Abstract
Thyroid hormon reseptor beta (
THRB
) genet er ofte deregulert i kreft, og som styrket av dyremodeller, postulert å spille en tumorundertrykkende rolle. Våre tidligere studier viste nedregulering av
THRB
i klarcellet nyrecellekarsinom (ccRCC), men skyldig mekanismene er ikke fullstendig klarlagt. Siden epigenetisk regulering er en felles mekanisme som påvirker uttrykket av tumor suppressors, hypotese vi at nedregulering av
THRB
i nyrekreft resultater fra epigenetiske aberrances, inkludert CpG metylering og mikroRNA avhengig demping. Vår studie viste at ccRCC svulster viste en 56% reduksjon i
THRB Hotell og en 37% økning i DNA metyltransferase 1 (DNMT1) uttrykk sammenlignet med sammenkoblede røyk neoplastiske kontrollprøver. Men
THRB
CpG metylering analyse utført ved hjelp BSP, stillbilde og MSP-PCR konsekvent viste ingen endringer i metylering mønstre mellom matchet tumor og kontrollprøver.
I silico
analyse resulterte i identifisering av fire microRNAs (MIR-155, MIR-425, MIR-592, og MIR-599) som potensielt målretting
THRB
transkripsjon. Luciferase assay viste direkte binding av MIR-155 og MIR-425 til 3’UTR av
THRB, etter og påfølgende in vivo analyser viste at transfeksjon av UOK171 cellelinje med syntetisk Mir-155 eller MIR-425 resulterte i redusert uttrykk for endogen
TRHB
med 22% og 64%, henholdsvis. Til slutt, real-time PCR-analyse viste signifikant oppregulering av MIR-155 (354%) og Mir-425 (162%) i ccRCC sammenlignet med matchede kontroller. Videre mikroRNA nivåene var negativt korrelert med mengden av
THRB
avskrift i vevsprøver. Vi konkluderer med at CpG metylering er ikke den viktigste mekanismen som bidrar til redusert
THRB
uttrykk i ccRCC. I kontrast,
THRB
er målrettet av microRNAs MIR-155 og MIR-425, som har økt uttrykk kan være ansvarlig for nedregulering av
THRB
i ccRCC svulster
Citation.: Wojcicka A, Piekielko-Witkowska A, Kedzierska H, Rybicka B, Poplawski P, Boguslawska J et al. (2014) epigenetisk regulering av skjoldbruskkjertel hormon reseptor Beta i nyre kreft. PLoS ONE 9 (5): e97624. doi: 10,1371 /journal.pone.0097624
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, Spania
mottatt: 18 desember 2013; Godkjent: 23 april 2014; Publisert: 21. mai 2014
Copyright: © 2014 Wojcicka et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet av National Science Centre gir NN401611940 og NN401047638 (til AN), UNESCO /FEBS Samarbeids Experimental stipend for Central Øst-Europa, 2010 (til AW), og National Science Centre Grant 2012/05 /B /NZ5 /01541 (til APW). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Thyroid hormonreseptorer (TRS): TRα og TRβ, er ligand (3,5,3′-trijodtyronin, T3) -inducible transkripsjonsfaktorer som formidler de cellulære virkningene av skjoldbrusk hormoner, nemlig sin aktive form – T3 . Siden T3 avhengige gener som omfatter en rekke viktige regulatorer av cellesyklusen, slik som MDM2, p53 og retinoblastom [1], [2], handlingene til TR-bidra til opprettholdelse av viktige cellulære prosesser som proliferasjon, differensiering, apoptose og metabolisme [3]. TR inkluderer 3 funksjonelle proteiner: TRα1, TRβ1 og TRβ2, kodet av
URINRØRETS Hotell og
THRB
gener. TRα1 og TRβ1 reseptorer er uttrykt i nesten alle vev, men deres ekspresjonsnivåer og funksjonalitet er avhengig av celletype og utviklingsstadium av en organisme. Disturbed aktivitet av TR, som følge av aberrances i uttrykk eller sekvenser av gener som koder for TR er et vanlig fenomen i kreft hos mennesker. Det fører til forstyrret ekspresjon av T3-avhengige gener og, følgelig, til alvorlig svekkelse i cellulær homeostase. Disse observasjonene har ført til hypotesen på tumorundertrykkende rolle TRβ, ytterligere bekreftet i flere elegante studier utført på cellelinjer og musemodeller [4], [5].
En av kreft der aberrances i TRβ funksjon ofte observert, er den vanligste typen av nyresvulster – klarcellet nyrecellekarsinom (ccRCC). Mest interessant,
THRB
genet ligger innenfor 3p21-25 kromosom regionen, kjent som en hot spot for mutasjoner i gener som er involvert i ccRCC patogenesen [6]. De skyldig mekanismer identifisert så langt inkluderer mutasjoner, avvikende uttrykk og deregulert spleising [7], [8], [9].
Det er vist at ccRCC er ledsaget av epigenetiske aberrances som kan direkte bidra til tumorigent prosess , som virker ved tidlig og forstadier fase av flertrinns renal tumorigenesis [10]. Mange nyere studier indikerer at epigenetisk deregulering er blant hovedårsakene til sporet av handlingene til kreftdempere i kreft, og de fleste ofte identifisert mekanismer omfatter DNA metylering og microRNAs. DNA-metylering består i addisjon av en metylgruppe til et av de foregående cytosin guanin (CpG) i DNA-sekvensen, og katalyseres av DNA metyltransferaser (DNMTs): DNMT1, DNMT3A og DNMT3B. DNMT3A og DNMT3B er
de novo
metyltransferaser, uttrykt prevalently i tidlige stadier av utvikling [11] som opprettholde foreldre metylering mønstre. DNMT1 er referert til som den vedlikehold metyltransferase, som den er ansvarlig for å opprettholde metylering mønstre under DNA-replikasjonen [12]. Aberrant metylering i kreft er forårsaket av svekket ekspresjon og funksjon av DNMTs. Kreftceller vanligvis viser samlede genom hypometylering, som fører til mikro ustabilitet og aktivering av gener involvert i metastatisk endringer [13], [14]. Samtidig alvorlig hypermethylation av regulatoriske regioner av kreft supressors, DNA-reparasjon og cellesyklus kontrollgener fører til progresjon av kreft [15]. For ccRCC ble det vist at en rekke tilfeller av downregulated uttrykk for VHL tumor suppressor, inaktiverte i ca. 50% av ccRCC pasientene, er et resultat av hypermethylation av genets promoter [16].
microRNAs (mirnas) er korte RNA som hemmer uttrykk for proteinkodende gener ved å binde seg til komplementære sekvenser i 3’UTRs (uoversatt regioner ) av sine vitnemål. Sekvensen er ansvarlig for denne gjenkjennelse omfatter nukleotidene 2-8 av en miRNA og må være fullstendig komplementær til target-sekvensen på mRNA [17]. Mange kreftfremvise avvikende uttrykk for microRNAs, som fører til alvorlige endringer i transkriptomet og proteomet av en kreftcelle. For ccRCC, ble vist en rekke microRNAs skal dereguleres i tumor [18] – [21]. Både DNA metylering og mikroRNA -avhengig regulering har nylig brakt oppmerksomhet som to mekanisme med størst potensial for mulige terapeutiske intervensjoner [22]. Det ble vist at tumorsuppressorgener, forstummet grunn av DNA hypermethylation, kan aktiveres med demethylating agenter. Videre er mikroRNA ligner og hemmere for tiden evaluert som terapeutiske molekyler som viser løftet i personlig kreft medisin [23].
Rollen epigenetiske forandringer i
THRB
forstyrrelser i kreft har blitt undersøkt i en få studier. Den potensielle rolle mikroRNA avhengig regulering i
THRB
lyddemping ble foreslått for ccRCC [9] og bevist for papillær skjoldbruskkreft [24]. Flere andre studier antydet DNA hypermethylation som en mekanisme som bidrar til
THRB
lyddemping i leukemi og kreft i bryst, lunge, og skjoldbrusk [25] – [30]
Disse studier samt hyppig. epigenetiske dereguleringer observert i ccRCC [31], bedt oss om å analysere mulige konsekvenser av DNA metylering og mikroRNA avhengig regulering på
THRB
uttrykk i nyrekreft.
Materialer og Metoder
Materiell
Vevsprøver ble oppnådd med tillatelse fra bioetikkomité for Senter for Postgraduate Medical Education i Warszawa fra pasienter med klarcellet nyrecellekarsinom (ccRCC) (tabell S1). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter. Prøvene ble delt i to grupper: kreftvev (n = 35, T) og kontroll vev (sammenkoblet normalt vev fra den motsatte pol av den ondartede nyre (mer enn 5 cm fra tumor) med ingen histologiske tegn på svulst; n = 35 , C). ccRCC ble diagnostisert med histologi i henhold til WHO-kriterier [32]
Følgende cellelinjer ble brukt i studien. 1) HK-2 (ATCC nr .: CRL-2190), hentet en proksimal tubulær cellelinje fra normal nyre, udødeliggjort av transduksjon med humant papilloma virus 16 (HPV-16) E6 /E7 gener. 2) UOK171 (UOB Tumor Cell linje Repository, levert av Dr. W Marston Linehan, NIH, NCI, Bethesda, USA, patent E-033-2010 /0): avledet fra IV scenen ccRCC svulst, spontant udødeliggjort. 3) HeLa (ATTC nr CCL-cervix adenokarsinom. Alle cellelinjer ble dyrket i henhold til leverandørens anvisninger.
Real-time PCR
RNA ble isolert og revers transkribert som beskrevet tidligere [33]. 200 ng av RNA ble brukt for revers transkripsjon real-time PCR ble utført som beskrevet tidligere [33] med primere spesifikke for utskrifter av
THRB plakater (THRB-RT-F. GAACAGTCGTCGCCACATC og THRB-RT-R: GCTCGTCCTTGTCTAAGTAAC) og
DNMT1 plakater (DNMT1-RT-F: TTATCCGAGGAGGGCTAC og DNMT1-RT-R. GGCTTCACTTCTTGCTTG) Revers transkripsjon og real-time PCR av microRNAs ble utført som beskrevet tidligere [34] med Taq-mann sonder spesifikk for HSA-MIR-155 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA, kat. nr. 002623) og HSA-MIR-425 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA, kat. nr. 001516). Relativ kvantifisering av hvert uttrykt miRNA ble beregnet ved hjelp av standard to-ΔCt metode forening mellom mikroRNA og
THRB
ekspresjon i vevsprøver ble beregnet ved å bruke R miljø [35] og det multiple korrelasjonsanalyse i henhold til formelen:.
5-aza-2’deoxycytidine behandling
UOK-171-celler ble sådd ut på 12-brønners plater (Corning, NY, USA) i en mengde av 5 x 10∧4 per brønn. Cellene ble dyrket 24 timer under standardbetingelser, etterfulgt av tilsetning av 100 mM eller 10 mM 5-aza-2’deoxycytidine (5-aza-dC) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Etter 24 timer ble cellene vasket med PBS og brukes for RNA isolering.
Analyse av
THRB
Metylering
For metylering analyse, brukte vi sekvensen av tidligere utgitt
THRB
promoter [36], GenBank Acc. Nei. S37458.1), oppdatert i henhold til sekvensen av kromosom 3 genomisk contig (GenBank Acc. Nr. NT_022517.18). På grunn av disconcordance mellom de to avsatt sekvenser, vi klonet og direkte sekvensert DNA region som omfatter
THRB
promoter.
For å oppnå dette, genomisk DNA ble isolert fra et ikke-tumorous nyre prøven som beskrevet tidligere [37]. Regionen inneholder
THRB
arrangøren ble forsterket ved hjelp av primere THRB-HindIII-PromU (CGTAAAGCTTCATATGGGTAACACTGAGGGCATAGC) og THRB-HindIII-PromL (CGTAAAGCTTACTCCTTGGGCGAAGAGAGGC) og Hot Start-Perpetual OptiTaq (EURx, Gdansk, Polen), på følgende vilkår: . 95 ° C-10 min, 5 sykluser: [96 ° C-35 s, 62 ° C-30 s, 73 ° C-80 s], 40 sykluser: [96 ° C-40 s, 59 ° C-30 s, 72 ° C-80 s], slutt forlengelse: 72 ° C, 10 min. Det oppnådde PCR-produktet ble klonet inn i pGEM-T-vektor (Promega, Madison, WI, USA) og sekvensert. Den oppnådde sekvens ble avsatt i GenBank (Acc no. KF669869).
For å identifisere CpG øyer, vi ansatt
i silico
analyse ved hjelp av CpG Plot [38] og CpG Island Searcher [39], CpG rike regionen ble oppdaget i en sekvens som omfatter promoter og 5 «UTR (ekson 1) av TRβ karakterutskriften.
for å analysere metylering av
THRB
CpG øyer, 800 ng av genomisk DNA var bisulfitt-omregnes Imprint DNA Modification Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i henhold til manufecturer instruksjoner. Å forutsi nucleotide endringer som følge av bisulfitt konvertering,
THRB
sekvensen var
i silico
omregnes Snake sjarmtroll (https://insilico.ehu.es/restriction/two_seq/snake_charmer.html) og brukes for design av primere.
for å utføre Bisulfite-sekvensering PCR (BSP), 100 ng av bisulfitt-konverterte DNA ble brukt, sammen med Perpetual Taq HOT START (EURx, Gdansk, Polen) polymerase og primere gitt i tabell S2, på følgende vilkår: innledende denaturering: 95 ° C, 10 min, 38 sykluser: [denaturering: 95 ° C-15 s, avspenning: 56 ° C eller 57 ° C-15 s, forlengelse: 68 ° C -30 s], endelig bruddforlengelse: 75 ° C, 15 min, sluttinkuberings: 4 ° C. Glødetemperaturen varierte fra 56 ° C til 67 ° C, avhengig av de benyttede primere (tabell S2). De oppnådde PCR produktene ble direkte sekvensert av en kommersiell tjeneste (Genomed, Warszawa, Polen).
Metylering spesifikke PCR (MSP-PCR) ble utført som beskrevet tidligere [26]. Sekvensene av primere er gitt i tabell S3.
Snapshot analyse ble utført med fotografering Multiplex Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) og primere gitt i tabell S3 i henhold til produsentens instruksjoner. Produktene ble analysert av en kommersiell tjeneste (Biote21, Krakow, Polen).
Spesifisiteten av primere som brukes for metylering analyse ble analysert ved hjelp MethPrimer [40].
Analyse av microRNAs målretting
THRB
transkripsjon
microRNAs potensielt bindende
THRB
3’UTR ble beregnet med miRecords og DIANA-mirPath [41], [42] (tabell S4). Deretter PubMed ble søkt å finne informasjon på uttrykk for den anslåtte microRNAs i ccRCC. Bare microRNAs med både rapportert økt uttrykk i nyresvulster og potensielt rettet mot
THRB
transkripsjon ble tatt for videre analyse.
For å analysere effekten av microRNAs på urfolk
THRB
uttrykk , UOK171 celler ble sådd ut på 12-brønners plater (Corning, NY, USA) ved anvendelse av 5 x 10∧4 celler pr brønn og transfekteres 24 timer senere. Transfeksjon blanding ble fremstilt som følger: 1) 2 ul Lipofectamine 2000 (Invitrogen /Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) ble blandet med 125 ul Opti-MEM (Gibco /Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), og 2) 50 pmol mikroRNA etterligner eller hemmere (Ambion /Life Technologies, Foster City, CA, USA, tabell S5) ble blandet med 125 ul Opti-MEM. Etter 10 minutters inkubasjon ved romtemperatur ble oppløsningene slått sammen, inkubert i ytterligere 10 minutter, og tilsettes til brønnene. Etter 6 timers transfeksjon blandinger ble erstattet med fullstendig medium. Etter 24 timer ble cellene høstet for RNA-isolering.
For luciferase reporter-analyser, HeLa ble valgt på grunn av lav endogen ekspresjon av microRNAs (figur S1). Cellene ble sådd ut på 12-brønners plater (Corning, NY, USA) ved anvendelse av 5 x 10∧4 celler pr brønn og transfekteres 24 timer senere. Transfeksjon blanding ble fremstilt som følger: 1) 4 ul PEI 1 ug /ul (polyetylenimin, Polysciences, Warrington, PA, USA) ble blandet med 125 ul Opti-Mem, og 2) 1 ug pGL3-luc-3’UTR-THRB plasmid (Jazdzewski et al., 2011) ble blandet med 125 ul Opti-Mem. For referanse plasmid ble følgende blandinger fremstilt: 1) 2 ul PEI med 62,5 mL Opti-Mem, og 2) 100 ng PRL-TK plasmid (Promega, Madison, WI, USA) med 62,5 mL Opti-Mem. Etter 20 minutters inkubasjon ved romtemperatur ble oppløsningene slått sammen, inkubert i ytterligere 20 minutter og tilsatt til kulturbrønnene inneholdende 700 ul medium uten FBS. Etter 6 timer, ble mediet erstattet med transfeksjon blandinger inneholdende mikroRNA mimics- fremstilt som beskrevet ovenfor. Informasjon om mikroRNA etterligner og inhibitorer er gitt i tabell S5. Etter 6 timer ble transfeksjon blandinger erstattet med fullstendig medium; Cellene ble lysert etter 24 timer og analysert i Dual luciferaserapportørplasmid Assay (Promega, Madison, WI, USA) ved hjelp av Synergy 2 luminometer (BioTek, Winooski, VT, USA).
Resultater
The uttrykk for
THRB Hotell og
DNMT1
endres ved nedsatt Cancer
real-time PCR-analyse utført på ccRCC og paret ikke-tumorkontrollprøver viste signifikante endringer i
THRB
mRNA uttrykk (figur 1). Uttrykket av
THRB
ble redusert med 56% (p 0,0001) i tumor sammenlignet med kontrollprøver. Denne reduksjonen av uttrykket ble funnet i 32 ut av 35 (91,4%) analysert parede prøver.
A.
THRB Hotell og
DNMT1
mRNA uttrykk i vevsprøver: ikke-tumorkontroll (C, n = 35) og sammenkoblede ccRCC prøver (T, n = 35). Dataene er vist som prosent av kontroll (C). Sanntids-PCR for hver prøve ble utført in triplo. Statistisk analyse ble utført ved anvendelse av Wilcoxon samsvarende par-testen. **** P 0,0001. B. uttrykk for
THRB Hotell og
DNMT1
mRNA i cellelinjer: HK2: proksimale tubulære cellelinje avledet fra normal nyre, UOK171: ccRCC cellelinje avledet fra IV stadium svulst, spontant udødeliggjort. Tomtene vise resultater av fem uavhengige biologiske eksperimenter, målt i tre paralleller. Statistisk analyse ble utført under anvendelse av t-test. ** P. 0,01
Real-time PCR-analyse utført på cDNA fra nyrecellelinjer bekreftet redusert uttrykk for
THRB
i nyrekreft.
THRB
ekspresjon var 63% (p = 0,0036) lavere i ccRCC UOK171 cellelinje sammenlignet med ikke-kreft HK2-celler (figur 1).
Tidligere studier analysere ekspresjon av DNA-metyltransferase 1 (DNMT1) hos nyrekreft brakte motstridende resultater [43] – [45]. Derfor bestemte vi oss for å analysere
DNMT1
uttrykk i vår studie. DNMT1 mRNA nivåene ble øket i 22 ut av 35 analyserte ccRCC prøvene sammenlignet med parvise kontroller (figur 1). Gjennomsnittlig DNMT1 uttrykk i tumorvev ble økt med 38% sammenlignet med sammenkoblede kontroll vevsprøver (p = 0,0098). I cellelinjer, ble DNMT1 ekspresjon økte med 27% i UOK171 sammenlignet med ikke-tumor HK2 cellelinje (p = 0,0059).
Disse resultatene antydet at økt
DNMT1
nivåer i prøvene ccRCC kan muligens føre til forhøyet CpG metylering fører til nedregulering av
THRB
uttrykk.
Analyse av
THRB
CpG metylering i nyre kreft
for å sjekke om redusert
THRB
ekspresjon kan resultere fra CpG hypermethylation, UOK171 celler ble dyrket i nærvær eller fravær av DNMT1 inhibitor, 5-aza-dC. Behandling med 5-aza-dC førte til en statistisk signifikant (p = 0,0124), 37% økning av
THRB
ekspresjon sammenlignet med kontroll, ubehandlede celler (figur 2A).
A. Effekten av 5-aza-2 «deoksycytidin (5-aza-dC) på
THRB
mRNA-ekspresjon i UOK171 cellelinje. Resultatene er vist som prosent av kontrollen (celler dyrket uten 5-aza-dC tilskudd). Plottet viser resultater fra tre uavhengige biologiske eksperimenter, målt i tre paralleller. Statistisk analyse ble utført under anvendelse av t-test. * P 0,05. B. Sekvensen av
THRB
gen med promotorområdet (GenBank Acc.no. KF669869). CpG island, som omfatter arrangøren og en
st ekson (region -873 til 355) er skygge blå. TATA-boksen er uthevet. CpG dinukleotider blir skygget grått. Små bokstaver angir en
st exon av TRβ karakterutskriften. C. Representant elektro analyse av MSP-PCR. U: PCR produktene oppnådd med primere som er spesifikke for unmethylated rekkefølge; M: PCR produktene oppnådd med primere som er spesifikke for metylert sekvens. C: kontrollprøver, T:. Tumorprøver
For å avgjøre om restaurering av
THRB
uttrykk i nyrekreft er direkte regulert av arrangøren metylering,
THRB
sekvenser ble analysert ved hjelp av CpG Plot og CpG Island Searcher. Begge programmene spådd en CpG rike region innenfor arrangøren og 5’UTR av
THRB
genet, som omfatter nukleotider -873 til 355 (figur 2B). Deretter ble forutsagt region analysert ved anvendelse av bisulfitt-sekvensering av PCR (BSP). For å oppnå dette, DNA-prøver fra 15 par av ccRCC vev og tilsvarende ikke-tumorkontroll nyreprøver ble bisulfitt-konvertert og direkte sekvensert. Effektiv bisulfitt konverteringen ble bekreftet i PCR reaksjoner med bruk av primere utformet for å målrette innfødte
THRB
arrangøren og ikke forsterke bisulfitt-konverterte DNA. Kontroll amplifikasjonsreaksjoner utføres på bisulfitt konvertert DNA produserte ingen amplifikasjonsprodukt (kontroll primersekvenser er gitt i Tabell S2). Denne analysen avslørte mangel på forskjeller i metylering mønstre mellom sammenkoblede kontroll- og tumorprøver fra samme pasient (Figur S2). For å kontrollere resultatene av BSP, bisulfitt omdannet DNA var i tillegg analysert med fotografering og MSP-PCR, en svært sensitiv metode som åpner for påvisning av 0,1% denaturert alleler av et gitt CpG island locus [46] (figur 2C). Disse analysene bekreftet at det var ingen endringer i CpG metylering mønstre i ccRCC prøvene sammenlignet med sammenkoblede kontrollprøver. Interessant, MSP-PCR resultatene antydet at metylering mønstre varierte mellom ulike pasienter, blir heller pasientspesifikk enn påvirket av sykdomsstatus.
I konklusjonen, disse resultatene antydet at selv om endringer i DNMT1 aktivitet kan bidra til endringer av
THRB
uttrykk i cellekulturer, forstyrret uttrykk for
THRB
i ccRCC vevsprøver er heller ikke et resultat av avvikende, tumor-spesifikke hypermethylation av genets promoter.
microRNAs MIR-155 og MIR-425 Direkte Target
THRB
3’UTR
å forutsi microRNAs potensielt påvirke
THRB
uttrykk i nyrekreft, ble to-trinns analyse utført. For det første, bioinformatiske analyse ved hjelp miRecords (en ressurs som kombinerer 11 bioinformatiske programmer) og Diana-mirPath spådd nesten 600 microRNAs potensielt målretting
THRB
3’UTR. Men basert på antagelsen om at stanse effektivitet er den høyeste for microRNAs som ligger innenfor den nærmeste nærhet til hver ende av 3’UTR [47] vi spesielt fokusert på microRNAs som overholdt denne regelen. Påfølgende søk i PubMed tillatt for valg av microRNAs som ble rapportert som overexpressed i nyrekreft [18] – [21]. Bruk av to-trinns tilnærming, fire microRNAs (MIR-155, MIR-425, MIR-592, og MIR-599) ble valgt ut for videre analyse.
For å finne ut om de valgte microRNAs faktisk binde 3’UTR av
THRB
, HeLa-celler ble transfektert bruke syntetiske microRNAs og en reporter konstruere pGL3-luc-3’UTR-
THRB plakater (figur 3). HeLa-celler ble valgt for denne analysen på grunn av lav endogen uttrykk for
THRB Kjøpe og analysert microRNAs. Transfeksjon av celler med forhånds MIR-155 eller pre-MIR-425 resulterte i 32% eller 17% reduksjon av luciferase-aktivitet, respektivt, når sammenlignet med kontroll miRNA etterligner (p 0,001). Ingen endringer ble observert i luciferase aktivitet i celler transfektert med pre-MIR-592 eller pre-MIR-599. Pre-MIR-221, som tidligere er rapportert å målrette
THRB
3’UTR [25] ble anvendt som positiv kontroll og bekreftet effektiviteten av miRNA-mediert stanse (figur 3).
A. Effekten av mikroRNA ligner på aktiviteten av luciferase uttrykt fra en reporter plasmid pGL3-luc-3’UTR-THRB. HeLa-celler ble transfektert med reporter plasmid og respektive mikroRNA ligner: pre-MIR-155, pre-MIR-425, pre-MIR-599, eller pre-MIR-221. Resultatene er vist som prosent av kontroll (Ctrl, celler transfektert med ikke-målsøkende pre-MIR). Plottet viser resultater fra tre uavhengige biologiske eksperimenter, målt i tre paralleller. Den relative aktivitet av ildflueluciferase ble normalisert til Renilla luciferase-aktivitet. Statistisk analyse ble utført ved anvendelse av ANOVA etterfulgt av Dunnetfs multiple sammenligningstest. *** P 0,001. B. Effekten av MIR-155 og MIR-425 på endogen
THRB
uttrykk i nyrekreftceller. UOK171 celler ble transfektert ved hjelp av respektive mikroRNA ligner (pre-Mirs) eller hemmere (anti-Mirs), og
THRB
mRNA uttrykk ble analysert ved hjelp av real-time PCR. Resultatene er vist som prosent av kontrollen (celler transfektert med ikke-målsøkende pre-MIR). Tomtene viser resultatet av tre uavhengige biologiske eksperimenter målt i tre paralleller. Statistisk analyse ble utført ved anvendelse av ANOVA etterfulgt av Dunnetfs multiple sammenligningstest. * P 0,05, *** p 0,001. C. uttrykk for MIR-155 og MIR-425 i nontumorous kontroller (C, n = 35) og paret ccRCC vevsprøver (T, n = 35). Resultatene er vist som prosent av kontroll. Sanntids-PCR for hver prøve ble utført in triplo. Statistisk analyse ble utført ved anvendelse av Wilcoxon samsvarende par-testen. * P 0,05, ** p 0,01
MIR-155 og MIR-452 Influence
THRB
uttrykk på nyre kreft celler
For deretter å analysere. effekten av MIR-155 og MIR-425 på endogen
THRB
uttrykk, nyrekreft-avledet UOK171 cellelinjen ble transfektert med enten mikroRNA ligner (pre-MIR-155 eller pre-MIR-425) eller mikroRNA-hemmere ( anti-MIR-155 eller anti-MIR-425) (figur 3). Transfeksjon resulterte i en statistisk signifikant reduksjon i
THRB
uttrykk med 22% for pre-MIR-155, p 0,05, og med 64% for pre-MIR-425, p 0,001, sammenlignet med kontroll mikroRNA (figur 3). Transfeksjon av cellelinjer med mikroRNA inhibitorer ikke resulterte i en signifikant endring av
THRB
ekspresjon, selv om en trend for øket ekspresjon ble observert (figur 3). Denne observasjonen kan resultere fra det faktum at nivået av MIR-155 og MIR-425 er svært forhøyet i UOK171 cellelinje, således til tross for en rekke konsentrasjoner ble testet, kunne mengden av mikroRNA inhibitorer være utilstrekkelig for effektiv blokkering av mikroRNA aktivitet.
Disse studiene antydet at MIR-155 og MIR-425 direkte påvirke
THRB
uttrykk i nyrekreftceller.
The Expression of MIR-155 og MIR-425 er forhøyet i nyre kreft og korrelerer med redusert uttrykk for
THRB
for å sjekke om tumor-spesifikke endringer av MIR-155 og MIR-425 kan påvirke
THRB
uttrykk i ccRCC svulster, ekspresjonen av begge microRNAs ble analysert i 25 ccRCC vevsprøver og 25 tilsvarende ikke-tumornyreprøver (figur 3). Ekspresjonen av både microRNAs var statistisk signifikant økning (ved 354%, p = 0,0072 for MIR-155 og med 62%, p = 0,041 for MIR-425). Samtidig uttrykk for både Mirs var negativt korrelert med uttrykk av
THRB
. Selv om korrelasjonskoeffisient var svak (R = 0,245, p = 0,0075) i kontrollprøvene, sammenhengen var betydelig sterkere i tumorer (R = 0,469, p = 0,0225). Samtidig, det var også en signifikant sammenheng mellom T /N-forhold på miRNA og
THRB
uttrykk (R = 0,396, p = 0,002). Disse resultatene indikerer at
THRB
uttrykk nivåer avhengig av MIR-155 og Mir-425 uttrykk og deregulering av Mirs er forbundet med senket
THRB
nivåer i ccRCC (figur S3).
Diskusjoner
i denne studien, ved hjelp av tre forskjellige metoder, viste vi at i de analyserte prøvene av nedsatt kreft avvikende
THRB
uttrykk resulterer ikke fra tumor-spesifikke endringer i DNA metylering av
THRB
promoter-regionen. Snarere uttrykk for
THRB
i ccRCC påvirkes av microRNAs, MIR-155 og MIR-425 som direkte binder til
THRB
3’UTR, som foreslått av den observasjon at forhøyet uttrykk for disse microRNAs i ccRCC er ledsaget av nedregulering av
THRB
.
Hypermethylation av
THRB
promoter ble rapportert i flere svulster, inkludert bryst, skjoldbruskkjertelen og lunge kreft og leukemi [25 ] – [30]. Interessant, studier viste at metylering forekomst av
THRB
var svært variabel blant pasientene, siden hypermethylated
THRB
ble påvist i 25-80% av analyserte svulster. Videre ble bare halvparten av studiene på
THRB
metylering utført på både svulsten og paret ikke-tumorkontroll vev. Iwasaki et al. undersøkte 116 ikke-småcellet lungekreft, inkludert 6 prøver for som paret tilstøtende kontroll vev ble analysert. Ut av de 116 tumorprøver, 54 avslørte hypermethylation av
THRB
. Når seks sammenkoblede tumor mot kontrollprøvene ble sammenlignet,
THRB
ble metylert i alle svulster og unmethylated i alle ikke-tumorous kontrollprøver. I to andre studier som analyserer brystkreftsvulster og cellelinjer [25], [29] hypermethylated
THRB
ble påvist i 80% -100% av svulster og CA. 37% av parede prøver. Videre er graden og mønsteret av metylering varierte mellom prøver fra forskjellige pasienter. Ligner interindividuelle variasjoner ble også observert i en studie utført på skjoldbruskkjertelen svulster [30], der paret normale vevsprøver ikke var tilgjengelig, og derfor ikke analysert. Vår studie viser også at
THRB
metylering betydelig variert mellom vevsprøver avledet fra forskjellige pasienter. Disse resultatene tyder på at mangel på sammenkoblede røyk tumorous kontrollprøver kan føre til en skjevhet og fører til klassifisering av en pasient-spesifikke variasjoner i
THRB
metylering endringer spesifikke for kreft vev.
Selv om
THRB
uttrykk synes ikke å bli påvirket av DNA metylering i våre nyrekreftprøver, behandling av UOK171 cellelinje med 5-aza-2 «deoxycytidine resultert i økt uttrykk av
THRB
genet. Dette tyder på at
THRB
uttrykk kan bli indirekte påvirket av DNMT1 aktivitet. I henhold til tidligere studier, kan DNA-metylering indirekte påvirke transkripsjon av et målgen i flere mekanismer [48] inkludert genregulering ved en reaktivert transkripsjonsfaktor eller signaltransduksjonsbane som påvirkes av DNA-metylering. Hvilke av disse mekanismene kan påvirke
THRB
uttrykk i nyrekreft er foreløpig ukjent. Videre kan vi ikke utelukke at andre ccRCC pasienter og i de andre ccRCC-avledet cellelinjer,
THRB
arrangøren metylering kan påvirke
THRB
uttrykk. Dette, forhåpentligvis, vil bli verifisert av fremtidige studier på ccRCC.
En annen epigenetisk mekanisme som påvirker uttrykket av målgener er mikroRNA avhengig regulering av uttrykk [49]. En enkelt gen kan bli målrettet av flere microRNAs og enkelt mikroRNA kan regulere mange målgener. Som følge av deregulering av miRNA uttrykk som er forbundet med en rekke kreftformer fører til en alvorlig forstyrrelse av den cellulære proteomet og transkriptom. I denne studien identifiserte vi to microRNAs som direkte binding med
THRB
3’UTR ble bekreftet i luciferase assay utført i HeLa cellelinje, som brukes på grunn av relativt lave nivåer av både analysert miRNAs.
