder vaksinasjon gjennom halevenen (n = 10). * P. 0,05 versus kontroll
knockdown av SPARC Expression av Lentivirus-mediert RNA interferens
For å undersøke hvilken rolle SPARC i eggstokkreft, bygget vi lentivirus vektor med SPARC shRNA og infisert den svært invasive kloning celler (S1 og HO8910PM). De tilsvarende data ble oppnådd i S1 og HO8910PM celler følgende SPARC shRNA virus infeksjoner. Etter viral infeksjon, mer enn 80% celler ble GFP-positive, noe som indikerer en høy virkningsgrad av shRNA levering. Real-time q-RT-PCR, Western Blot og IHC bekreftet nedregulering av SPARC uttrykk ved sin shRNA på både mRNA og proteinnivåer, som vist i Figur 4.
(A) Nedstrøms målgener av SPARC- som målt ved Q-RT-PCR. (B) P53, P21, Cyclin D1, PCNA, Bcl-2 og Bax protein ekspresjon i lentivirus-infiserte celler, som målt ved Western blot. (C) E-cardherin proteinekspresjon i lentivirus-infiserte celler som målt ved hjelp av IHC-farging (forstørrelse x 200). (D) MMP aktivitet målt ved zymografi. * P 0,05 versus kontroll
Knockdown av SPARC Expression Undertrykte eggstokkreft celler spredning
Deretter undersøkte vi effekten av SPARC knockdown på spredning av den svært invasive kloning celler (. S1 og HO8910PM). MTT-resultatene viste at SPARC- knockdown betydelig redusert celleproliferasjon av S1 og HO8910PM celler (Figur 5A). I bløt agar-kolonidannelsesbestemmelsen, S1 og HO8910PM celler infisert med SPARC- shRNA-virus viste signifikant reduksjon i kolonidannelse (figur 5B). Ingen signifikant forskjell ble funnet mellom kontroll shRNA virusinfiserte celler og ikke-infiserte celler.
knockdown av SPARC Expression Induced cellesyklus arrest i G1 /G0 Fase
For å forstå mekanismen som spredning av eggstokkreft celler ble inhibert med knockdown av SPARC- uttrykk, anvendes vi strømningscytometri for å identifisere de spesifikke fasene av cellesyklusen. Som vist i figur 5C, S1 og HO8910PM celler infisert med SPARC- shRNA inneholdt 20~30% flere celler på G1 eller G0 (G1 /G0) fase (
P
0,05) sammenlignet med kontrollen shRNA infisert celler. Disse data indikerte at knockdown av SPARC- ekspresjon hemmet proliferasjonen av eggstokkreft celler ved å blokkere deres progresjon fra G1 /G0 fase til S-fasen i løpet av cellesyklusen.
knockdown av SPARC- Expression indusert Ovarian Cancer celle apoptose
som vist i figur 5D, andelen av apoptotiske celler infisert med SPARC- shRNA var mye høyere enn det i kontroll shRNA gruppe (P 0,05). Ingen signifikant forskjell ble funnet mellom styre shRNA virusinfiserte celler og ikke-infiserte celler. Disse data indikerte at knockdown av SPARC uttrykk indusert eggstokkreft celle apoptose.
knockdown av SPARC Expression hemmet eggstokkreft celler migrasjon og invasjon
Vi har undersøkt effekten av SPARC knockdown på migrasjon og invasjon videre av de svært invasive kloning celler (S1 og HO8910PM). Som vist på figur 5E, knockdown av SPARC- inhiberte eggstokkkreftceller invasjon og migrasjon. De tilsvarende data ble oppnådd i S1 og HO8910PM celler følgende SPARC shRNA virus infeksjoner. Den gjennomsnittlige invaderende eller migrerer legemer av SPARC shRNA infiserte celler var mye mindre enn for kontroll shRNA infiserte celler. Ingen signifikant forskjell ble funnet mellom kontroll shRNA infiserte celler og ikke-infiserte celler.
knockdown av SPARC Expression blokkeres tumorvekst og Lung Metastase i hårløse mus
Svulstdannelse ble utført i S1 kloning smittet av SPARC- shRNA virus i nakne mus. Celler ble inokulert subkutant i nakne mus og tumorvekst ble målt etter 3 måneder. Som vist i figur 6A og B, knockdown av SPARC- viste en reduksjon i størrelsen av tumorer sammenlignet med dets motstykke kontroll. Det var ingen signifikant forskjell mellom kontroll shRNA infiserte celler og ikke-infiserte celler i tumordannelse i nakne mus. Tumorene ble dissekert, fiksert med formalin og innleiret med parafin, da IHC-eksperimenter ble gjort, tumor dannet av SPARC- shRNA infiserte celler viste nedre SPARC- uttrykket (figur 6C), mens tumor som dannes av styre shRNA infiserte celler viste høyere SPARC- uttrykket ( Figur 6D). Videre, figur 6E viser lungemetastase under et mikroskop etter injeksjon av kontroll shRNA infiserte celler og ikke-infiserte celler via halevenen til nakne mus. Omtrent 50% lungemetastaser ble funnet etter 3 måneder i naken mus injisert med kontroll shRNA infiserte celler og ikke-infiserte celler, mens ingen lungemetastaser ble funnet etter injeksjon med SPARC shRNA infiserte celler i nakne mus.
The nedstrøms målgener av SPARC i påvirker ovarian Cancer Cell Proliferation, apoptose og Invasion
for å forstå mekanismen av SPARC i eggstokkreft spredning, apoptose og invasjonen, ble real-time kvantitativ RT-PCR brukes til å oppdage de ulike uttrykkene av E-cadherin, β-catenin, alfa-catenin, integrin β3, integrin β1, ILK, FAK, P53, P21, Cyclin D1, PCNA, Bcl-2, Bax, u-PA, uPAR, PAI-1, MMP2, MMP9, TIMP1 og TIMP2 mellom SPARC shRNA smittet S1 kloning celler og kontroll shRNA smittet S1 kloning celler. Som vist i figur 7A, Cyclin D1, PCNA, Bcl-2, MMP2 og MMP9 var signifikant nedregulert i SPARC- shRNA infiserte celler. Dessuten ble høyere uttrykk nivåer av E-cadherin, P53, P21 og Bax funnet i SPARC shRNA infiserte celler. Det var ingen signifikante forskjeller i uttrykk av β-catenin, α-catenin, inte β3, inte β1, ILK, FAK, u-PA, PAI-1, uPAR, TIMP1 og TIMP2 mellom SPARC shRNA infiserte celler og kontroll shRNA infiserte celler . Resultatene av flowcytometri analyse (tabell 4) og western blot (figur 7B) bekreftet at E-cadherin P53, P21 og Bax var oppregulert og cyclin D1, PCNA og BCL-2 ble nedregulert i SPARC shRNA infiserte celler. IHC eksperimenter viste at ekspresjon av E-cadherin økte i cytomembrane av SPARC- shRNA infiserte celler (figur 7C). Zymografi Resultatene viste at MMP aktivitetene ble betydelig redusert i SPARC shRNA infiserte celler (figur 7D).
Diskusjoner
I denne studien, ved hjelp av genom-wide transkripsjonen profilering, identifiserte vi at SPARC ble overexpressed i svært invasiv SKOV3 kloning sammenlignet med lav invasiv kloning. Videre analyser av SPARC uttrykk i 140 menneskelige eggstokkene vev avdekket at SPARC ble overuttrykt i maligne ovarietumorer og forbundet med dårlig clinicopathologic funksjoner. Disse resultatene antyder at SPARC- kan spille en viktig rolle i utviklingen av kreft i eggstokkene. Med antistoffet AON-5031, ble lignende resultater observert i 8 normale eggstokk-vev og 24 humane invasive eggstokk-kreft [13], og 14 normale eggstokk-vev og 48 eggstokk-kreft [14]. De fant at SPARC var oppregulert i reaktiv stroma assosiert med invasiv kreft i eggstokkene. I vår studie, med antistoffet AF941 og bs-1133R, fant vi at immunoreaktivitets av SPARC ble forsterket, ikke bare i stroma, men også i cytoplasma av eggstokkreft celler. I kontrast, med antistoffet LF-54, en annen studie viste at SPARC- ekspresjon nedregulert i ovarialkreft; eksogene SPARC hemmet spredning og induserer apoptose i eggstokkreft celler [21]. Men i vår studie, med lentivirus-mediert RNA interferens, fant vi at knockdown av SPARC uttrykk trykt celleproliferasjon, indusert celle apoptose, og hemmet celle invasjon og metastasering i eggstokkreft celler. Lignende resultater ble også funnet i magekreftceller [26], glioma-celler [27] og melanomceller [28], ved RNA-interferens. I vår forskning, fant vi at SPARC ikke bare ble utskilt av stroma men også utskilt av eggstokkreft celler og kan gi viktige intracellulære effekter på disse cellene. Knockdown av SPARC- kan inhibere ovarial cancer cellevekst og invasjon. Vi fant at SPARC- diffundert fra stroma til kreft domener. I denne prosessen kan SPARC- spille en rolle i å fremme invasjon og metastasering av eggstokkreft. De inkonsistente resultater om SPARC uttrykk i eggstokkene vev kan skyldes de ulike SPARC antistoffer som brukes i disse undersøkelsene. I konklusjonen, funksjoner av SPARC i eggstokkreft trenger videre studier.
I denne studien, ved hjelp av MTT-analyse og myk agar-kolonidannelse analysen konkluderte vi med at knockdown av SPARC trykt eggstokkreft celleproliferasjon. Strømningscytometer viste at knockdown av SPARC- redusert antall celler i S-fasen, mens øket antall celler i G1 /G0-fasen, noe som indikerer G1 /G0 arrest. For å forstå mekanismen for SPARC- i eggstokkreft spredning, vi oppdaget de forskjellige uttrykk for Cyclin D1, PCNA, P53 og P21 mellom SPARC- shRNA infiserte celler og kontroll shRNA infiserte celler.
Cyclin D1, et medlem av G1 sykliner og PCNA (prolifererende cell nuclear antigen) blir ofte brukt for å vurdere tumorcelle-proliferasjon [29], [30]. P53, en tumor suppressor gen, og P21 (cyclin-avhengig kinase inhibitor), en viktig formidler av p53 kan indusere cellesyklus arrest i G1-S sjekkpunkt [31], [32].
